Báo cáo Tham quan quy trình sản xuất thuốc tại nhà máy số 2 – công ty cổ phần mediplantex và khảo sát công nghệ sản xuất vaccine tại xí nghiệp thuốc thú y TW

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THU HOẠCH (Ngành Y tế- Môi trường) Đề tài: THAM QUAN QUY TRÌNH SẢN XUẤT THUỐC TẠI NHÀ MÁY SỐ 2 – CÔNG TY CP MEDIPLANTEX. & KHẢO SÁT CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACCINE TẠI XÍ NGHIỆP THUỐC THÚ Y TW. Giáo viên hướng dẫn: T.s Nguyễn Thị Tâm. Sinh viên : Trần Thị Giang. Lớp: CĐ.08-02 Hà Nội 4/2011 MỤC LỤC Lời cảm ơn! Trong quá trình học tập và tìm hiểu thực tế , em vô cùng biết ơn sự giảng dạy và hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô đã giúp chúng em gắn kết và hình dung được phần nào giữa lý thuyết và thực tế. Xin gửi tới các thầy giáo, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, lời chúc sức khỏe và công tác tốt! Sinh viên : Trần Thị Giang. MỞ ĐẦU Ngày nay Công nghệ sinh học đang được coi là một trong 5 ngành công nghệ tiên phong của nhân loại tiến vào thế kỷ 21. Trong đó , công nghệ vi sinh vật học sản xuất các kháng sinh, vacxin, vitamin và các hoạt chất ứng dụng trong y học, thực phẩm , nông nghiệp…đang có những bước tiến vượt bậc. Ở các nước phát triển trên thế giới thì việc ứng dụng các tiến bộ di truyền học trong phân lập, sàng lọc, cải tạo giống cho phép tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học với hiệu suất ngày càng cao. Trình độ tự động hóa, tin học hóa cao cho phép xây dựng được các hệ thống sản xuất ổn định với hiệu suất tối ưu. Cùng với các giải pháp công nghệ mới giúp tiết kiệm mặt bằng và nhân công, bảo vệ môi trường sinh thái. Ở Việt Nam, tuy chưa thể đưa công nghệ vi sinh vật ứng dụng trong lên men sản xuất kháng sinh do một phần khiêm tốn về vốn đầu tư bởi đây cũng là ngành có nhiều thách thức và mang tính cạnh tranh khốc liệt trên quy mô toàn cầu, nhưng cũng có nhiều công ty ( bao gồm cả Nhà nước và Tư nhân) sản xuất, hoàn thiện rất nhiều lọai thuốc, các dược phẩm, lên men sản xuất vacxin…v.v.. có uy tín nhiều năm nay. Nhà máy Dược phẩm số 2 thuộc công ty CP Mediplantex , Xí nghiệp thuốc Thú y TW là hai trong số những thương hiệu nhiều năm đã được cả trong nước và nhiều nơi trên thế giới công nhận. PHẦN 2. Đại cương về kháng sinh , vacxin & công nghệ lên men sản xuất kháng sinh ,công nghệ sản xuất vacxin. Đại cương về kháng sinh và công nghệ lên men sản xuất kháng sinh. Định nghĩa kháng sinh: Dựa theo định nghĩa kinh điển của Walksmann (1942), thì ngày nay, các nhà khoa học đã cho ra khái niệm về kháng sinh có thể nói là khá chặt chẽ. : “ kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp của vi sinh vật, hoặc có nguồn gốc thực vật, hoặc tổng hợp theo con đường hóa học ,có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác. Đơn vị kháng sinh: Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính của kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đv/ml) hay 1mg chế phẩm (đv/mg) thường dùng đơn vị kháng sinh. Đó chính là một lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thể tích môi trường xác định có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định. Đơn vị quốc tế là IU. VD: 1IU penicillin G = 0.6µg (1mg =1667IU), 1IU Streptomycin = 1µg ( 1mg = 1000IU), 1mg neomycin chứa 300 IU (1 IU = 3,3µg)… Phân loại kháng sinh: Danh sách các kháng sinh được phát hiện ngày càng nhiều, việc phân loại kháng sinh là cần thiết vì nó giúp các nhà nghiên cứu tốn ít thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hóa học , cơ chế tác động, độc tính.. Có thể phân loại kháng sinh theo các cách: - Phân