Báo cáo Tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài : Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản

Bộ khoa học và công nghệ Viện ứng dụng Công nghệ Trung tâm sinh học thực nghiệm C6 Thanh Xuân Bắc, Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản TS.Hoàng Thị Kim HOa 6123 25/9/2006 Hà nội, 12-2005 Bản quyền 2005 thuộc TTSHTN Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc TTSHTN trừ tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Thông tin về đề tài Tên đề tài: “Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản”. 1. Chủ nhiệm : TS. Hoàng Thị Kim Hoa Điện thoại (CQ) : 8549438 2. Địa chỉ cơ quan : C6- Thanh xuân bắc - Đống đa – Hà Nội. 3. Thời gian thực hiện : 12 tháng (từ tháng 1/2005 đến tháng 12/ 2005) 4.Cơ quan chủ trì thực hiện : Trung tâm Sinh học Thực nghiệm 5. Cơ quan chủ quản : Viện ứng dụng công nghệ 6. Tên tổ chức KH & CN: Trung tâm Sinh học Thực nghiệm 7. Kinh phí Tổng số : 218.000.000 đ (Hai trăm m−ời tám triệu đồng) 8. Từ ngân sách SNKH : 218.000.000 đ (Hai trăm m−ời tám triệu đồng) Cán bộ thực hiện đề tài Chủ nhiệm đề tài: TS. Hoàng Thị Kim Hoa, Trung tâm Sinh học thực nghiệm. Các cán bộ thực hiện chính: - CN Trần Bảo Trâm - Trung tâm Sinh học thực nghiệm - Ths. Nguyễn Trâm Anh- Trung tâm Sinh học thực nghiệm. - CN. Nguyễn Thanh Mai- Trung tâm Sinh học thực nghiệm. - CN. Nguyễn Thị Huyền - Trung tâm Sinh học thực nghiệm. Mục tiêu: - Đ−a ra qui trình phân lập làm sạch và bảo quản 5 giống vi tảo có giá trị dinh d−ỡng cao ứng dụng trong nhân giống thuỷ sản là Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris. - Từng b−ớc xây dựng tập đoàn giống tảo có chất l−ợng tốt để cung cấp cho các cơ sở sản xuất giống thuỷ sản. Nội dung: - Nghiên cứu qui trình bỏ tảo lạ và động vật phù du tạo 5 giống tảo thuần (Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris). - Nghiên cứu ảnh h−ởng của một số loại kháng sinh lên sinh tr−ởng của tảo và vi sinh vật. - Nghiên cứu bảo quản thử 5 giống tảo bằng kĩ thuật làm bất động. - Đề xuất qui trình phân lập làm sạch và bảo quản giống tảo. Chữ viết tắt TA – Ký hiệu kháng sinh thuộc nhóm carbonhydrat NĐKS – Nồng độ kháng sinh TN – Thí nghiệm D. salina – Dunaliella salina N. oculata – Nannochloropsis oculata T. chuii – Tetraselmis chuii Ch. vulgaris – Chlorella vulgaris I. galbana – Isochrysis galbana EPA – Eicosapentaenoic acid DHA – Docosahexanenoic acid 1 Lời mở đầu Trong một số công trình nghiên cứu tr−ớc đây chúng tôi đã giới thiệu về giá trị dinh d−ỡng của vi tảo biển và sự cần thiết sử dụng tảo làm thức ăn cho con giống trong nuôi trồng nhân giống nhân tạo các loài hải sản. Do các loài vi tảo biển có giá trị dinh d−ỡng cao, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp cho động vật biển giai đoạn còn non nên ở các n−ớc có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển, vấn đề sản xuất tảo ở các trại giống rất đ−ợc chú trọng. Kinh phí đầu t− cho việc sản xuất tảo chiếm tới 50% kinh phí của trại giống. ở n−ớc ta, trong những năm gần đây các loài vi tảo biển đã đ−ợc nuôi trồng phục vụ nhân giống hải sản ở nhiều trại giống. Tuy nhiên việc sản xuất tảo ở các trại giống hải sản hiện nay gặp rất nhiều khó khăn do ch−a có nguồn giống ổn định. Thực tế cho thấy các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du, làm giảm năng suất và chất l−ợng tảo, ảnh h−ởng đến quá trình sản xuất giống hải sản. Vì vậy cần có nguồn giống tốt để th−ờng xuyên cung cấp cho sản xuất. Việc nghiên cứu qui trình phân lập, làm sạch và bảo quản lâu dài một số giống tảo có giá trị kinh tế cao để cung cấp giống chủ động, ổn định, kịp thời cho việc sản xuất giống thuỷ sản tại các trại giống là hết sức cần thiết. 2 Phần I: Tổng quan tài liệu Các loài vi tảo biển có kích th−ớc bé, giàu dinh d−ỡng, giàu các chất có hoạt tính sinh học rất phù hợp để sử dụng cho động vật biển giai đoạn còn non. Vì vậy vi tảo đ−ợc sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản nh− là nguồn thức ăn t−ơi sống thiết yếu của động vật thân mềm 2 mảnh vỏ ( sò, điệp, ngao, vẹm, trai. . .), ấu trùng bào ng−, tôm, một số loài cá và động vật phù du sử dụng trong dây chuyền thức ăn phục vụ nuôi trồng thuỷ sản. Trong hơn bốn thập kỷ qua hàng trăm loài tảo đã đ−ợc thử nghiệm và đã chọn đ−ợc vài chục loài có khả năng nhân nuôi sinh khối ứng dụng trong thuỷ sản. Chúng thuộc ngành tảo lục (Chlorophycophyta), tảo khuê (Bacilariophyta) và tảo roi cụt (Haptophyta). Theo các tác giả Brown et al ( 1991, 1992, 1997, 1999), Renaud et al (1999), Knuckey et al (2002), các loại tảo này có kích th−ớc nhỏ, thành tế bào mỏng, dễ tiêu hoá, giàu dinh d−ỡng, hàm l−ợng protein, axit amin, lipít, cacbonhydrat và vitamin cao, thích hợp cho sinh tr−ởng của ấu trùng các động vật biển, đặc biệt các loài vi tảo này có hàm l−ợng a xít béo rất cao, trong đó có các axit béo không no mạch dài (DHA, EPA) chiếm từ 49,7-77,9% ở tảo lục và chroomonas, từ 19,8- 52,6% ở tảo diatoms và prymnesiophytes ). Các axít này rất cần thiết cho sinh tr−ởng và phát triển của động vật biển giai đoạn ấu trùng. (inquiries@aquafauna.com). Vì vậy các trại giống rất chú trọng đến việc nuôi tảo. Kinh phí để sản xuất tảo chiếm từ 15-50% kinh phí của trại giống. Để đảm bảo hiệu quả của quá trình sản xuất hải sản, cần có nguồn thức ăn tảo với chất l−ợng cao, muốn vậy nguồn giống tảo cho quá trình sản xuất sinh khối phải đạt chất l−ợng tốt. Th−ờng các giống tảo sau một thời gian ngắn nuôi trồng đều bị nhiễm tạp các loài tảo lạ, vi khuẩn, nấm và động vật phù du. Để đáp ứng nguồn tảo giống cho các trại sản xuất th−ờng xuyên phải cung cấp giống mới (sạch, tốt) từ tập đoàn giống gốc. Vì vậy, giống cần đ−ợc th−ờng xuyên phân lập và bảo quản trong điều kiện thích hợp. ở các n−ớc có ngành nuôi trồng thuỷ sản phát triển nh− Mỹ, úc, Tây Ban Nha, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, Hàn Quốc, Singapore … đều có các cơ sở cung cấp giống tảo chất l−ợng cao và các 3 dịch vụ đi kèm nhằm đảm bảo có giống tốt, cung cấp ổn định cho sản xuất. Tuy nhiên việc phân lập tảo gặp nhiều khó khăn do kích th−ớc tế bào tảo nhỏ, sống kết hợp với vi sinh vật và các loài ký sinh khác. Vì vậy việc tách vi khuẩn khỏi tảo là rất khó. Gerloff và cộng sự (1950), Kbutko (1961) đã làm sạch tảo lam bằng cách sử dụng tia cực tím. Tuy nhiên ph−ơng pháp này có nh−ợc điểm là có thể gây đột biến di truyền. Baccep và cộng sự (1989) đã sử dụng ph−ơng pháp cấy tảo trên thạch. Sau đó chọn khuẩn lạc mong muốn và cấy tiếp vào môi tr−ờng lỏng để tảo phát triển, tiếp tục lấy tảo từ môi tr−ờng lỏng cấy tiếp vào môi tr−ờng thạch. Quá trình đ−ợc lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đ−ợc tảo sạch. Cách phân lập này hiện nay vẫn đ−ợc sử dụng phổ biến.Tuy nhiên với ph−ơng pháp nh− trên tốn rất nhiều thời gian và cũng không loại bỏ đ−ợc vi khuẩn bám chặt vào lớp nhầy quanh tế bào tảo. Stein (1973) cho thấy tảo sạch cũng có thể nhận đ−ợc bằng cách rửa kỹ và sử dụng một hoặc nhiều loại kháng sinh để diệt khuẩn nh−ng không nêu sử dụng loại kháng sinh nào Để nâng cao hiệu quả, rút ngắn thời gian phân lập, Alenkhina và cộng sự (2001) đã sử dụng chất diệt khuẩn Methiolat để tách vi khuẩn ra khỏi tảo lam. Kết quả cho thấy nồng độ Methiolat 2ppm có tác dụng diệt khuẩn nh−ng không làm ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của chủng tảo lam nghiên cứu. Việc nghiên cứu làm sạch khuẩn các loài vi tảo biển nói chung và các chủng tảo Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Isochrryis galbana, Tetraselmis chuii, Chlorella vulgaris còn ít đ−ợc công bố. Sau khi có đ−ợc tảo sạch, vấn đề giữ giống cũng rất quan trọng. Th−ờng tảo đ−ợc giữ ở điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thấp để hạn chế sinh tr−ởng. Tuy nhiên trong điều kiện này giống giữ không đ−ợc lâu, dễ nhiễm, chất l−ợng kém. Vì vậy, vấn đề bảo quản giống trở nên bức xúc và đ−ợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Morris (1978), Fenwick và cộng sự (1992), Pedro Canavate và cộng sự (1995), Hong Quan Liu và cộng sự (2004) đã nghiên cứu bảo quản một số loài tảo bằng kỹ thuật đông lạnh, ph−ơng pháp này đòi hỏi phải áp dụng một số ph−ơng thức đặc biệt nhằm hạn chế tổn th−ơng đối với tế bào (Moris, 1987) nh− dùng các chất chống đóng băng, điều khiển tốc độ làm lạnh, tốc độ làm ấm, 4 sử dụng các yếu tố điều hoà nhiệt độ, nồng độ muối,... Các tác giả trên cũng cho thấy: Có hai ph−ơng pháp đông lạnh là đông lạnh một b−ớc và đông lạnh hai b−ớc. Đông lạnh một b−ớc là tảo sau khi ủ, cho vào cọng rạ và đ−a thẳng vào nitơ lỏng (-196 o C) (Tsuzu, 1973; Beu-Amotz và Gilboa, 1980). Đông lạnh 2 b−ớc là đầu tiên tảo đ−ợc đông lạnh trong điều kiện có kiểm soát nhằm giảm h− hại do quá trình tạo băng, sau đó đ−a vào nitơ lỏng. Kết quả nghiên cứu của Pedro canavate và cộng sự (1995) cho thấy: Tuỳ theo ph−ơng pháp làm lạnh, nồng độ chất chống đóng băng, nồng độ muối, môi tr−ờng và đặc điểm của từng giống nên khả năng sống của tảo sau khi bảo quản rất khác nhau. Đối với Chaetoceros glacilis, tỉ lệ sống chỉ đạt 2,9-7,3%; Rodomonas baltica 2,2-3,1%; Isochrysis galbana từ 9,3-25,8%, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis gaditana và Nannochloropsis atomus không bị ảnh h−ởng bởi