loại theo nguồn gốc kháng sinh: do xạ khuẩn, vi khuẩn, vi nấm (nấm mốc, nấm men) tạo ra. - Phân loại theo cơ chế tác dụng : kháng sinh tác dụng lên thành tế bào , kháng sinh tác động lên quá trình tổng hợp protein, tổng hợp DNA, mRNA… - Phân loại theo cấu trúc hóa học: đây là cách phân loại khoa học nhất . Theo đó , các chất kháng sinh được chia làm nhiều nhóm. +) Các chất kháng sinh chứa hydratcacbon ( đường tinh khiết, aminoglycosid, N-glycosid, glycopeptid ): streptomycin, eveaninomicin, vancomycin,moenomicin… +) Các lactomacrocylic ( chất kháng sinh macrolid polien , macrotetrolit, azamycin) : rifamycin, tetranactinerythromycin, nystatin.. +) Các kháng sinh quinon và dẫn xuất: tetracylin, adriamycin, actinorodin… +) Các kháng sinh peptid và các acid amin : cycloloserin, penicillin, bacitracin, actinomycin, bleomycin.. +) Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ: các kháng sinh nucleoside (polysome)… +) Các kháng sinh mạch vòng no : các chất ankan, kháng ainh steroid : cycloheximic, axit fuzidic.. +) Các kháng sinh chứa nhân thơm : chloramphenicol, gliseofulvin, novobiocin… +) Các kháng sinh mạch thẳng: phosphomycin.. Cơ chế tác dụng của kháng sinh: Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh. Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hoặc các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất. Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh , tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết hết chính xác. Có 6 mức tác dụng khác nhau đối với tế bào vi khuẩn hoặc nấm: thành tế bào, màng tế bào, tổng gen( sao chép và phiên mã) tổng hợp protein, dịch mã mRNA , chao đổi chất hô hấp và trao đổi chất trung gian. Một số ví dụ về cơ chế tác dụng của kháng sinh Mức tác dụng Ví dụ Tổng hợp thành tế bào: Transpeptid hóa Tổng hợp murein β-lactam (penicillin) Vancomycin, phosphomycin, cycloserin,bacitracin Màng nguyên sinh Thay đổi cấu trúc Thay đổi chức năng Polymixin, amphotericin, polyen, gramicidin, sideromycin. valinomycin DNA Phân chia Dịch mã Actinomycin ,antracyclin, rifamicin Tổng hợp protein Ribosome Liên kết t-RNA Kéo dài Aminogucosid , macrolid( erythromycin) chlorocid, tetracycline, acid fuzidic Trao đổi chất hô hấp Antimycin , oligomycin Trao đổi chất folat Sulfamid … Tính kháng kháng sinh: Khái niệm “ tính kháng thuốc” lần đầu tiên được đề cập ở Nhật bản (1959-1960). Nguyên nhân chính của hiện tượng kháng thuốc ở các vi sinh vật vốn nhạy cảm là do chúng ta sử dụng thuốc bừa bãi. Định nghĩa tính kháng thuốc : kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn dưới tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu. Có hai kiểu kháng thuốc : Kháng thuốc tự nhiên: là một đặc trưng của một nòi vi sinh vật nhất định dối với một số kháng sinh nhất định nào đó, tính chất này có từ trước khi sử dụng kháng sinh.Điều này liên quan đến phổ tác dụng của kháng sinh. Ví dụ: proteus kháng các tetracyclin, trực khuẩn G- kháng các penicillin G, streptococcus nhóm D kháng lincomycin. Về mặt sinh hóa thì đó là do : tính thấm của tế bào và sự thiếu vắng phân tử đích. Kháng thuốc mới nhận: Xuất hiện trong chọn lọc tự nhiên các chủng đề kháng của quần thể vi sinh vật nhạy cảm khi sử dụng kháng sinh. Một vi sinh vật trở thành kháng thuốc khi phát triển được với hàm lương cao đáng kể của kháng sinh ấy so với quần thể vi sinh vật mà nó có nguồn gốc. Về mặt cơ chế di truyền học có 2 nguyên nhân chính: - Do đột biến NST, kiểu này chiếm 10% vi sinh vật kháng thuốc. Ví dụ : β-lactam, aminosid, cloramphenicol, rifamycin… - Do nhân tố di truyền Plasmid: kiểu kháng thuốc này