quá trình làm lạnh. Theo nhận xét của nhiều tác giả: bảo quản bằng kĩ thuật đông lạnh phức tạp, phụ thuộc nhiều yếu tố. Ngoài ra trong quá trình đông lạnh, sự hình thành băng đột ngột có thể xảy ra làm h− hại tế bào (Moris, 1987), hơn nữa việc sử dụng các hoá chất chống lạnh gây độc đối với tế bào và có thể làm ảnh h−ởng đến khả năng sống của tảo. Điều này đã đ−ợc mô tả đối với tảo Chlorella (Moris.1976), tảo khuê (Mclellan, 1989) và Tetraselmis suecica (Fenwiek and Day, 1992). Ngoài ra, sử dụng kĩ thuật đông lạnh còn đòi hỏi một số thiết bị đặc chủng, chi phí cao, khó thực hiện. Vì vậy, công nghệ bảo quản mang tính −u việt hơn: ít phức tạp, chi phí thấp, phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm và cơ sở sản xuất đang đ−ợc các nhà khoa học nghiên cứu áp dụng. Đó là bảo quản tảo bằng cách làm bất động (immobilization) (Tamponet và cộng sự ,1985; Hertherg and Jensen, 1989; Susana Romo and Carmen Berer-Martiner ,1997; Yean- Chang-Chen, 2001,2003) .Kết quả nghiên cứu của Tamponnet và cộng sự (1985) và Hertzberg and Jensen (1989) cho thấy các giống tảo khuê đ−ợc làm bất động trong gel vẫn duy trì đ−ợc cấu trúc nguyên vẹn và hoạt tính sinh lí trong một số tháng, điều này gợi ý có thể sử dụng kĩ thuật này trong bảo quản giống tảo. Tuy nhiên các tác giả trên cũng l−u ý rằng trong 7 giống tảo thí nghiệm thì chỉ có 2 giống tảo Phaeodactylum tricornutam và Skeletonema costatum là cho kết quả 5 tốt. Tác giả Susana Romo and Carmen Perez Martinez (1997) đã thử nghiệm kĩ thuật làm bất động để bảo quản giống tảo lam Pseudanabaena galeata Bocher (cyanobacteria) và đánh giá khả năng sống, đặc điểm sinh lí, sinh hoá và cấu trúc của chúng sau thời gian bảo quản 14-18 tháng. Kết quả cho thấy tảo sau khi đ−ợc bảo quản tỉ lệ sống đạt 93%, sinh tr−ởng tốt, không có sự khác biệt về cấu trúc tế bào, sinh hoá và tốc độ sinh tr−ởng giữa tảo thí nghiệm và tảo đối chứng. Các tác giả trên nhận xét việc xử lí d−ờng nh− không có ảnh h−ởng đến khả năng sinh tr−ởng và chức năng của tảo Pseudanabaena galeata, hàm l−ợng C, H, N và P trong tế bào tảo đ−ợc bảo quản và tế bào tảo đối chứng không có sự khác biệt đáng tin cậy. Tảo sau khi bảo quản đ−ợc đ−a vào môi tr−ờng thích hợp để sinh tr−ởng. Tác giả Yean-Chang-Chen (2001) đã nghiên cứu kĩ thuật làm bất động Scenedesmus quadricauda trong hạt gel để bảo quản tảo lâu dài. Tảo đ−ợc cố định bằng kĩ thuật làm bất động vẫn giữ đ−ợc hoạt tính sinh lí sau 3 năm bảo quản trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 4o C, không có môi tr−ờng dinh d−ỡng. Sau khi cho vào môi tr−ờng thích hợp trong 4 tuần, số l−ợng tảo đã tăng lên 40 lần. Kết quả quan sát cho thấy sau quá trình bảo quản dài ngày, một số cơ quan tử (pyrenoids) của Scenedesmus quadricauda bị tiêu huỷ. Tuy nhiên cơ quan tử này sẽ phục hồi khi đ−a vào điều kiện nuôi thích hợp về dinh d−ỡng và ánh sáng. Kết quả nghiên cứu của Yean – Chang - Chen (2003) đối với tảo Haptophyta; Laz E. de Bashan và công sự (2002) đối với tảo Chlorella và Azospirillum cho thấy giống tảo sau khi bảo quản bằng ph−ơng pháp làm bất động có độ nảy mầm cao, sinh tr−ởng tốt và đặc biệt là chi phí bảo quản thấp. Giống có thể bảo quản đ−ợc 1 – 3 năm vẫn đảm bảo chất l−ợng tốt. Qua những kết quả thu đ−ợc, các tác giả trên nhận xét có thể sử dụng kĩ thuật làm bất động để bảo quản tảo lâu dài trong phòng thí nghiệm và ứng dụng vào thực tế sản xuất nuôi trồng thuỷ sản nhằm giảm chi phí sản xuất so với các ph−ơng pháp truyền thống. ở n−ớc ta trong những năm gần đây, tảo đã đ−ợc sử dụng làm thức ăn t−ơi sống phục vụ nhân giống hải sản (tôm, cá, bào ng−, ngao, sò, động vật hai 6 mảnh vỏ...). Hiện nay nhu cầu về tảo trong các trại giống rất lớn. Nh−ng để sản xuất tảo mang lại hiệu quả nh− mong muốn, vấn đề giống là khâu đặc biệt quan trọng. Các cơ sở nhân giống thuỷ sản lớn nh−: Trạm nhân giống thuỷ sản n−ớc mặn tại Cát Bà, trạm nghiên cứu nhân giống thuỷ sản n−ớc lợ Quí Kim Đồ Sơn Hải Phòng, một số cơ sở nuôi trồng thuỷ sản ở Miền Trung (Nha Trang, Khánh Hoà, Cửu Hội, Nghệ An) đều có bộ phận nhân nuôi tảo phục vụ −ơm nuôi con giống. Tuy nhiên giống tảo sử dụng tại các trại giống hiện nay chủ yếu là nhập từ n−ớc ngoài, trong quá trình sử dụng giống th−ờng bị nhiễm dẫn đến giảm chất l−ợng. Các cơ sở này ít có điều kiện phân lập làm sạch. Vì vậy vấn đề sản xuất tảo nhân nuôi con giống gặp nhiều khó khăn. Ngoài ra, việc giữ giống th−ờng đ−ợc thực hiện bằng cách nuôi tảo trong môi tr−ờng lỏng, trong tủ mát với nhiệt độ 15-17oC. Trong điều kiện này tảo phát triển nhanh và dễ bị nhiễm tạp tảo lạ và vi khuẩn. Hiện nay công nghệ bảo quản bằng kỹ thuật làm bất động ở Việt Nam ch−a đ−ợc nghiên cứu áp dụng. Vì vậy việc nghiên cứu qui trình làm sạch tảo (bao gồm phân lập, loại bỏ tảo lạ, động vật phù du và làm sạch khuẩn tiến tới xây dựng tập đoàn giống có chất l−ợng tốt và nghiên cứu kỹ thuật nhằm bảo quản lâu dài các giống tảo nhằm chủ động phục vụ sản xuất là hết sức cần thiết. Với mục đích trên chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu qui trình công nghệ phân lập, làm sạch và bảo quản một số giống tảo có giá trị kinh tế cao phục vụ ngành nuôi trồng thuỷ sản”. 7 Phần II. Đối t−ợng và ph−ơng pháp nghiên cứu. II.1. Đối t−ợng nghiên cứu. Đối t−ợng nghiên cứu là tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris. Tảo Dunaliella salina và Chlorella vulgaris đ−ợc lấy từ tập đoàn giống của Trung tâm sinh học thực nghiệm. Tảo Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Tetraselmis chuii đ−ợc lấy từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, Hải phòng. Dunaliella salina là tảo đơn bào, màu xanh lục, kích th−ớc tế bào 7-12àm. Tế bào có dạng hình ovan, không có màng cứng bằng xenlulloza bao bọc mà chỉ có màng nguyên sinh chất, có khả năng chuyển động liên tục trong quá trình sống nhờ roi ở đỉnh. Tảo sinh sản bằng hình thức vô tính chia dọc hay ngang tế bào. Dunaliella salina chứa nhiều loại sắc tố đặc biệt là β-caroten (chiếm từ 8- 14% trọng l−ợng khô), hàm l−ợng dinh d−ỡng cao, axit béo không no chiếm 77,9% tổng l−ợng axit béo, Dunaliella salina rất thích hợp để làm thức ăn cho một số loài động vật biển. Nannochloropsis oculata có màu xanh, kích th−ớc nhỏ 2-4àm thành tế bào mỏng thích hợp làm thức ăn cho luân trùng. Đặc điểm của tảo Nanochloropsis oculata là hàm l−ợng axit béo không no omega-3 fatty unsaturated fatty acids (HUFAs) rất cao ( từ 16-42%) trong đó chủ yếu là EPA. (Eicosapentaenoic acid). Trong tảo chiếm một l−ợng lớn vitamin B12, vitamin này có ảnh h−ởng tốt đến tỉ lệ sống và sinh tr−ởng của ấu trùng cá. Vì vậy, Nannochloropsis oculata là tảo đ−ợc nuôi trồng phổ biến nhất trong các trại nuôi trồng thuỷ sản để phục vụ công tác nhân giống động vật biển. Isochrysis galbana có màu nâu vàng, có lông roi, kích th−ớc từ 4-7àm. Tảo này đ−ợc nuôi trồng phổ biến để làm thức ăn cho động vật hai mảnh vỏ (ngao, sò ...), kết hợp với tảo Chlorella hoặc tảo khác để làm thức ăn cho luân trùng. Hàm l−ợng axit béo không no EPA trong tảo Isochrysis galbana chiếm 2- 3,5% và DHA 3,5-4%. 8 Tetraselmis chuii thuộc loài tảo lục, kích th−ớc 9-14àm, đ−ợc sử dụng nhiều trong nuôi trồng thuỷ sản. Trong tảo chứa khoảng 5% EPA và 7% DHA, đặc biệt trong tảo này có chứa axit béo 20 : 5n-3 và sterol 24-methychlesterol hoặc 24-methylenecholesterol với hàm l−ợng cao. Các hợp chất trên có rất ít trong thực vật phù du và rất thích hợp cho sinh tr−ởng của ấu trùng động vật biển nói chung và động vật thân mềm 2 mảnh vỏ nh− ngao, sò, hầu (Wikfors et al, 1991) Chlorella vulgaris là tảo lục giàu dinh d−ỡng đ−ợc sử dụng nhiều trong nuôi trồng thuỷ sản, ngoài việc làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng động vật biển (tôm, động vật 2 mảnh vỏ) ở một số giai đoạn phát triển, Chlorella vulgaris còn có tác dụng rất tốt trong xử lí n−ớc ao nuôi, gây màu n−ớc... II.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu Ph−ơng pháp phân lập, làm sạch tảo: dịch tảo đ−ợc làm sạch sơ bộ bằng cách lọc qua vải lọc hoặc bông để loại bỏ tạp chất, tảo sợi và động vật phù du. Sau đó tiến hành ly tâm để xác định tốc độ và thời gian ly tâm thích hợp đối với từng chủng tảo, dựa vào đó có thể ly tâm tách tảo để thu đ−ợc sinh khối chủng tảo mong muốn. Từ sinh khối tảo thu đ−ợc tiến hành phân lập theo 2 ph−ơng pháp: phân lập trên môi tr−ờng thạch và phân lập trong môi tr−ờng lỏng bằng ph−ơng pháp pha loãng. -Phân lập trên môi tr−ờng thạch: Mẫu tảo sau khi pha loãng đ−ợc cấy vào đĩa thạch có chứa dinh d−ỡng phù hợp với loài cần phân lập. Tảo đ−ợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng 1500lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 18oC. Sau 15-20 ngày, tảo mọc thành khuẩn lạc riêng rẽ, chọn khuẩn lạc mong muốn, dùng que cấy tách khuẩn lạc đã chọn cho vào môi tr−ờng lỏng, quá trình lặp lại nhiều lần cho đến khi thu đ−ợc tảo mong muốn (không lẫn tảo lạ) Phân lập trong môi tr−ờng lỏng: Tảo sau khi đã làm sạch sơ bộ, đ−ợc pha loãng sao cho mỗi giọt có một tế bào tảo, sau đó chuẩn bị các ống nghiệm có môi tr−ờng dinh d−ỡng. Nhỏ vào mỗi ống nghiệm 1 giọt tảo đã đ−ợc pha loãng. 