rất phổ biến ( chiếm 90% vi sinh vật kháng thuốc). Plasmid có thể được lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác qua các cơ chế : biến nạp, tải nạp, tiếp hợp… Về cơ chế sinh hóa của kháng thuốc mới nhận có 4 cơ chế chính: + Thay đổi tính thấm thành tế bào. + Vô hiệu hóa các kháng sinh bằng enzyme, acetyl hóa, phosphoryl hóa khiến cho các aminosid bị biến đổi , làm chúng không qua được thành tế bào. + Thay đổi phân tử đích ( đích tác dụng của kháng sinh). + Xây dựng con đường trao đổi chất mới mà kháng sinh không tác dụng. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh: 2.1.6.1 Khái quát hóa quá trình lên men tổng hợp kháng sinh: Các sản phẩm trao đổi chất bậc một gắn liền với quá trình sinh trưởng, xảy ra trong thời gian sinh trưởng và còn kéo dài sau khi sinh trưởng đã kết thúc. Các sản phẩm trao đổi chất bậc hai (sản phẩm trao đổi chất thứ cấp) là các sản phẩm mà sự có nó không cần thiết cho sinh trưởng, chỉ xảy ra sau khi sinh trưởng kết thúc, tức là trong giai đọan cân bằng. Do đó gọi là lên men hai pha : pha sinh trưởng - pha sản xuất ( trophosphase -idophase).Tại thời kỳ thứ hai, các sản phẩm trao đổi chất được tích tụ chủ yếu ở pha này. Thời kỳ đầu pha hai ( pha log) vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cao, cuối pha này, sinh khối giảm.do tế bào tích tụ sản phẩm chậm. Hơn nữa một số sản phẩm có thể trở thành nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật. Do đó ta nên kết thúc lên men ở trước thời điểm cuối pha hai để tránh hiện tượng đồng hóa trở lại các sản phẩm làm giảm hiệu suất lên men và để tránh hiện tượng tế bào tự phân gây nhớt. Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật. Sự chuyển tiếp giữa pha 1 và pha 2, thành phần môi trường sẽ ảnh hưởng đến hình thái và hoạt lực của giống. Dinh dưỡng cung cấp được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp RNA và đồng hóa cacbon. Nếu lượng P dư, hàm lượng RNA ở mức cao trong thời gian dài làm chop ha một khéo dài, pha hai chậm. Bắt đầu rút ngắn hoặc không còn nữa khi chuyển từ pha một sang pha hai, hàm lượng RNA giảm dần, do dó P trong môi trường được vi sinh vật sử dụng hết trong pha thứ hai. Nếu trong tế bào , các chất nhân nhanh cùng hàm lượng DNA cao sẽ làm rút ngắn pha hai, kích thích nấm mốc , xạ khuẩn sinh bào tử, làm giảm hoạt lực sinh tổng hợp. * Nhiệm vụ chính của quá trình lên men : - Chọn các điều kiện tối ưu của giống trong pha một để rút ngắn giai đoạn - Xác định những điều kiện chuyển tiếp từ pha một sang pha hai. - Tìm nguyên nhân làm giảm hàm lượng các sản phẩm sau khi đã đạt mức tối đa. * Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: - pH : ( [H]+, [OH]- )có ảnh hưởng trực tiếp đến tính keo của môt trường, hoạt lực hệ enzyme, Ở mức độ giám tiếp pH điều chỉnh mức độ phân ly các hợp chất của thành phần môi trường. - O2 : Làm cho sự đồng hóa của vi sinh vật tốt hơn. Nếu sục O2 mạnh sẽ làm hư hỏng cơ học tế bào. - Trong sản xuất kháng sinh, O2 trong pha một để phục vụ cho vi sinh vật phát triển, tạo điều kiện cho hệ enzyme được tạo thành , xúc tác trong pha hai. 2.1.6.2 Nguyên liệu và phương pháp lên men: * Nguyên liệu ( tạo môi trường lên men) : - Nguồn cacbon: các loại cacbonhydrat là nguồn nguyên liệu truyền thống của công nghiệp kháng sinh và vitamin. Vi dụ các loại dường sạch làm môi trường: sacaroza ( lên men sản xuất fumagillin), glucoza, lactoza ( lên men sản suất penicillin). Hay nguồn tinh bột ( ngô, sắn, khoai tây) và dextrin dùng cho các chủng vi sinh vật có khả năng tạo enzyme amylaza ( lên men các aminoglucosid)…. - Các nguồn nitơ: Có thể sử dụng