9 Để các ống nghiệm trong điều kiện ánh sáng yếu (1000lux) để tảo phát triển, sau 2-3 tuần kiểm tra để chọn ống nghiệm có tảo mong muốn. Sau khi thu đ−ợc tảo thuần, dùng kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn, thu tảo sạch khuẩn. Công việc đ−ợc tiến hành nh− sau: 1) Bổ sung kháng sinh vào môi tr−ờng thạch sau đó cấy dịch tảo lên mặt đĩa thạch để theo dõi sinh tr−ởng của vi khuẩn nhằm xác định sơ bộ loại kháng sinh, nồng độ kháng sinh thích hợp để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo. 2) Bổ sung kháng sinh trực tiếp vào dịch tảo, sau đó theo dõi sinh tr−ởng của tảo và sự phát triển của vi khuẩn nhằm xác định chính xác loại kháng sinh và nồng độ kháng sinh thích hợp để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi dịch tảo. Sinh tr−ởng của tảo đ−ợc xác định bằng cách đo mật độ tảo (chỉ số OD) trên máy quang phổ (Đối với tảo Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata,, Chlorella vulgaris đo ở b−ớc sóng 640 nm, Isochrysis galbana đo ở b−ớc sóng 520nm). Xác định sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo bằng cách cấy dịch tảo lên môi tr−ờng thạch có chứa dinh d−ỡng phù hợp cho sinh tr−ởng của vi khuẩn và kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn để xác định nồng độ và loại kháng sinh thích hợp cho việc loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo. Sinh tr−ởng của vi khuẩn đ−ợc tính bằng số khuẩn lạc hoặc diện tích mặt đĩa thạch có vi khuẩn mọc. Các kháng sinh đ−ợc sử dụng trong thí nghiệm là: Tetracycline, Peflacine, Erythromycine và kháng sinh kí hiệu là TA. Tetracycline và peflacine đ−ợc cho là những kháng sinh thuộc nhóm quinon có phổ tác động rộng, có hiệu quả chống lại nhiều loại vi khuẩn. Erythromycine là kháng sinh chống lại các vi khuẩn gram d−ơng rất hiệu quả. TA là kháng sinh aminoglysid thuộc nhóm carbonhydrat sử dụng rất hiệu quả nhằm chống các vi khuẩn gram âm khi dùng trực tiếp. Tảo sau khi phân lập, làm sạch, loại bỏ vi khuẩn đ−ợc bảo quản bằng kỹ thuật làm bất động nhằm giữ giống lâu dài. Nguyên tắc của ph−ơng pháp này là 10 sử dụng chất tạo gel để cố định mẫu, bảo quản mẫu ở nhiệt độ thấp, không có ánh sáng, khi cần sử dụng hoà tan tảo và để ở điều kiện ánh sáng, nhiệt độ thích hợp cho tảo phát triển. 11 Phần III: Kết quả nghiên cứu III.1 Nghiên cứu phân lập thu giống tảo thuần Để thu đ−ợc giống tảo thuần sạch tảo lạ và động vật phù du, quá trình phân lập tiến hành nh− sau: Loại bỏ tảo lạ bằng ph−ơng pháp làm sạch sơ bộ: Lọc qua vải lọc hoặc bông để loại bỏ tạp chất, tảo sợi và động vật phù du, sau đó dựa vào các đặc tính sinh lý của từng loại tảo để chọn ph−ơng pháp phân lập phù hợp. Đối với tảo Dunaliella salina là tảo −a mặn có thể chịu đ−ợc môi tr−ờng có nồng độ muối cao hơn các loại tảo khác. Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi tảo trong môi tr−ờng có nồng độ muối từ 25-30% (cao gấp 10 lần môi tr−ờng dinh d−ỡng cho vi tảo biển nói chung). Sau một thời gian nuôi trong môi tr−ờng có nồng độ muối cao, các loài tảo nhiễm tạp giảm đáng kể. Từ sinh khối tảo thu đ−ợc, dựa vào tốc độ ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp cho từng loại tảo chúng tôi tiến hành tách tảo theo ph−ơng pháp ly tâm . Việc thí nghiệm ly tâm tách tảo nh− sau: Các chủng tảo đ−ợc ly tâm với tốc độ khác nhau: 1000, 2000, 3000 (v/phút) trong thời gian 2 phút, 3 phút, 5 phút. Sau mỗi lần ly tâm, kiểm tra dịch tảo và cặn tảo để xác định độ lắng, độ sạch của tảo, trạng thái tế bào tảo, từ đó xác định tốc độ và thời gian thích hợp để làm sạch sơ bộ các chủng tảo mong muốn. Kết quả thí nghiêm đ−ợc thể hiện ở bảng 1. Bảng 1: Thời gian và tốc độ ly tâm thích hợp để tách tảo. Tốc độ Thời gian 1000v/phút 2000v/phút 3000v/phút 2 phút Tetraselmis chuii Dunaliella salina Chlorella vulgaris 3 phút Isochrysis galbana Nannochloropsis oculata Kết quả cho thấy tảo Tetraselmis chuii ly tâm với tốc độ 1000vòng/phút trong thời gian 2 phút có 80% số tế bào lắng, tảo t−ơng đối sạch tảo lạ, khi tăng tốc độ ly tâm lên 2000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút, toàn bộ 100% tế bào lắng cặn, trong đó có nhiều tế bào tảo lạ. Vì vậy chúng tôi cho rằng đối với Tetraselmis chuii ly tâm tốc độ 1000v/phút trong vòng 2 phút là thích hợp. 12 Đối với tảo Isochrysis galbana với tốc độ ly tâm 1000v/phút trong vòng 2 phút, 3 phút, 5 phút, tảo hoàn toàn không lắng. Khi tăng tốc độ ly tâm lên 2000v/phút với thời gian ly tâm là 2 phút, số l−ợng tảo lắng là 50% nh−ng tạo cặn không chắc, khi tăng tốc độ ly tâm lên 3000v/phút, có 90% số l−ợng tảo lắng cặn nh−ng có chứa nhiều tế bào tảo lạ. Kết quả sau nhiều lần thí nghiệm cho thấy đối với tảo Isochrysis galbana ly tâm tốc độ 2000v/phút trong vòng 3 phút là t−ơng đối thích hợp ( 70% số l−ợng tế bào lắng trong đó có ít tế bào tảo lạ). Kết quả thí nghiệm đối với tảo Nannochloropsis ocalata cũng cho thấy với tốc độ ly tâm 1000v/phút, thời gian ly tâm: 2 phút, 3 phút, 5 phút tảo đều không lắng. ở tốc độ 2000v/phút số l−ợng tảo lắng chỉ khoảng 30-40%; khi ly tâm với tốc độ 3000v/phút, thời gian ly tâm 3 phút, tảo lắng là 80%. Tuy nhiên ngoài Nannochloropsis oculata trong cặn tảo còn một số tế bào tảo lạ. Đối với tảo Chlorella, để tách đ−ợc tảo t−ơng đối sạch tảo lạ cần ly tâm ở tốc độ 3000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút và với tảo Dunaliella salina tốc độ ly tâm 2000v/phút, thời gian ly tâm 2 phút. Sau khi ly tâm để tách tảo, chúng tôi thu đ−ợc các chủng tảo t−ơng đối sạch tảo lạ. Từ các mẫu tảo thu đ−ợc tiếp tục phân lập theo ph−ơng pháp pha loãng hoặc cấy trên môi tr−ờng thạch để thu tảo thuần nh− đã trình bày ở phần ph−ơng pháp nghiên cứu. Sau quá trình phân lập công phu chúng tôi đã thu đ−ợc tảo thuần: Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana và Chlorella vulgaris. Tuy nhiên các giống tảo này còn nhiễm rất nhiều vi khuẩn. Kết quả kiểm tra cho thấy trong dịch tảo chứa rất nhiều loại vi khuẩn khác nhau (ảnh 1) bao gồm các vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram d−ơng ( ảnh 2). Vì vậy cần nghiên cứu loại bỏ vi khuẩn để thu tảo sạch khuẩn. 13 ảnh1: Đĩa thạch có khuẩn lạc dày đặc ảnh 2: Nhuộm Gram III.2.Nghiên cứu thu tảo sạch khuẩn Nghiên cứu ảnh h−ởng của kháng sinh lên việc loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo. Để loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo chúng tôi đã thử nghiệm bổ sung một số kháng sinh vào môi tr−ờng nuôi cấy tảo để nghiên cứu khả năng loại bỏ vi khuẩn của kháng sinh và ảnh h−ởng của chúng lên sinh tr−ởng của tảo. Các 14 kháng sinh đ−ợc lựa chọn phải đáp ứng yêu cầu: có khả năng loại bỏ vi khuẩn và không làm ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của tảo. Với mục đích trên, chúng tôi đã thử nghiệm 4 loại kháng sinh : Tetracycline, Peflacine, Erythromycine và TA. Thí nghiệm đ−ợc tiến hành nh− sau: chuẩn bị môi tr−ờng thạch Gorbenko có bổ sung kháng sinh với nồng độ khác nhau, sau đó cấy dịch tảo lên môi tr−ờng thạch để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và tảo. Kết quả thu đ−ợc là cơ sở để xác định ng−ỡng nồng độ kháng sinh thích hợp nhằm loại bỏ vi khuẩn đối với từng loại tảo. Điều này rất cần thiết khi giữ giống trong môi tr−ờng thạch. Thí nghiệm thăm dò ảnh h−ởng của một số loại kháng sinh lên sinh tr−ởng của tảo và vi khuẩn trong dịch tảo đ−ợc tiến hành bằng cách bổ sung trực tiếp kháng sinh vào môi tr−ờng nuôi cấy tảo, sau đó theo dõi sinh tr−ởng của tảo và kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn. III.2.1 ảnh h−ởng của Tetracycline và Peflacine lên việc loại bỏ vi khuẩn và sinh tr−ởng của tảo. Tetracycline là kháng sinh thuộc nhóm quinon có phổ tác động rộng, có tác dụng đối với vi khuẩn Gram d−ơng và Gram âm. Vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu thăm dò việc sử dụng kháng sinh này để loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo. Tuy nhiên khi bổ sung Tetracyeline vào môi tr−ờng nuôi tảo đã làm cho môi tr−ờng bị kết tủa, ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của tảo. Vì vậy chúng tôi tiếp tục thí nghiệm với một kháng sinh khác cũng thuộc nhóm quinon là peflacine. Peflacine đ−ợc bổ sung vào môi tr−ờng thạch đặc (Gorbenko) với nồng độ từ 2.5àg/ml-150àg/ml, sau đó cấy dịch tảo lên môi tr−ờng thạch để kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 2. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 2 cho thấy: ở công thức đối chứng (môi tr−ờng không có kháng sinh), sau 3 ngày cấy dịch tảo vào môi tr−ờng thạch, toàn bộ diện tích mặt đĩa thạch đều có vi khuẩn phát triển. ở công thức có bổ sung peflacine nồng độ 2.5àg/ml cũng thu đ−ợc kết quả t−ơng tự nh− công thức đối chứng, chỉ có ở công thức đ−ợc cấy chủng tảo Isochrysis galbana 15 l−ợng vi khuẩn giảm 50%.Khi tăng nồng độ peflacine lên 20 àg/ml, l−ợng vi khuẩn ở các đĩa đ−ợc cấy các chủng tảo đều giảm đáng kể trừ Chlorella. Bảng 2: ảnh h−ởng của peflacine đến sinh tr−ởng của vi khuẩn trên môi tr−ờng thạch đặc (tính bằng % diện tích mặt đĩa thạch có vi khuẩn mọc) Giống Nồng độ (àg/ml) T.chuii D.salina Ch.vulgaris N.oculata I.galbana ĐC 100% (nhiều loại khuẩn lạc ) 100% 100% 100% (nhiều loại khuẩn lạc) 100% 2.5 100% (nhiều loại khuẩn lạc ) 100%, 2 loại khuẩn lạc 100% 100%, 1 loại khuẩn lạc 50% 5 20%, chỉ có 2 loại khuẩn lạc. 10% 100% 20%, khuẩn lạc bé 50% 10 15%, có 2 loại khuẩn lạc 9%, 1 loại khuẩn lạc 100% 10%, khuẩn lạc rất bé 40%, khuẩn lạc bé. 20 10%, chỉ có một loại khuẩn lạc 7% 100% 0 0 40 10%, chỉ có một loại khuẩn lạc 20 khuẩn lạc 100% 0 0 50 120 khuẩn lạc( 1 loại) 2 khuẩn lạc 100% 0 0 80 70 khuẩn lạc 0 100% 0 0 150 30 khuẩn lạc phát triển bé 0 100% 0 0 ở các đĩa thạch đ−ợc cấy dịch tảo Chlorella l−ợng vi khuẩn vẫn rất nhiều, chiếm 100% diện tích mặt đĩa thạch. Trong khi đó ở các đĩa thạch đ−ợc cấy dịch tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana không thấy xuất hiện vi khuẩn. Kết quả t−ơng tự cũng thu đ−ợc khi cấy dịch tảo Dunaliella lên môi tr−ờng thạch cứng có bổ sung peflacine nồng độ 80àg/ml . 