các muối amoni, muối nitrat : ( NH4)2 SO4 , NaNO3 , NH4NO3 KNO3… ví dụ : cao ngô, cao nấm men , bột đậu tương… - Ngoài ra , các chất khoáng, vi lượng và các chất kích thích cũng rất cần cho sự lên men. * Giống vi sinh vật cho quá trình lên men tổng hợp kháng sinh: Giống là những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh được phân lập từ những mẫu khác nhau ( đất, nước, bùn…), sau đó được nuôi cấy và kiểm định ( nhờ mẫu vi sinh vật kiểm định) khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Vi sinh vật kiểm định: là những chủng vi sinh vật đã được xác định là có độ nhạy cảm nhất định với loại kháng sinh ta đang kiểm định. * Các hóa chất và dụng cụ cần thiết : Que cấy, que trang, ống nghiệm, hộp pertri, que đục lỗ thạch ,buồng cấy , nồi hấp, cân phân tích, tủ sấy vô trùng , tủ ấm, máy lắc. * Lên men: Có hai kiểu lên men chính để sản xuất sinh tổng hợp kháng sinh : - Lên men bề mặt : Là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường rắn, dặc, hay lỏng. Ví dụ : cám, bột ngô, hay nước bã rượu , rỉ đường… - Lên men chìm : Tuyệt đại đa số kháng sinh ngày nay được sản xuất theo phương pháp lên men chìm. Ở đây , vi sinh vật được phát triển theo môi trường lỏng, phát triển 3 chiều. Giống cho lên men được tạo ra cho các cấp giống khác nhau. + Giống cấp I : nuôi cấy trong bình nón, trên máy lắc ( 100ml/ 500ml) . + Giống cấp II : nuôi trong bình giống 50l. + Giống cấp III : được nuôi trong bình từ : 1m3 - 5 m3 Phân lập giống vi sinh vật từ (đất, nước..) Môi trường thạch nghiêng vô trùng Cấy chuyển trên môi trường thạch nghiêng để thuần khiết vi sinh vật Môi trường lên men vô trùng Môi trường đĩa thạch vô trùng Nuôi vi sinh vật trên đĩa thạch để chuẩn bị cho quá trình kiểm định Nuôi cấy trên môi trường canh thang Nuôi cấy tiếp trên môi trường thạch thường Thử hoạt tính kháng sinh Lên men Thu dịch lên men Thử pH, chiết để thu sản phẩm Lưư ý: tất cả các khâu từ phân lập vi sinh vật đến thu sản phẩm đều phải bảo đảm vô trùng tuyệt đối. Đại cương về vacxin và công nghệ sản xuất vacxin: Định nghĩa : Vacxin là chế phẩm sinh học có tính kháng nguyên , có khả năng tạo miễn dịch đặc hiệu để chống lại các tác nhân gây bệnh có bản chất kháng nguyên giống bản chất kháng nguyên của vacxin. Thành phần của vacxin: Một vacxin đã được đưa vào thượng mại hóa hiện nay bao gồm những thành phần sau: Kháng nguyên: - Kháng nguyên sống ( kháng nguyên nhược độc): bản chất là những chủng virus cường độc, đã bị làm giảm độc lực rất nhiều thành dạng nhược độc ( bằng cách cấy chuyển nhiều đời trên phôi, trên tế bào..). Vacxin có chứa kháng nguyên thuộc loại này thường có khả năng bảo hộ suốt đời. Ví dụ : vacxin phòng bệnh sởi, bệnh đậu mùa, bệnh lao.. - Kháng nguyên chết : Bản chất là những chủng vi sinh vật đã bị làm bất hoạt ( có thể dùng formalin để làm bất hoạt) , hoặc những mảnh peptid (có thể từ Protein độc tố), hoặc DNA. Chất bổ trợ: - Chất bổ trợ nhằm tăng hàm lượng kháng nguyên trên một đơn vị vacxin , thường dùng là muối nhôm: Al(OH)3. - Chất bổ trợ nhằm tăng cường kích thích đáp ứng miễn dịch, thường dùng dầu freund FCA/FIA nhằm lôi kéo đại thực bào( vì trong thành phần có chứa xác vi khuẩn lao). Hoặc nhằm giữ kháng nguyên tại chỗ để cho quá trình thực bào xảy ra kéo dài hơn, thường dùng dầu Montanide ISA70. Chất bảo quản ( dung môi ): Trước đây, để bảo quản vacxin, người ta thường dùng dung môi là keo phèn, nhưng khi tiêm vacxin hay bị sốc, hoặc gây tai biến, nên bây giờ chuyển sang dạng nhũ dầu. Mục đích cũng để tập trung kháng nguyên. Các tá chất kích thích cho vacxin bảo quản tốt hơn. Một số loại vacxin chính: Vacxin kinh điển: - Vacxin bất hoạt: vacxin phòng bệnh cúm, tả, dịch hạch, viêm gan siêu vi A… - Vacxin sống dạng nhược độc: Vacxin phòng bệnh sởi, quai bị, lao,.. - Các vacxin “ toxoid” : vacxin ngừa uốn ván, bạch hầu.. Một số loại vacxin mới đang nghiên cứu: - Vacxin kảm. - Vacxin polypeptidique. - Các anti-idotype. - Vacxin DNA. Cơ chế hoạt động của vacxin: Bản chất khi đưa vacxin vào cơ thể vật chủ sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Hệ miễn dịch nhận diện vacxin là vật thể lạ nên hủy diệt chúng và “ghi nhớ” chúng. Nếu có tác nhân gây bệnh có bản chất kháng nguyên giống với bản chất kháng nguyên của vacxin đưa vào cơ thể trước đó, thì lập tức hệ miễn dịch sẽ tấn công các tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn( bằng cách huy động nhiều thành phần của hệ miễn dịch , đặc biệt là đánh thức các tế bào lymphô trí nhớ). Tác dụng phụ của vacxin: Gây hiện tượng apxe. Xuất huyết giảm tiểu cầu. Có thể mắc bệnh( có thể là bệnh mà mục đích của vacxin đó là phòng). Có thể dẫn đến tử vong. Kiểm nghiệm vacxin; Để đưa một vacxin nghiên cứu có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp và tiến đến thương mại hóa , cần phải qua bước kiểm nghiệm và đánh giá rất khắt khe về nhiều mặt. Độ vô trùng của vacxin: - Để biết xem một vacxin trước khi đưa vào tiêm chủng có bị nhiễm tạp một số loại vi sinh vật khác hay không, như: vi khuẩn, nấm mốc , nấm men. - Tiến hành cấy trên những môi trường đặc trưng để đánh giá, xem xét vacxin bị nhiễm tạp loại vi sinh vật nào. + Để kiểm chứng nhiễm vi khuẩn thường : tiến hành nuôi cấy trên môi trường LB. hoặc PCA. + Để kiểm chứng nhiễm vi khuẩn gây dung huyết : tiến hành nuôi cấy trên môi trường thạch máu ( môi trường gồm thạch thường có bổ sung hồng cầu của ngựa( cừu)). + Để kiểm chứng nhiễm nấm men hoặc nấm mốc : nuôi cấy trên môi trường saboroud. - Đối với vi khuẩn, có thể phát hiện nhiễm hay không khoảng sau 24h, còn đối với nấm men , nấm mốc phải sau 5-7 ngày. Kiểm tra tính an toàn của vacxin: - Dù vacxin cho người hay cho động vật cần tiến hành thí nghiệm trên: thỏ àchó(mèo)àngười theo các bước sau: +Mẫu vacxin cần kiểm tra tiêm cho thỏ. Sau đó tiến hành kiểm tra các thông số sau: Thông số tạo máu: bao gồm việc xác định công thức máu, tình trạng máu khó đông( xuất huyết giảm tiểu cầu) và tình trạng gây tan huyết. Chức năng gan: Kiểm tra men gan ( AST, ALT), để xác định hàm lượng cholesterol trong máu. Và Bilvulin, protein huyết thanh( yếu tố này có thể gây cô đặc huyết thanh). Chức năng thận: kiểm tra protein niệu, creatinin huyết thanh. - Nếu các thông số trên an toàn trên thỏ, tiếp tục tiến hành các bước như trên đối với chó (mèo). Nếu các thông số an toàn trên (chó mèo), giải phẫu đại thể, vi thể để quan sát. Giải phẫu vi thể : Ngâm gan trong parafil( đông cứng gan) àcắt lạnh àcho vào vi tiêu bản( 1- 1.5µm) và quan sát cấu tạo tế bào gan( hình thái, độ đồng nhất nguyên sinh chất, cấu trúc nhân..). -Tất cả các thông số trên đã xác định an toàn, sẽ tiến hành tiêm thử nghiệm trên người (đối với vacxin phòng bệnh cho người). Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin , hiệu lực của vacxin: - Vacxin phải đảm bảo khi tiêm vào trong cơ thể sinh vật cần phải sinh ra đủ lượng kháng thể bảo hộ cho “ thân chủ”. - Khi tiêm vacxin sẽ xảy ra: + Giai đoạn tiên phát : tức là sau 1-7 ngày sẽ sản sinh IgM. + Giai đoạn thứ phát : tức là từ sau 20 ngày trở lên sau khi tiêm sẽ sản sinh IgG ( kháng thể dịch thể, chúng ta cần xem xét) - Để đánh giá được khả năng bảo hộ của vacxin, cần tiến hành tiêm vacxin trên các loài động vật thí nghiệm ( như thỏ, chó..) Sau khi tiêm , sẽ tiến hành công cường độc. * Lưu ý: + Không bao giờ tiến hành công cường độc ở thời điểm 5-7 ngày sau khi tiêm mũi vacxin đầu tiên. ( Vì thời gian này IgM sinh ra là chủ yếu, cái mà chúng ta cần đánh giá là khả năng sinh IgG). + Sau khi tiêm mũi vacxin cuối cùng tử 21 ngày trở lên mới được công cường độc vào cơ thể bị tiêm vacxin. * Đánh giá hiệu lực của vacxin: Gây miễn dịch bằng cách bắt buộc là tiêm hai lần để kiểm tra. Sau lần tiêm cuối cùng 4 ngày, lấy máu, kiểm tra tính sinh kháng thể, nếu đạt ngưỡng cho phép thì có thể dùng. Tối thiểu là hiệu lực của 1 vacxin phải đạt 70%. Đánh giá độ dài Miễn dịch: Động vật thí nghiệm Vacxi có tiêm khả năng Đã được đánh bảo hộ giá. Công cường Công cường Công cường độc độc lần 3 độc lần1( sau lần hai (sau 1 21 ngày) tháng). Và kiểm tra bệnh lý, tỷ lệ chết…) Quy trình sản xuất một số loại vacxin: Vacxin cổ điển( chế vacxin bất hoạt hoặc nhược độc): Virus Vi kuẩn à Làm nhược độc( hoặc bất hoạt)à nuôi cấy. Kí sinh trùng Làm bất hoạt : có thể sử dụng formalin. Làm nhược độc: bằng cách cấy chuyển nhiều đời trên động vật mẫn cảm. Nuôi cấy : - Đối với virus , nuôi cấy trên động vật mẫn cảm, phôi gà(vịt), hoặc nuôi trên tế bào nuôi nhân tạo( tế bào vero) - Đối với vi khuẩn, nuôi trên môi trrường nhân tạo như mt LB. 2.2.7.2 Vacxin tổng hợp: Virus, vi khuẩn, ký sinh trùng Xác định trình tự acid amin, trình tự các gốc đường. Tái tổ hợp các protein kháng nguyên hoặc các polysaccharide kháng nguyên Vacxin - Ưu điểm của phương pháp :Chỉ cần làm một làn duy nhất để xác định trình tự các a.a. - Nhược điểm của phương pháp: Hiệu lực của vacxin thay đổi, do khó tạo đụợc cấu trúc đặc trưng của protein kháng nguyên. Vacxin tái tổ hợp: Virus, vi khuẩn, ký sinh trùng. Tách gen mã hóa kháng nguyên Nhân dòng gen bằng phản ứng PCR Biểu hiện gen Tinh sạch kháng nguyên Vacxin tái tổ hợp Vacxin đường uống cho người : Tại khâu biểu hiện gen, chuyển gen và nuôi cấy mô trên thực vật để tạo vacxin đường uống. ( và phòng bệnh cho thực vật). PHẦN 3. Khảo sát quy trình công nghệ sản xuất thuốc tại nhà máy Dược phẩm số 2. Giới thiệu về nhà máy : Nhà máy được thành lập năm 2005 và đi vào hoạt động năm 2007 với diện tích là 20.000 m2 . Sản xuất các mặt hàng tân dược, đông dược ,thực phẩm chức năng, đạt năng suất 40-50 triệu viên/7h. Hệ thống nhà máy: - Xưởng sản xuất: đạt tiêu chuẩn GMP ( Good Manufacturing Practices). - Phòng KTCL: đạt tiêu chuẩn GLP ( Good Larboratory Practices). - Kho bảo quản và vận chuyển: đạt tiêu chuẩn GSP ( Good Storage Practices). - Các bộ phận phòng ban hành chính, phục vụ.. Trong đó, xưởng sản xuất sạch ở mức D trong bốn mức quy định của WHO. Dây truyền hoạt động theo nguyên tắc một chiều, môi trừơng lọc khí 99.99%, tốc độ trao đổi khí 20lần/h, độ chênh lệch áp suất giữa phòng sản xuất và hành lang 15PA, nhiệt độ duy trì : 20-250C. độ ẩm 60-65%. Tại phòng sản xuất đặc biệt khống chế độ ẩm 20%. Người lao động được bảo hộ , đảm bảo vệ sinh vô trùng trong quá trinh tiếp xúc với nguyên liệu và thuốc. Nhiệt độ kho 240C. độ ẩm 65%. Sơ đồ quy trình sản xuất thuốc: Kho Nguyên liệu đạt tiêu chuẩn Pha chế cốm 2 Pha chế cốm 1 Kiểm tra độ đồng đều của bột Xay rây Cân chia Trộn bột kép Nhào ướt Sấy xe Sát hạt Sấy khô Kiểm tra độ dồng đều của hạt. Bao trơn Kiểm tra bán thành phẩm Dập viên, đóng nang Kiểm tra bán thành phẩm Ép vỉ, đóng gói Kiểm nghiệm thành phẩm Xuất xưởng - Pha chế cốm 1 nhờ máy trộn cao tốc: Nguyên liệu cứngà nấu hồ à đun trong nồi hai vỏ ( đun cách thủy bằng điện hoặc hơià cánh khuấy hoạt động tạo thành khối ẩm đầu tiênà hạt cốm. - Sấy tĩnh: nguyên