16 Từ kết quả trên có thể nhận xét rằng việc bổ sung peflacine nồng độ 20àg/ml vào môi tr−ờng thạch đặc có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn khỏi tảo Nannochloropsis oculata và tảo Isochrysis galbana . Đối với chủng tảo Dunaliella salina nồng độ kháng sinh cần bổ sung là 80àg/ml , còn đối với 2 chủng tảo Tetraselmis chuii và Chlorella nồng độ kháng sinh peflacine 150ml vẫn không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn khỏi hai chủng tảo này. Để tìm hiểu thêm về khả năng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella salina của peflacine, chúng tôi cũng đã tiến hành thử nghiệm tác dụng diệt khuẩn của peflacine trong môi tr−ờng lỏng nuôi tảo. Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 3. Bảng 3: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của vi khuẩn trong dịch tảo D. salina Nồng độ àg/ml Thời gian 40 80 150 15 ngày nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc Kết quả thí nghiệm ở bảng 3 cho thấy: việc bổ sung kháng sinh trực tiếp vào dịch tảo Dunaliella với nồng độ từ 40-150àg/ml không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tảo, trong lúc đó ở môi tr−ờng thạch cứng, l−ợng peflacine cần sử dụng là 80àg/ml (bảng 2). Có thể điều này phụ thuộc vào l−ợng dịch tảo( cụ thể là số l−ợng vi khuẩn) cấy vào môi tr−ờng thạch. Kết quả nghiên cứu ở bảng 4 cũng cho thấy khi tăng nồng độ peflacine trong dịch tảo từ 40àg/ml đến 150àg/ml không làm ảnh h−ởng xấu đến sinh tr−ởng của tảo mà ng−ợc lại, mật độ tảo ở các công thức có nồng độ peflacine 80/ml và 150àg/ml có chiều h−ớng cao hơn mật độ tảo ở công thức có nồng độ peflacine 40àg/ml (Đồ thị 1) . Qua kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 2 và bảng 4 cho thấy có thể sử dụng peflacine nồng độ từ 80-150àg/ml để loại bỏ vi khuẩn khỏi tảo trong điều kiện giữ giống Dunaliella salina trong môi tr−ờng thạch. 17 Bảng 4: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng (OD)của tảo D. salina Thời gian (ngày) Nồng độ (àg/ml) 1 3 4 7 11 14 40 0.110 0.212 0.325 0.426 0.555 0.591 80 0.110 0.215 0.336 0.452 0.568 0.609 150 0.110 0.217 0.331 0.422 0.566 0.603 Đồ thị 1: Ảnh hưởng của Peplacine lờn sinh trưởng của D.salina 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1 3 4 7 11 14 Thời gian thớ nghiệm (ngày) M ật đ ộ (O D ) 40àg/ml 80àg/ml 150àg/ml Đối với các giống tảo Tetraselmis chuii và Chlorella vulgaris, sử dụng peflacine với nồng độ từ 2.5àg/ml -150àg/ml trong môi tr−ờng thạch đặc không có hiệu quả loại bỏ vi khuẩn. Trong lúc đó đối với tảo Nannochloropsis oculata , việc bổ sung peflacine vào môi tr−ờng thạch đặc ở nồng độ 20àg/ml cho kết quả tốt, loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn (bảng 2). Tuy nhiên khi nuôi cấy tảo này trong môi tr−ờng lỏng nồng độ kháng sinh bao nhiêu là phù hợp và peflacine ảnh h−ởng nh− thế nào đến sinh tr−ởng của tảo? Để làm rõ hơn câu hỏi trên chúng tôi đã tiếp tục thử nghiệm bổ sung peflacine vào dịch tảo Nannochloropsis oculata để theo dõi. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 5 và bảng 6. 18 Bảng 5: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của vi khuẩn trong dịch tảo N. oculata Thời gian (ngày) Nồng độ (àg/ml) 3 6 9 ĐC 100% 100% 100% 2.5 100% 100% 100% 5 100% 80% 70% 10 50% 10% 8% 20 30% 10% 7% 40 25% 5% 3% Kết quả ở bảng 5 cho thấy khi bổ sung peflacine vào dịch tảo nồng độ 20àg/ml và 40àg/ml vẫn không có khả năng loại bỏ hết vi khuẩn. Mặt khác việc bổ sung peflacine vào dịch tảo đã làm giảm sinh tr−ởng của tảo Nannochloropsis oculata (bảng 6). Vì vậy chúng tôi cho rằng không nên sử dụng peflacine đối với tảo Nannochloropsis oculata. Bảng 6: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng (OD) của tảo N. Oculata Thời gian (ngày) Nồng độ (àg/ml) 1 3 6 9 13 ĐC 0.083 0.155 0.299 0.460 0.604 2.5 0.083 0.149 0.274 0.416 0.616 5 0.083 0.121 0.288 0.58 0.57 10 0.083 0.152 0.288 0.404 0.551 20 0.083 0.139 0.252 0.312 0.439 40 0.083 0.134 0.237 0.316 0.437 19 Đối với tảo Isochrysis galbana, bổ sung peflacine vào môi tr−ờng thạch cứng nồng độ từ 20àg/ml -150àg/ml có tác dụng loại bỏ hết vi khuẩn(bảng 2). Tuy nhiên khi bổ sung kháng sinh này vào môi tr−ờng lỏng nuôi tảo với nồng độ từ 20-150àg/ml không có khả năng loại bỏ hết vi khuẩn trong dịch tảo(bảng 7). Bảng 7: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của vi khuẩn trong dịch tảo I. galbana Nồng độ KS àg/ml Thời gian TN 20 40 80 150 15 ngày nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc Mặt khác, khi tăng nồng độ kháng sinh peflacine lên 80àg/ml đã có ảnh h−ởng xấu lên sinh tr−ởng của tảo (bảng 8). Vì vậy việc sử dụng peflacine để bổ sung vào dịch tảo Isochrysis galbana là không thích hợp. Bảng 8: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của tảo I.galbana Thời gian (ngày) Nồng độ (àg/ml) 1 3 7 10 14 17 20 0.054 0.115 0.269 0.334 0.376 0.470 40 0.054 0.118 0.283 0.357 0.382 0.483 80 0.054 0.119 0.250 0.317 0.340 0.432 150 0.054 0.102 0.211 0.250 0.306 0.359 Từ những kết quả thu đ−ợc ở trên cho thấy chỉ nên sử dụng peflacine bổ sung vào môi tr−ờng thạch với nồng độ từ 20-40àg/ml để giữ giống các giống tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana, không nên sử dụng peflacine để bổ sung vào môi tr−ờng lỏng nuôi tảo. 20 Chúng tôi cũng tiếp tục kiểm tra hiệu quả diệt khuẩn của peflacine trong dịch tảo Chlorella vulgaris. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 9 và bảng 10. Bảng 9: ảnh h−ởng của nồng độ Peflacine lên sinh tr−ởng của vi khuẩn trong dịch tảo Ch.vulgaris Thời gian(ngày) Nồng độ (àg/ml) 3 6 9 DC 100% 100% 100% 2.5 100% 100% 100% 5 100% 50% 40% 10 20% 20% 20% 20 10% 5% 5% 40 5% 2.5% 2% Kết quả ở bảng 9 cho thấy l−ợng vi khuẩn trong dịch tảo tuy có giảm nhiều so với công thức đối chứng tuy nhiên với nồng độ peflacine từ 2.5àg/ml - 40àg/ml vẫn không có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn. Chúng tôi tiếp tục nâng nồng độ kháng sinh lên 200-400àg/ml . Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 10 cho thấy khi nồng độ peflacine trong môi tr−ờng nuôi tảo đạt 400àg/ml vẫn không có khả năng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn trong dịch tảo. Tuy nhiên nồng độ kháng sinh peflacine từ 2.5-40àg/ml với thời gian xử lí ngắn (3-6 ngày) không có ảnh h−ởng nhiều đến sinh tr−ởng của tảo (bảng 11, 12). Bảng 10: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của vi khuẩn trong dịch tảo Ch. vulgaris Nồng độ àg/ml Thời gian 200 300 400 15 ngày nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc nhiều khuẩn lạc 21 Bảng 11: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của tảo Ch. vulgaris Thời gian (ngày) Nồng độ (àg/ml) 1 3 6 9 13 ĐC 0.099 0.180 0.315 0.430 0.520 2.5 0.099 0.168 0.300 0.420 0.554 5 0.099 0.165 0.290 0.415 0.560 10 0.099 0.157 0.285 0.430 0.555 20 0.099 0.170 0.315 0.425 0.570 40 0.099 0.163 0.273 0.470 0.590 Bảng 12: ảnh h−ởng của peflacine lên sinh tr−ởng của tảo Ch. vulgaris (tiếp) Thời gian (ngày) Nồng độ (àg/ml) 1 3 7 10 14 17 200 0.089 0.177 0.268 0.382 0.495 0.541 300 0.089 0.165 0.246 0.356 0.434 0.499 400 0.089 0.177 0.245 0.327 0.401 0.445 Chúng tôi cũng đã thử nghiệm sử dụng peflacine để bổ sung vào dịch tảo Tetraselimis chuii, kết quả cho thấy đối với tảo Tetraselmis chuii, nồng độ peflacine từ 50-200àg/ml không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo. Việc bổ sung peflacine vào môi tr−ờng thạch với nồng độ lên đến 300àg/ml cũng không có kết quả.Vì vậy chúng tôi không tiếp tục thử nghiệm sử dụng peflacine đối với tảo Tetraselmis chuii. Từ những kết quả thu đ−ợc ở trên cho thấy: có thể sử dụng peflacine nồng độ 20àg/ml -40àg/ml bổ sung vào môi tr−ờng thạch để giữ giống các 22 giống tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana, nồng độ 80àg/ml để giữ giống Dunaliella salina. Không nên dùng Peflacine để bổ sung vào dịch tảo. Peflacine không thích hợp với các giống Chlorella vulgaris và Tetraselmis chuii. III.2.2.Nghiên cứu ảnh h−ởng của Erythromycine lên khả năng thu tảo sạch khuẩn Để tìm hiểu ảnh h−ởng của Erythromycine lên việc loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo, các thí nghiệm đ−ợc tiến hành nh− sau: Tảo đ−ợc cấy vào môi tr−ờng dinh d−ỡng có bổ sung Erythromycine nồng độ 5-200 àg /ml, sau đó theo dõi sinh tr−ởng của tảo. Sau thời gian nuôi cấy, dịch tảo đ−ợc cấy lên đĩa thạch để kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn. Bảng 13 : ảnh h−ởng của Erythromycine lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo D. salina Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 1 5 10 20 80 100 200 1 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 3 100% 100% 100% 100% 50% 50% 30% 6 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 9 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Kết quả ở bảng 13 cho thấy với nồng độ Erythromycine từ 5-200 àg /ml không có tác dụng ức chế sinh tr−ởng của vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella salina. ở tất cả các mẫu tảo đ−ợc bổ xung kháng sinh vi khuẩn đều phủ kín 100% diện tích bề mặt đĩa thạch. Kết quả t−ơng tự cũng thu đ−ợc khi thí nghiệm với dịch tảo Nannochloropsis oculata (bảng 14) và tảo Isochrysis galbana (bảng 15). 23 Bảng 14: ảnh h−ởng của Erythromycine lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo N. oculata. Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 3 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 6 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 9 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Bảng 15 : ảnh h−ởng của Erythromycine lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo I. galbana Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 100% 100% 100% 100% 50% 30% 20% 3 100% 100% 100% 50% 50% 25% 20% 6 100% 100% 50% 30% 30% 25% 20% 9 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Từ các kết quả thu đ−ợc ở bảng 14 và 15 cho thấy việc dùng kháng sinh Erythromycine không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo. Với môi tr−ờng đ−ợc bổ sung kháng sinh Erythrromycine từ 5-200 àg /ml, l−ợng vi khuẩn trong dịch tảo Nannochloropsis oculata không giảm so với đối chứng (bảng 14). Đối với tảo Isochrysis galbana ở các công thức có bổ sung Erythromycine, tuy l−ợng vi khuẩn giảm nh−ng không có hiệu quả loại bỏ hết vi khuẩn (bảng 15). Mặt khác Erythromycine có ảnh h−ởng xấu đến sinh tr−ởng của Duanliella salina (bảng 16, đồ thị 2 ). 24 Bảng 16 : ảnh h−ởng của Erythromycine lên sinh tr−ởng của tảo D. salina Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 0.119 0.122 0.121 0.118 0.116 0.118 0.114 3 0.153 0.147 0.131 0.125 0.127 0.124 0.123 5 0.201 0.212 0.195 0.157 0.156 0.147 0.129 7 0.232 0.255 0.214 0.172 0.162 0.159 0.134 9 0.258 0.296 0.241 0.211 0.189 0.159 0.127 11 0.275 0.317 0.261 0.233 0.203 0.150 0.109 14 0.309 0.353 0.283 0.240 0.207 0.142 0.100 Đồ thị 2: Ảnh hưởng của Erythrromycine lờn sinh trưởng của D.saliana 0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 3 5 7 9 11 14 Thời gian thớ nghiệm (ngày) M ật đ ộ tế b ào ( O D ) 0àg/ml 5àg/ml 10àg/ml 20àg/ml 80àg/ml 100àg/ml 200àg/ml 25 Bảng 17: ảnh h−ởng của Erythromycine lên sinh tr−ởng của tảo Nannochloropsis oculata Nồng độ àg ml Thời gian (ngày) 0 5 10 20 80 100 200 1 0.146 0.147 0.147 0.142 0.141 0.134 0.125 3 0.186 0.189 0.183 0.174 0.172 0.154 0.136 5 0.207 0.210 0.202 0.192 0.186 0.163 0.142 7 0.242 0.246 0.233 0.210 0.200 0.176 0.158 9 0.281 0.285 0.278 0.224 0.213 0.185 0.165 11 0.310 0.321 0.300 0.245 0.236 0.183 0.152 14 0.340 0.353 0.314 0.272 0.261 0.175 0.143 Đồ thị 3:ả nh h−ởng của Erythromycine lên sinh tr−ởng của tảo N.oculata 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 1 3 5 7 9 11 14 Thời gian (ngày) M ật đ ộ tế b ào (O D ) 0àg/ml 5àg/ml 10àg/ml 20àg/ml 80àg/ml 100àg/mll 200àg/ml Erythromycine cũng có ảnh h−ởng xấu đến sinh tr−ởng của tảo Nannochloropsis oculata (bảng 17, đồ thị 3 ) chỉ số OD của tảo tỉ lệ nghịch với 26 tăng nồng độ kháng sinh. ở các công thức có bổ sung Erythromycine với nồng độ 200àg /ml, tảo hầu nh− không sinh tr−ởng. Kết quả t−ơng tự cũng thu đ−ợc đối với tảo Isochrysis galbana (bảng 18 và đồ thị 4). Bảng 18 : ảnh h−ởng của Erythromycine lên sinh tr−ởng của tảo I. galbana Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày 0 5 10 20 80 100 200 1 0.119 0.115 0.116 0.115 0.111 0.110 0.108 3 0.161 0.153 0.147 0.142 0.141 0.134 0.119 5 0.207 0.173 0.162 0.147 0.146 0.140 0.123 7 0.240 0.191 0.177 0.156 0.154 0.124 0.116 9 0.290 0.200 0.185 0.171 0.145 0.124 0.113 11 0.326 0.195 0.161 0.157 0.133 0.118 0.099 14 0.358 0.192 0.165 0.141 0.125 0.102 0.086 Đồ thị 4: ả nh h−ởng của Erythrromycine lên sinh tr−ởng của tảo I.gabana 0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 3 5 7 9 11 14 Thời gian thớ nghiệm (ngày) M ật đ ộ tế b ào (O D ) 0àg/ml 5àg/ml 10àg/ml 20àg/mll 80àg/ml 100àg/ml 200àg/ml 27 Nh− vậy từ kết quả thu đ−ợc cho thấy Erythromycine không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo, mặt khác Erythromycine có ảnh h−ởng xấu đến sinh tr−ởng của tảo. Vì vậy không nên sử dụng Erythromycine. III.2.3 Nghiên cứu ảnh h−ởng của TA lên việc loại bỏ vi khuẩn ở tảo Để chọn kháng sinh thích hợp cho việc loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm với TA. TA là kháng sinh thuộc nhóm carbonhydrat, nồng độ TA đ−ợc sử dụng trong thí nghiêm là 0;1; 2.5; 10; 20 (àg/ml). Tảo đ−ợc dùng trong thí nghiệm này là Dunaliella salina. Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 19 cho thấy việc bổ sung TA vào môi tr−ờng nuôi cấy tảo Dunaliella salina có tác dụng diệt vi khuẩn tốt. ở công thức đ−ợc bổ sung TA 10àg /ml và 20 àg /ml, sau 3 ngày nuôi cấy số l−ợng vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella salina chỉ còn lại rất ít, trong khi đó ở công thức đối chứng (không bổ sung TA) vi khuẩn chiếm kín 100% bề mặt đĩa thạch (bao gồm nhiều loại khuẩn lạc với kích th−ớc, màu sắc khác nhau). Kết quả thí nghiệm sau 6 ngày nuôi cấy đ−ợc thể hiện ở ảnh 3 cho thấy : Bảng 19: ảnh h−ởng của kháng sinh TA lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo D.salina Nồng độ (àg /ml) Thời gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 3 100% 100% 100% 1% ít 6 100% 100% 20% 0 0 Sau thời gian 6 ngày từ khi bổ sung TA vào môi tr−ờng nuôi cấy, l−ợng vi khuẩn trong dịch tảo đã đ−ợc loại bỏ hoàn toàn ở công thức có nồng độ kháng sinh 10 àg /ml. Thí nghiệm đã đ−ợc lặp lại nhiều lần và cho kết quả t−ơng tự. Vì vậy có thể khẳng định nồng độ TA 10àg /ml - 20àg /ml là thích hợp cho việc tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn trong dịch tảo Dunaliella salina. 28 Đối chứng NĐKS : 1.0àg/ml NĐKS: 2.5àg/ml NĐKS: 10àg/m ảnh 3: ảnh h−ởng của nồng độ TA lên sinh tr−ởng của vi khuẩn. Để xem xét khả năng sử dụng kháng sinh này trong việc làm sạch vi khuẩn ở tảo Dunaliella salina cần tìm hiểu ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo. Kết quả thu đ−ợc ở bảng 20, đồ thị 5 và bảng 21 cho thấy việc bổ sung TA vào môi tr−ờng nuôi cấy với nồng độ từ 0.5 àg /ml- 40àg /ml không làm ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của tảo Dunaliella salina, ng−ợc lại ở những công thức có bổ sung kháng sinh tảo sinh tr−ởng tốt hơn, mật độ OD của tảo cao hơn so với công thức không bổ sung TA. Đồ thị 5: ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo D.salina 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 1 2 4 6 8 11 13 15 18 20 22 24 Thời gian thí nghiệm (ngày) M ật đ ộ tế b ào (O D ) 0 àg/ml 0.5àg/ml 1àg/ml 1.5àg/ml 2.5àg/ml 29 Bảng 20 : ảnh h−ởng của TA đên sinh tr−ởng của tảo D. salina Mật độ tảo (OD) Nồng độ KS àg /ml Thời gian TN (ngày) 0 0.5 1.0 1.5 2.5 1 0.094 0.084 0.094 0.098 0.098 2 0.147 0.134 0.142 0.145 0.147 4 0.11 0.190 0.198 0.204 0.184 6 0.230 0.216 0.226 0.250 0.242 8 0.235 0.242 0.245 0.248 0.241 11 0.380 0.364 0.387 0.372 0.302 13 0.369 0.353 0.365 0.364 0.359 15 0.400 0.384 0.408 0.403 0.409 18 0.367 0.365 0.381 0.387 0.390 20 0.390 0.394 0.420 0.416 0.428 22 0.406 0.411 0.429 0.426 0.438 24 0.381 0.401 0.436 0.414 0.437 Từ các kết quả thu đ−ợc có thể khẳng định việc sử dụng TA bổ sung vào dịch tảo Dunaliella salina với nồng độ 10-20 àg /ml có tác dụng loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn nh−ng không làm ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của tảo Dunaliella salina. 30 Bảng 21: Sinh tr−ởng của tảo Duanliella salina trong môi tr−ờng có bổ sung TA Mật độ tảo (OD) Nồng độ àg /ml Thờigian (ngày) 0 1.0 2.5 10 20 40 2 0.122 0.120 0.120 0.120 0.102 0.106 4 0.131 0.129 0.134 0.132 0.111 0.122 6 0.140 0.147 0.152 0.157 0.141 0.162 8 0.148 0.139 0.168 0.166 0.151 0.169 10 0.157 0.179 0.206 0.247 0.219 0.224 12 0.170 0.182 0.225 0.267 0.228 0.233 14 0.183 0.184 0.265 0.293 0.233 0.262 Tiếp tục nghiên cứu ảnh h−ởng của TA lên việc loại bỏ vi khuẩn ở tảo N.oculata. Kết quả thu đ−ợc ở bảng 22 cho thấy TA với nồng độ 10àg /ml bổ sung vào môi tr−ờng sau 3 ngày đã có tác dụng loại bỏ hết vi khuẩn trong dịch tảo. Bảng 22 : Ảnh hưởng của TA lờn sự cú mặt của vi khuẩn trong dịch tảo N. oculata Nồng độ (àg /ml) Thời gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 3 100% 100% Rất ít 0 0 6 100% 20% 0 0 0 31 Nếu dùng nồng độ thấp (2.5àg /ml) sau 6 ngày trong dịch tảo đã hoàn toàn hết vi khuẩn. (Trong lúc đó đối với tảo Dunaliella salina với nồng độ TA 10àg /ml sau 6 ngày mới có thể loại bỏ đ−ợc hoàn toàn vi khuẩn). Bảng 23 : ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo N.oculata Nồng độ àg /ml Thờii gian (ngày) 0 1.0 2.5 10 20 40 2 0.182 0.183 0.181 0.170 0.169 0.168 4 0.237 0.236 0.231 0.239 0.226 0.226 6 0.254 0.248 0.248 0.259 0.237 0.228 8 0.299 0.292 0.296 0.300 0.309 0.279 10 0.374 0.354 0.348 0.353 0.370 0.341 12 0.393 0.356 0.354 0.368 0.370 0.353 14 0.432 0.393 0.374 0.394 0.401 0.370 Thí nghiệm đ−ợc tiến hành lặp lại nhiều lần và thu đ−ợc kết quả t−ơng tự. Nh− vậy có thể loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo Nannochloropsis oculata bằng cách bổ sung TA vào môi tr−ờng nuôi với nồng độ 2.5 àg /ml sau thời gian 6 ngày hoặc 10 àg /ml sau thời gian 3 ngày. Tuy nhiên để có thể sử dụng kết quả trên vào việc loại bỏ vi khuẩn, thu tảo Nannochloropsis oculata sạch khuẩn, cần xem xét mức độ ảnh h−ởng của kháng sinh TA lên sinh tr−ởng của tảo. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 23 cho thấy việc bổ sung TA với nồng độ 2.5 àg /ml hoặc 10àg /ml vào môi tr−ờng nuôi cấy không có ảnh h−ởng đáng kể đến 32 sinh tr−ởng của tảo. Mật độ tảo Nannochloropsis oculata (chỉ số OD) sau 6 ngày nuôi cấy ở công thức có bổ sung TA 2.5àg /ml và 10àg /ml là 0.248 và 0.259 so với công thức không bổ sung kháng sinh là 0.254 Từ kết quả trên cho thấy nồng độ TA từ 2.5 -10àg /ml (thời gian xử lý 6 ngày) có tác dụng loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo nh−ng không làm ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của tảo Nannochloropsis oculata. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 24 cho thấy khi bổ sung TA vào dịch tảo Isochrysis galbana với nồng độ từ 1-10 àg /m số l−ợng vi sinh vật trong dịch tảo đã giảm nhiều, tuy nhiên sau 13 ngày nuôi cấy dịch tảo vẫn còn vi khuẩn. Khi tăng nồng độ TA lên 20 àg /ml sau 3 ngày nuôi trong dịch tảo đã hoàn toàn sạch khuẩn. Bảng 24: ảnh h−ởng của TA lên việc loại bỏ vi khuẩn trong dịch tảo I. galbana Nồng độ àg /ml) Thời gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 40 3 100% 30% 10% Rất ít 0 0 6 100% 20% 5% 0 0 0 9 100% 20% 1% Rất ít 0 0 13 100% 20% 1% Rất ít 0 0 Kết quả thí nghiệm ở bảng 25 cho thấy việc bổ sung kháng sinh vào môi tr−ờng nuôi cấy tảo Isochrysis galbana với nồng độ từ 1-20 àg /ml trong thời gian 3-6 ngày không làm ảnh h−ởng nhiều đến sinh tr−ởng của tảo. Mật độ tảo ở các công thức thí nghiệm và đối chứng không có sai khác đáng kể. Khi tăng nồng độ TA lên 40àg /ml và kéo dài thời gian xử lý tảo sinh tr−ởng kém hơn nhiều so với đối chứng. 33 Bảng 25 : ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo I. galbana Nồng độ àg ml Thời gian (ngày 0 1 2.5 10 20 40 1 0.060 0.060 0.060 0.060 0.060 0.060 3 0.084 0.087 0.093 0.098 0.135 0.143 6 0.165 0.156 0.159 0.182 0.186 0.166 9 0.214 0.201 0.197 0.213 0.233 0.172 13 0.260 0.242 0.241 0.251 0.279 0.171 Nh− vậy từ kết quả thí nghiệm thu đ−ợc ở trên có thể khẳng định: Đối với tảo Isochrysis galbana việc bổ sung TA với nồng độ 20àg /ml vào môi tr−ờng nuôi cấy 3-6 ngày đã loại bỏ đ−ợc hoàn toàn vi khuẩn trong dịch tảo nh−ng không làm ảnh h−ởng nhiều đến sinh tr−ởng của tảo I.galbana. Tuy nhiên nếu tiếp tục nuôi tảo trong môi tr−ờng có kháng sinh, sinh tr−ởng của tảo sẽ giảm so với đối chứng (bảng 25). Vì vậy sau thời gian nói trên cần chuyển tảo sang môi tr−ờng mới không chứa kháng sinh để tảo I.galbana sinh tr−ởng tốt. Từ kết quả khả quan thu đ−ợc đối với tảo Dunaliella salina, Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, chúng tôi tiếp tục mở rộng thí nghiệm sử dụng TA bổ sung vào môi tr−ờng nuôi cấy nhằm làm sạch khuẩn đối với tảo Tetraselmis Chuii và Chlorella vulgaris. Kết quả thí nghiệm ở bảng 26 cho thấy khi bổ sung TA vào môi tr−ờng nuôi cấy Tetreselmis chuii với nồng độ 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5 àg /ml, chỉ có nồng độ 2.5 àg /ml là có hiệu quả diệt khuẩn và thời gian thí nghiệm phải kéo dài 20- 25 ngày. Vì vậy chúng tôi đã tăng nồng độ kháng sinh lên các mức 10, 20, 40àg/ml. 34 Bảng 26: ảnh h−ởng của TA lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo T. chuii Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 0 0.5 1 1.5 2.0 2.5 5 100% 100% 100% 100% 100% 100% 10 100% 100% 100% 100% 100% 100% 15 100% 100% 100% 30% 20% 10% 20 100% 20% 20% 10% ít 0 25 100% 20% 1% ít Rất ít 0 Bảng 27 : ảnh h−ởng của TA lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo T.chuii. (tiếp) Nồng độ (àg /ml) Thời gian (ngày) 0 2.5 10 20 40 3 100% 100% 30% 1% ít 6 100% 80% 0 0 0 Chúng tôi cũng đã tìm hiểu ng−ỡng nồng độ TA thích hợp để loại bỏ vi khuẩn khi sử dụng môt tr−ờng rắn. Kết quả trình bày ở bảng 28 cho thấy khi sử dụng môi tr−ờng nuôi cấy là môi tr−ờng thạch (rắn), l−ợng TA chỉ cần bổ sung với nồng độ thấp (2.5àg /ml) đã loại bỏ đ−ợc hoàn toàn vi khuẩn ra khỏi tảo. 35 Bảng 28 : ảnh h−ởng của nồng độ kháng sinh TA lên việc loại bỏ vi khuẩn (khi cấy trực tiếp dịch tảo T. chuii lên môi tr−ờng rắn có kháng sinh) Nồng độ (àg /ml) Thời gian (ngày) 0 2.5 10 20 40 3 100% 0 0 0 0 6 100% 0 0 0 0 Bảng 29 : ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng (OD) của tảo T.chuii Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 0 0.5 1.0 1.5 2.5 2 0.112 0.128 0.129 0.126 0.133 4 0.156 0.208 0.216 0.207 0.207 6 0.194 0.256 0.271 0.258 0.248 8 0.21 0.317 0.345 0.321 0.296 10 0.310 0.349 0.411 0.378 0.364 12 0.348 0.382 0.445 0.406 0.404 14 0.367 0.415 0.479 0.445 0.439 16 0.390 0.431 0.499 0.460 0.454 18 0.420 0.469 0.531 0.493 0.491 20 0.437 0.489 0.556 0.514 0.515 36 Kết quả theo dõi sinh tr−ởng của tảo T.chuii trong điều kiện có bổ sung kháng sinh đ−ợc trình bày ở bảng 29 và đồ thị 6 cho thấy việc bổ sung TA vào dịch tảo với nồng độ từ 0.5 -2.5àg /ml không có ảnh h−ởng xấu dến sinh tr−ởng của tảo. Ng−ợc lại ở công thức có bổ sung kháng sinh, sinh tr−ởng của tảo Tetraselmis chuii tốt hơn, mật độ (OD) tảo cao hơn so với công thức đối chứng (không bổ sung kháng sinh). Trong đó công thức có bổ sung TA 1àg /ml có ảnh h−ởng tốt đến sinh tr−ởng của tảo hơn so với các công thức còn lại (đồ thị 6). Đồ thị 6: ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng (OD) của tảo T.chuii. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian thí nghiệm (ngày) M ật đ ộ tế b ào ( O D ) 0 àg/ml 0.5àg/ml 1àg/ml 1.5àg/ml 2.5àg/ml Tiếp tục xem xét ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo Tetraselmis chuii khi tăng nồng độ kháng sinh trong dịch tảo lên 10, 20, 40àg /ml, chúng tôi nhận thấy tảo vẫn sinh tr−ởng tốt (bảng 30). Mật độ tảo ở các công thức thí nghiệm đều cao hơn so với công thức đối chứng (không có kháng sinh). Từ kết quả thu đ−ợc cho thấy: Đối với tảo Tetraselmis chuii có thể sử dụng TA nồng độ 2.5 àg/ml trong môi tr−ờng thạch và 10àg /ml trong môi tr−ờng lỏng để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn, thu tảo sạch khuẩn. 37 Bảng 30 : ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo T. chuii Nồng độ àg/ml Ngày 0 10 20 40 0 0.125 0.125 0.125 0.125 3 0.21 0.25 0.26 0.26 3 0.57 0.65 0.725 0.788 3 0.715 0.820 0.915 0.956 4 0.920 0.971 0.988 1.050 3 1.251 1.362 1.384 1.390 Bảng 31 : ảnh h−ởng của TA lên sự có mặt của vi khuẩn trong dịch tảo Ch.vulgaris Nồng độ àg/ml Thời gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 40 3 100% 30% Rất ít Rất ít 2-4 khuẩn lạc 0 6 100% 30% Rất ít 0 0 0 9 100% 30% 10% 1% 0 0 13 100% 30% 7% 1-2 khuẩn lạc 0 0 38 Đối với tảo Ch.vulgaris, việc bổ sung kháng sinh TA vào môi tr−ờng nuôi cấy từ 1 đến 20àg /ml đều có tác dụng hạn chế sự phát triển của vi khuẩn trong dịch tảo, nh−ng để loại bỏ đ−ợc hoàn toàn vi khuẩn khỏi tảo cần bổ sung TA với nồng độ 20àg /ml, thời gian nuôi cấy 6 ngày (bảng 31).Nếu sử dụng TA nồng độ cao hơn (40àg /ml), thời gian nuôi cấy chỉ cần 3 ngày đã có thể thu đ−ợc tảo sạch khuẩn. Tuy nhiên để xác định nồng độ TA thích hợp sử dụng cho tảo Ch.vulgaris cần xem xét ảnh h−ởng của kháng sinh này lên sinh tr−ởng của tảo. Kết quả thí nghiệm đ−ợc trình bày ở bảng 32 và đồ thị 7 cho thấy tảo Ch.vulgaris đ−ợc bổ sung TA với nồng độ từ 1-40 àg /ml sinh tr−ởng nhanh hơn, mật độ OD của tảo ở các công thức thí nghiệm đều cao hơn nhiều so với công thức không đ−ợc bổ sung TA. Sau 14 ngày thí nghiệm ở công thức có bổ sung TA 20àg /ml và 40àg /ml, mật độ OD của tảo Ch.vulgaris là 0.323 và 0.386 so với đối chứng là 0.295. Bảng 32 : ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo Ch.vulgaris. Nồng độ àg /ml Thời gian (ngày) 0 1 2.5 10 20 40 1 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 0.128 3 0.164 0.180 0.203 0.209 0.245 0.348 7 0.232 0.250 0.263 0.253 0.266 0.295 10 0.286 0.298 0.312 0.290 0.305 0.383 14 0.295 0.320 0.332 0.324 0.323 0.386 39 Đồ thị 7: ảnh h−ởng của TA lên sinh tr−ởng của tảo Ch.vulgaris 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 1 3 7 10 14 Thời gian thí nghiệm (ngày) M ật đ ộ tế b ào ( O D ) 0 àg/ml 1 àg/ml 2.5 àg/ml 10 àg/ml 20 àg/ml 40 àg/ml Từ những kết quả thu đ−ợc ở trên cho thấy có thể sử dụng TA nồng độ 20àg /ml để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn trong dịch tảo Ch.vulgaris. Nh− vậy TA có tác dụng rất tốt trong việc loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tảo để thu tảo sạch khuẩn. Nồng độ TA thích hợp với từng chủng tảo khác nhau: D.salina 10- 20àg /ml; N.oculata 2.5àg /ml; I.galbana 20àg /ml; T.chuii 10àg/ml và Ch.vulgaris 20àg /ml. III.3. Nghiên cứu bảo quản tảo bằng kĩ thuật làm bất động. Nguyên tắc của ph−ơng pháp là cố định tảo trong gel ở dạng hạt và bảo quản ở nhiệt độ thích hợp trong điều kiện không có ánh sáng. Sau thời gian bảo quản, tế bào tảo đ−ợc giải phóng bằng cách hoà tan các hạt gel và nuôi trong điều kiện thích hợp để tảo sinh tr−ởng. Để tìm đ−ợc ph−ơng pháp bảo quản thích hợp đối với các chủng tảo nghiên cứu: Dunaliella salina. Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Tetraselmis chuii và Chlorella vulgaris, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm một số ph−ơng pháp sau: 1. Sử dụng chất tạo gel nồng độ 3%(1), giải đông bằng chất chứa phosphate(1). 2. Sử dụng chất tạo gel nồng độ 1.5%(2), giải đông bằng muối citrate(2) Kết quả thí nghiệm ở bảng 33 cho thấy ở công thức 1 tảo Ch.vulgaris 40 đ−ợc bảo quản bằng chất tạo gel nồng độ 3% (1) và sử dụng chất giải đông là hợp chất chứa phosphate (1), hạt tảo đ−ợc hoà tan chậm, sau 4 giờ l−ợng hạt hoà tan khoảng 90% và 100% số hạt đ−ợc hoà tan hết sau 45-50 gìơ. Dịch tan ở dạng gel, sau đó dịch tảo bị đục, tảo sinh tr−ởng kém. Bảng 33: Kết quả thử nghiệm bảo quản giống tảo. Công thức Giống tảo Nồng độ chất bảo quản Chất giải đông Nhận xét 1. 2. 3. Ch.vulgaris Ch.vulgaris Ch.vulgaris (1) (2) (2) (1) (1) (2) Hạt tảo tan rất chậm (sau 45- 50 giờ). Dịch tảo đục, tảo sinh tr−ởng kém. Hạt tảo tan sau 4h, dịch tảo ở dạng gel, đục, tảo sinh tr−ởng kém Hạt tảo tan nhanh (sau 28 phút). Dịch tảo trong, không xuất hiện thể gel, tảo hồi phục nhanh ở công thức 2, tảo đ−ợc bảo quản bằng chất tạo gel nồng độ 1,5%(2), sau đó đ−ợc giải đông bằng hợp chất chứa phosphate (1) tảo tan hết sau 4h, dịch tảo ở dạng gel, đục. Tiếp tục theo dõi sinh tr−ởng của tảo sau khi giải đông cho thấy tảo hồi phục chậm, sinh tr−ởng kém. ở công thức 3 tảo đ−ợc bảo quản bằng chất tạo gel nồng độ 1.5%(2), sau khi bảo quản, hạt tảo đ−ợc hoà tan bằng muối citrate (2). Kết quả cho thấy sau 28 phút, toàn bộ số hạt tảo hoà tan hết, dịch trong, không xuất hịên thể gel, tảo phục hồi tốt. Tiếp tục thử nghiệm với các chủng tảo Dunaliella salina, Nanochloropsis oculata, Isochrrysis galbana và Tetraselmis chuii, chúng tôi cùng thu đ−ợc kết quả t−ơng tự. 41 Qua những kết quả thu đ−ợc cho thấy sử dụng chất tạo gel nồng độ 3% hoặc 1,5% đều có thể tạo các hạt tảo có kích th−ớc và độ cứng đạt yêu cầu (ảnh 6). Tuy nhiên khi giải đông để giải phóng tế bào tảo, dùng muối citrate tốt hơn muối phosphate, dịch tảo thu đ−ợc sau khi đ−ợc giải đông không bị đục, tảo phục hồi nhanh. Kết quả thử nghiệm cũng cho thấy nồng độ chất tạo gel 3% hoặc 1.5% không có ảnh h−ởng đáng kể đến thời gian hoà tan hạt tảo khi giải đông. Tuy nhiên với nồng độ chất tạo gel 1.5%, dịch tảo sau khi giải đông trong hơn, thuận lợi cho sinh tr−ởng của tảo. Vì vậy nên sử dụng chất tạo gel nồng độ 1.5% để bảo quản tảo . Sau khi bảo quản hoà tan hạt tảo bằng muối citrate. Hạt tảo sau khi hoà tan đ−ợc bổ sung môi tr−ờng dinh d−ỡng và đặt tảo d−ới ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp để tảo sinh tr−ởng, sau đó kiểm tra trạng thái tế bào và hoạt động sinh lí của tảo. Kết quả cho thấy sau bảo quản, tế bào tảo vẫn còn nguyên vẹn, kích th−ớc tế bào tảo nhỏ hơn tế bào đối chứng, lục lạp và các cơ quan tử lệch về một phía (ảnh 4, trang 44 ), tảo ít di chuyển. Tiếp tục kiểm tra trạng thái của các tế bào tảo sau khi hoà tan và nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu, nhiệt độ thấp trong 6 ngày. Kết quả cho thấy: tảo có màu xanh hơn, kích th−ớc tế bào to dần, phần lớn số tế bào tảo có dạng đặc tr−ng, tế bào tảo trở lại trạng thái bình th−ờng, chuyển động nhanh hơn. Sau 10-15 ngày, các tế bào tảo phục hồi bắt đầu sinh tr−ởng tốt. Tuy nhiên chúng tôi cũng nhận thấy các kết quả thí nghiệm ở các lần lặp lại không giống nhau và phụ thuộc rất nhiều điều kiện thí nghiệm nh−: mật độ tảo đ−a vào bảo quản, điều kiện gây nuôi sau khi bảo quản (ánh sáng, nhiệt độ môi tr−ờng, dinh d−ỡng...).Vì vậy việc nghiên cứu các điều kiện gây nuôi tảo sau khi bảo quản là hết sức cần thiết. III.4.ảnh h−ởng của một số điều kiện lên sinh tr−ởng của tảo sau khi bảo quản. III.4.1 ảnh h−ởng của mật độ tảo lên kết quả bảo quản. Chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm để tìm hiểu ảnh h−ởng của mật độ tảo đ−a vào bảo quản lên sinh tr−ởng và phát triển của tảo sau khi bảo quản. Kết 42 quả cho thấy mật độ tảo khi đ−a vào bảo quản có vai trò rất quan trọng đối với sinh tr−ởng của tảo sau khi bảo quản.ở các công thức có mật độ tảo trong môi tr−ờng bảo quản là 102, 103 tế bào/ml, sau khi giải đông tảo th−ờng bị vàng, sinh tr−ởng kém và chết. ở những công thức có mật độ tảo bảo quản đạt 105, 106 tế bào/ml; sau khi bảo quản, tảo phục hồi nhanh, sinh tr−ởng tốt. Vì vậy để thu đựoc giống tảo có chất l−ợng tốt, mật độ tảo đ−a vào bảo quản cần đạt 105, 106 tế bào/ml. III.4.2.Nghiên cứu ảnh h−ởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh tr−ởng của tảo sau khi bảo quản. Nhằm tìm hiểu điều kiện thích hợp, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm gây nuôi tảo sau khi bảo quản trong các điều kiện nh− sau: T1: Nuôi trong điều kiện nhiệt độ 15-17oC, ánh sáng 1000 - 15000 lux, thời gian chiếu sáng 24/24h. T2: Nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25-28oC, c−ờng độ ánh sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng 8/24h. Kết quả bảng 34 cho thấy: ở công thức T1, tảo phục hồi nhanh, sau 10 ngày gây nuôi trong điều kiện nhiệt độ thấp 15-17oC, c−ờng độ chiếu sáng 1000- 1500 lux, hình thái tế bào trở lại trạng thái bình th−ờng, tảo sinh tr−ởng tốt. ở công thức T2, tảo sau khi bảo quản đ−ợc gây nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25- 28oC, c−ờng độ chiếu sáng 3000 lux. Khả năng hồi phục của tảo chậm. Sau 20 ngày nuôi cấy trong điều kiện nói trên, các chủng tảo đều phát triển kém, dịch tảo xuất hiện tủa, tảo nhạt màu dần và chết. Từ kết quả thu đ−ợc cho thấy việc duy trì nhiệt độ thấp (15-17oC) là điều kiện tối cần thiết để phục hồi khả năng sinh tr−ởng tốt của tảo sau khi bảo quản. Chúng tôi cũng đã tiến hành thử nghiệm ảnh h−ởng của môi tr−ờng dinh d−ỡng lên sinh tr−ởng của tảo sau khi bảo quản. Kết quả cho thấy sau khi bảo quản, tảo đ−ợc gây nuôi trong môi tr−ờng F/2 thích hợp hơn môi tr−ờng G/3. 43 Bảng 34: ảnh h−ởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh tr−ởng của tảo sau khi bảo quản (tảo Tetraselmis chuii). Thời gian nuôi sau khi bảo quản. T1 T2 Sau khi giải đông Tế bào có kích th−ớc nhỏ hơn tế bào bình th−ờng (không bảo quản), nguyên vẹn, các nội bào quan bị lệch về một phía. Tế bào có kích th−ớc nhỏ hơn tế bào đối chứng (không bảo quản), trạng thái tế bào nguyên vẹn, các nội bào quan lệch về 1 phía. 3 ngày Tế bào có kích th−ớc lớn hơn, nội bào quan không bị lệch. Tế bào kích th−ớc nhỏ, nội bào quan vẫn lệch. 6 ngày Tế bào có kích th−ớc bình th−ờng, xuất hiện dạng tế bào đặc tr−ng của tảo T.chuii Tế bào có kích th−ớc nhỏ, nội bào quan không bị lệch. 10 ngày Phần lớn tế bào có kích th−ớc bình th−ờng, có dạng đặc tr−ng của tảo T. chuii Tế bào có kích th−ớc nhỏ, nhân không bị lệch, ch−a có hình dạng đặc tr−ng. 20 ngày Tế bào tảo phát triển bình th−ờng, không có khác biệt so với tế bào đối chứng (không qua bảo quản) Phần lớn tế bào có kích th−ớc nhỏ, đã có hình dạng đặc tr−ng của tảo T.chuii, môi tr−ờng bắt đầu bị đục Nh− vậy việc bảo quản các chủng tảo nghiên cứu bằng kĩ thuật cố định mẫu trong gel, sau đó giải đông và nuôi trong điều kiện nhiệt độ 15-17oC và ánh sáng 1000-2000 lux, sau thời gian từ 10-20 ngày, các tế bào tảo phục hồi, sinh tr−ởng tốt (ảnh 5, ảnh 7). Việc cố định mẫu bằng kĩ thuật làm bất động và bảo quản ở nhiệt độ 4oC vẫn duy trì đ−ợc trạng thái nguyên vẹn của tế bào và hoạt động sinh lí của tảo. Tuy sau khi bảo quản một số chủng tảo có kích th−ớc lớn nh− T.chuii hình thái tế bào có một số thay đổi so với đối chứng: hình dạng không đặc tr−ng, nhân tế bào lệch về một bên. Những thay đổi trên sẽ đ−ợc phục hồi, tế bào sinh tr−ởng và phát triển bình th−ờng sau khi đ−ợc nuôi trong điều kiện thích hợp về ánh sáng và nhiệt độ. Đối với các chủng tảo còn lại: D.salina, N.oculata, I.galbana, 44 Chlorella vulgaris, hình thái tế bào sau khi bảo quản không có khác biệt so với tảo đối chứng ảnh 4: Tế bào T.chuii ngay sau khi giải đông ảnh 5: Tế bảo tảo T.chuii sau khi giải đông 1 tuần ảnh 6: Tảo bảo quản ở dạng hạt. 45 ảnh 7: Bình tảo đối chứng và sau bảo quản (T.chuii) 1: Tảo đối chứng 2: Tảo đ−ợc gây nuôi theo công thức T1. 3: Tảo đ−ợc gây nuôi theo công thức T2. Từ những kết quả thu đ−ợc cho thấy việc phân lập tảo thông qua công đoạn làm sạch sơ bộ và ly tâm tách tảo đã giảm bớt thời gian phân lập cũng nh− việc tìm đ−ợc loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tảo nh−ng không ảnh h−ởng đến sinh tr−ởng của tảo đã giúp thu đ−ợc nguồn tảo sạch khuẩn, đảm bảo chất l−ợng giống trong quá trình giữ giống cũng nh− nhân nuôi sinh khối, tránh tình trạng giống bị vón cục, lắng làm giảm năng suất, chất l−ợng tảo. Các kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm là những loại kháng sinh thông dụng: Tetracycline và Peflacine là những kháng sinh thuộc nhóm quinon có tác động rộng, có hiệu quả chống lại nhiều loại vi khuẩn, cả gram âm, gram d−ơng. Tuy nhiên khi dùng Tetracycline không thu đ−ợc kết quả do Tetracycline bị hấp thu trong n−ớc có độ cứng cao. Ngoài ra Canxi và Magiê trong môi tr−ờng liên kết với Tetracycline làm cho kháng sinh mất hoạt tính. Vì vậy Tetracycline không có hiệu quả khi cho vào môi tr−ờng lỏng nuôi tảo. Mặt khác Tetracycline rất nhạy cảm với ánh sáng và chuyển thành màu nâu khi bị phân huỷ, điều này làm giảm chất l−ợng môi tr−ờng. Ngoài ra, để thu đ−ợc kết quả th−ờng phải tăng 46 nồng độ kháng sinh này lên trên mức cần thiết. Điều này có thể dẫn đến một số vi khuẩn kháng Tetracycline (Nusbawm and Shotts,1981). Erythromycine là kháng sinh chống lại các vi khuẩn gram d−ơng rất hiệu quả. Tuy nhiên trong môi tr−ờng nuôi tảo có sử dụng n−ớc biển, đây là môi tr−ờng thích hợp cho vi khuẩn gram âm phát triển. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy đa số vi khuẩn biển là vi khuẩn gram âm, 80% số loài tìm thấy ở vùng biển Nam Califonia là gram âm. Với các khuẩn lạc phát triển trên đĩa thạch có chứa n−ớc biển phần lớn là vi khuẩn gram âm (Zobll và cộng sự,1994; Purushothaman A, 1999). Tác giả Nguyễn Thị Thu Hà (2002) khi nghiên cứu vi khuẩn dị d−ỡng phân lập từ đất rừng ngập mặn của tỉnh Nam Định cũng cho thấy 80% số vi khuẩn phân lập đ−ợc là vi khuẩn gram âm. Vì vậy Erythromycine không có hiệu quả khi sử dụng với mục đích loại bỏ vi khuẩn ở các chủng tảo thí nghiệm. Trong các kháng sinh đã nghiên cứu, kháng sinh kí hiệuTA là có hiệu quả tốt. Đây là loại kháng sinh có phổ tác động rộng rất phù hợp cho việc loại bỏ vi khuẩn ra khỏi các chủng tảo nghiên cứu để thu tảo sạch khuẩn. Việc nghiên cứu thành công ph−ơng pháp bảo quản tảo bằng kĩ thuật làm bất động đối với các chủng tảo Dunaliella salina, Nannochloropsis oculata, Tetraselmis chuii, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris sẽ giúp những ng−ời làm nghiên cứu về tảo, nhân nuôi tảo tại các trại giống nuôi trồng thuỷ sản chủ động đ−ợc nguồn giống tảo, giảm đ−ợc chi phí nhân công và thời gian, giảm chi phí sản xuất.Việc giữ giống tảo trở nên đơn giản, hiệu quả, giảm nguy cơ bị nhiễm bẩn, bảo toàn đ−ợc giống với chất l−ợng tốt. Giống bảo quản bằng ph−ơng pháp này có thể giữ đ−ợc thời gian lâu dài mà không bị ảnh h−ởng đến chất l−ợng. 47 17-18oC, AS 1000-1500 lux Lọc Ly tâm Pha loãng Pha loãng tiếp (1 tế bào/1 ml) Cấy lên đĩa thạch Thu mẫu tảo Cấy vào ống nghiệm để tảo sinh tr−ởng Kiểm tra, chọn ống nghiệm có tảo mong muốn Chọn khuẩn lạc mong muốn Cấy vào môi tr−ờng lỏng Kiểm tra cấy lặp lại trên đĩa thạch đến khi thu đ−ợc tảo thuần Nhân sinh khối Xử lý kháng sinh 17-18oC, AS 1000-1500 lux, thời gian 15-20 ngày 17-18oC, AS 1500- 2000lux Cố định mẫu, bảo quản ở 4 oC, trong tối Giải đông Nhân sinh khối tảo Sản xuất tảo Nuôi con giống Giữ giống trong thạch và môi tr−ờng lỏng Quy trình bảo quản và phân lập tảo 48 Phần IV: Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu thu đ−ợc chúng tôi đ−a ra một số kết luận nh− sau: 1. Đã xác định đ−ợc tốc độ và thời gian ly tâm thích hợp đối với từng chủng tảo nghiên cứu từ đó tiến hành làm sạch sơ bộ bằng cách lọc và ly tâm tách tảo. Vì vậy rút ngắn đ−ợc thời gian phân lập so với tr−ớc. 2. Phân lập đ−ợc 5 chủng tảo thuần: Dunaliella salina, Tetraselmis chuii, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chlorella vulgaris 3. Đã nghiên cứu sử dụng một số loại kháng sinh để loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tảo. Kết quả cho thấy Tetracycline và Peflacine ít có hiệu quả đối với việc loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tảo khi bổ sung vào môi tr−ờng lỏng. Vì vậy chỉ nên sử dụng peflacine để bổ sung vào môi tr−ờng thạch với nồng độ từ 20-40àg/ml để giữ giống tảo Nanochloropsis oculata, Isochrysis galbana, với nồng độ 80àg/ml để giữu giống tảo Dunaliella salina. Peflacine không thích hợp đối với tảo Chlorella vullgaris và Tetraselmis chuii. 4. Erythromycine không có tác dụng loại bỏ vi khuẩn ra khỏi các chủng tảo nghiên cứu. Mặt khác kháng sinh này có ảnh h−ởng không tốt lên sinh tr−ởng của tảo. Vì vậy không nên sử dụng Erythromycine với mục đích diệt khuẩn để thu đ−ợc tảo sạch khuẩn. 5. Đã xác định đ−ợc loại kháng sinh thích hợp để loại bỏ vi khuẩn ra khỏi tảo kí hiệu là TA. Nồng độ TA thích hợp đối với từng chủng tảo khác nhau: Dunaliella salina: 10-20àg/ml; Nanochloropsis oculata: 2.5àg/ml; Isochrrysis galbana: 20àg/ml; Tetraselmis chuii: 10àg/ml và Chlorella vulgaris: 20àg/ml. Thời gian xử lí 6 ngày. 6. Đã nghiên cứu đ−a ra ph−ơng pháp bảo quản bằng kĩ thuật làm bất động trong gel đối với 5 chủng tảo nghiên cứu: -Xác định đ−ợc nồng độ chất tạo gel thích hợp là 1.5%. Chất giải đông là muối citrate. - Mật độ tảo đ−a vào bảo quản thích hợp là 106 tế bào/ml. - Điều kiện thích hợp để gây nuôi tảo sau khi bảo quản là nhiệt độ 15-17oC, ánh sáng 1000-2000 lux, môi tr−ờng dinh d−ỡng thích hợp là F/2. 49 Tảo sau khi bảo quản trong gel ở nhiệt độ 4oC, trong điều kiện không có ánh sáng vẫn giữ đ−ợc trạng thái nguyên vẹn và đặc tính sinh lí, phục hồi và sinh tr−ởng tốt. Kỹ thuật bảo quản tảo bằng cách làm bất động lần đầu tiên đ−ợc nghiên cứu ứng dụng tại Việt nam. 50 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Hoàng Tích Huyền (2001). H−ớng đẫn sử dụng kháng sinh. Nhà xuất bản y học, tr 18-30. 2. HoàngThị Kim Hoa và các cộng sự (2003). Nghiên cứu hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất một số loài vi tảo (Duanaliella salina và Tetraselmis chuii)phục vụ nhân nuôi một số loài cá biển (các song, cá giò)tại Cát Bà Hải Phòng. Báo cáo đề tài cấp Bộ. 3. Đặng Xuyến Nh−, Hoàng Thị Kim Hoa và các cộng sự (1995). Nghiên cứu qui trình công nghệ tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn vi tảo để phục vụ dinh d−ỡng ng−ời và động vật (1995). Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Nhà n−ớc (KC-08-12) thuộc ch−ơng trình công nghệ sinh học. 4. Đặng Xuyến Nh− và các cộng sự (1997). Nghiên cứu các điều kiện nuôi trồng tối −u nhằm thu sinh khối tảo giàu -caroten. Báo cáo đề tài cấp cơ sở. 5. Thông tin khoa học công nghệ-kinh tế thủy sản 2/2004. Trang 13-16. 6. Thông tin khoa học công nghệ-kinh tế thủy sản 3/2004. Trang 29-30. Tiếng Anh 1. Alekhina GP; Bukharin O.V; Nemseva N.V; Shabanov S.V (2001). Method of isolation of Microalgal axenic Culturre. Patent number RU 2164940 date 10/4/2001. 2. Aliza L.H and Johnston T.C (1999). Diversity of culturable heterotrophic aerobic bacteria in pristine bed sediment. Canadian Journal of Microbiology, 45, pp.879-884. 51 3. Brown, Mr (1991). The amino acid and sugar composition of 16 species of microalgae use in maricultur. Journal of Experimental marine Biology and Ecology; 145: 79-99. 4. Brown, Mr ; Miller K.A (1992). The ascorbic acid content of eleven species of microalgae used in mariculture. Journal of Appiled Phycology, 4: 205 - 215 5. Brown Mr; Je-frey, S.W; Vikman, J.K, Dunstan, G.A (1997). Nutritional properties of microalgae for mariculture, Aquaculture, 151: 315-331. 6. Brown et al (1999). The vitamin content of microalgae use in aquaculture. Journal of Appiled Phycology, 11:247-255. 7. Hong quan Liu et al (2004). Cryopreservation of protoplasts of the algal porphyza yezoensis by vitrification. Plant science 166: 97-102. 8. Gerllof GC; Fitzgerald GP; Skoog F. (1950). The isolation purification and culture of blue-green. Amer.J. Vol. 37 p.216. 9. Gorbenko Lu. A(1961). Naiboleic blogopriatnoie Kolichesvo "Succhovo pitatelnovo agara" Sredi dlia kuntivirovania morskich getherotrophnich microorganizmov. Microbiologia, Kiev, T30, V.1. st: 168-172. 10. Kbutko K.B (1961). Polytenhie culture otdelnic kletok chlorella 11. Knuckey, R.M et al (2002). Isolation of new nanoplanktonic diatom strains and they evalution as diets for the juvennile pacific oyster Aquaculture. 12. Malcolm R. Brown (1999). Nuritional Value and use of Microalgae in Aquacult. Malcolm. Brown@criro.au 13. Pedro Canavate, Luis M Lubinn (1995). Some aspects on the cryopresevation of microalgae use as food for marine species. Aquaculture 136: 277-290. 14. Purushothaman A(1999). Microbial diversity. Cauter of Advanced study in Marine Biology. Annamalai University, India, pp.6-20. 15. Rheinheimer. G(1985). Vi sinh vật học các nguồn n−ớc (Kiều Hữu ảnh dịch), Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật. 52 16. Renaud, S.M et al (1999). The gross composition and fatty acid composition of 18 species of tropical Australian microalgae for possoble use marinculture. Aquaculture 170: 147-155. 17. Susana Romo and Carmen Peres Martiner (1997). The use immobilization in alginate beads for long term storage of pseudanabaena galeata (Cyanobacteria) in the laboratory. J.phycol 33;1073-1076. 18. Stein (1973). Handbook of phycological Methods. Culture methods and growth measurements. Cambridge university press. 19. Tran Van Tran, Le Xan(2001). Some of studies results on reproductive charactieristies and Technology of seed production of Greasy-Back Shrimp (Metapenaeus Ensis de Haan 1844). In proceedings of Marine fisheries reseach. VII.406-418 20. Yean. Chan Chen (2003). Immobilized Haptophyta for long term srorage and application for feeds and water quality control in clam culture. 21. Zobell C., Upham 4. (1944). A list of marine bacteria includeing description of sixty new species. Bull Scripps Inst,Oceanogr.