liệu cho vào khay , tùy từng sản phẩm mà sấy ở những nhiệt độ nhất định. - Pha chế cốm 2: Sấy hạtànguyên liệu à máy sát hạtàtủ sấy tầng sôi( dùng gió nóng tạo thành cốm à sữa hạt cốm). Biệt giữ cốm ở nhiệt độ phòng. - Bao đường: đường nấu bằng xiro à quay tròn à bọc lại. - Bao film: FSC dùng cho viên nén. - Ép vỉ: dùng nhiệt độ hơi đốt nóngà thổi khuônàxả viênà trạm dán giấy nhômà dập số lôà cắt. - Kiểm nghiệm( kiểm tra chất lượng sản phẩm): kiểm nghiệm thuốc và các dược phẩm dựa trên tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam. Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ,hoặc các phản ứng hóa học có thể kiểm tra định lượng và các chỉ tiêu khác của một số sản phẩm thuốc đông dược. Bằng các phân tích hóa lý( nhờ các máy móc), có thể định tính được các tính chất( khả năng hòa tan , độ tan rã, bán rã, hàm lượng nước, năng suất phân cực..) của thuốc. - Máy thử độ hòa tan. - Máy đo độ mài mòn. - Máy đo điểm chảy. - Máy chuẩn độ điện thế. - Máy thử độ rã . Kiểm tra hoạt lực kháng sinh của thuốc: cấy kháng sinh lên giếng thạch có vi sinh vật kiểm đinh. Xác định vòng vô khuẩnà hoạt lực kháng sinh. 3.3 Quá trình thử các đặc tính lâm sàng của thuốc Antesik: 3.3.1 Tên thuốc: Tên thuốc: Antesik. Hàm lượng: Berberin clorid : 50.0 mg Bột rễ mộc hương 200.0 mg Lactose 30.0 mg Tinh bột mì 100.0 mg Talcum( 4SiO2.3MgO.H2O) 6.0 mg Magnesi stearat 8.0 mg Dạng bào chế cuả thuốc: viên nang Định tính và định lượng: Định tính: Phải có phẩn ứng của Berberind clorid, mộc hương. Định lượng: chế phẩm phải chứa từ: 93,0% - 110% Berberind clorid so với hàm lượng ghi trên mác, tính theo khối lượng trung bình viên. Dạng bào chế của thuốc: Viên nang, một đầu màu xanh, một đầu màu vàng, bên trong chứa bột thuốc màu vàng, mùi thơm đặc biệt của mộc hương, vị đắng, hơi cay. Các đặc tính lâm sàng: Chỉ định và điều trị: Viêm đại tràng, chữa ỉa chảy,lị rối loạn tiêu hóa, các bệnh nhiễm trùng đường ruột khác. Liều dùng và cách dùng: người lớn: ngày uống 3 lần, mỗi lần một viên. Trẻ em, ngày uống một viên. Chống chỉ định: người mẫn cảm với các thành phần của thuốc. Tác dụng phụ: không có. Tương tác thuốc: không có. Phụ nữ có thai và cho con bú: nên thận trọng. Đặc tính dược lý: Berbrind clorid: - Chữa trực khuẩn lỵ, lên cầu, tụ cầu. - Tăng tam thời trương lực và sự co bóp của ruột. - Bài tiết qua nước tiểu, một phần phá hủy trong cơ thể. Mộc hương: - Vị cay, đắng , tình ôn. Có tác dụng kiện tỳ hòa vị, điều khí, chỉ thống, chữa ngực bụng đầy, an thai, tả lỵ, nôn mửa, lỵ cấp hậu trọng. 3.3.6 Tiêu chuẩn cơ sở : Yêu cầu kỹ thuật: Công thức điều chế cho một viên : (Giống hàm lượng yêu cầu ở trên.) Chất lượng thành phẩm: - tính chất: giống như trên. - độ rã không quá 30phút. - độ dồng dều khối lượng: ±70% khối lượng trung bình viên. - định tính: phỉa có phản ứng của berberind clorid , mộc hương. - định lượng: hàm lượng berberind clorid là 93%- 110% so với hàm lượng ghi trên mac. - độ nhiễm khuẩn: đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III ( mục 10.7) : độ nhiễm khuẩn mức 4. - mất khối lượng do làm khô: không quá 9%. * phương pháp thử: - tính chất: bằng cảm quan. - độ rã: thử theo phụ lục 8.6 DĐVN III. - độ đồng đều khối lượng: thư theo phụ lục 8.3 DĐVN III. - định tính: +) Berberin clorid: thử theo tiêu chuẩn DĐVN III Thuốc thử: - dung dịch Natrihydroxyd 10% (TT). - dung dịch acid nitric 10% (TT). - dung dịch acid hydrochloric 10% (TT) - acetone (TT) - dung dịch bạc natri 5% (TT) - cloramin 5% (TT) Cách thử: - Lấy một lượng một viên đã nghiền mịn tương ứng với khoảng 0,1g berberin clorid, thêm 10ml nước ất , đun nóng nhẹ để hòa tan berberin. Lọc lấy 5ml dịch lọc, thêm 3 giọt dung dịch Natri hydroxyd 10% (TT), sẽ có màu đỏ da cam. Thêm tiếp 5 giọt aceton(TT) sẽ có kết tủa màu vàng, để lắng, thêm vài giọt aceton cho đến khi kết tủa hoàn toàn. Lọc lấy 2ml dịch lọc. Acid hóa dịch lọc bằng vài giọt dung dịch acid nitric 10%(TT), thêm 3 giọt dung dịch bạc nitrat 5%(TT) sẽ có kết tủa màu trắmg tan trong dung dịch amoniac (TT). - Lấy một lượng bột viên tương ứng với 0.05g berberin clorid hòa tan trong nước, thêm 2ml dung dịch acid HCl 10%(TT), lắc co tan . Rồi thêm một ít bột cloramin T (TT) sẽ có màu đỏ anh đào. +) Bột rễ mộc hương: thuốc thử theo DĐVN III. - Ethanol(TT) - N-hexan(TT) - Ethyl acetate(TT) - Dung dịch vanillin 1% trong acid sunfuric (TT) - Bản mỏng Silicagel G hoạt hóa 1000C trong 1h. - Dung môi triển khai: N-hexan : ethyl acetate (2:1). - Cách thử: Lấy một lượng bột viên tương ứng với 0,5g bột mộc hương, them 10ml ethanol 960( TT), lọc để được dung dịch thử (T). Dung dịch đối chiếu: lấy 0.5g bột mộc hương, hòa tan trong 10ml ethanol 960, ngâm trong 1h, lọc để được dung dịch đối chiếu (C) Triển khai sắc ký: chấm 10µl của dung dịch thử(T) và 10µl của dung dịch đối chiếu kia lên bản mỏng. Lấy bản mỏng ra để khô, rồi phun thuốc thử vanilin1%, H2SO4 đậm đặc, sấy ở 1100C từ 5-10 phút. Kết quả: trên sắc lý đồ của dung dịch T phải cho các vết tương ứng với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch C về màu sắc và R1. - định lượng: Cách thử: . Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 80g berberin clorid vào bình định mức 500ml, hòa tan bằng nước nóng. Để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước tới vạch, lắc đều. Lấy chính xác 5ml dich trong ở trên đem pha với nước cất vừa đủ 100ml. . Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác bột lượng bột viên tương ứng 80g berberin clorid, them 10ml nước để thấm ẩm nhiều bột viên,sau đó them khoảng 200ml nước sôi khuấy kỹ 5phút. Để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml. Thêm nước đến vạch, lắc đều, để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dịch trong ở trên pha với nước cất vừa đủ 100ml. Đo độ hấp phụ của mẫu thử và mẫu đối chiếu trong cùng điều kiện ở bước song 345nm, với mấu trắng là nước cất, cốc dày 1cm. Đóng gói và ghi nhãn: - Đóng gói trong vỉ nhôm, vỉ 4 viên. - Nhãn rõ rang, đúng quy chế. - Bảo quản nơi khô mát, tránh ánh sáng. - Hạn dùng : 36 tháng kể từ ngày sản xuất. Phiếu kiểm nghiệm sản phẩm: Tên mẫu: viên nang Antesik Hàm lượng: Berberin clorid 50,0 mg Bột rrễ mộc hương 200,0mg Số kiểm soát: Hạn dùng: Số lượng viên: 10000 viên. Tiêu chuẩn kiểm nghiệm: TCCS. Yêu cầu Kết quả Hình thức: Viên nang số 0, một đầu màu vàng, một đầu màu xanh, bên trong chứa bột thuốc màu vàng, mìu thơm của mộc hương, vị đắng hơi cay. Đạt Định tính: Chế phẩm phải có phép thử định tính của Berberin clorid và bột mộc hương Đúng Độ đồng đề khối lượng: KLTB ± 7,5% Đạt Mất khối lượng do làm khô : không quá 9% Đạt Độ rã : không quá 30 phút. Đạt Định lượng: chế phẩm phải chứa từ 93,0%-110.0%, so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình viên. Đạt 100,8% Độ nhiễm khuẩn: Đạt D ĐVN III phụ lục 10.7, độ nhiễm khuẩn mức 4. Đạt Bao bì đóng gói: vỉ 4 viên, hộp 4 vỉ. Đúng Kết luận, mẫu thuốc trên đạt tiêu chuẩn chất lượng. 3.4 Một số dược phẩm là kháng sinh có mặt trên trên thị trường: Tên thuốc: Neazi Dạng viên nén, dạng bao film, bột pha tiêm, bột pha uống, - Thành phần: Azithromycin, là kháng sinh bán tổng hợp , phổ rộng, thuộc nhóm Macrolid. - Cơ chế tác dụng: Azithromycin gây ức chế quá trình tổng hợp protein của vi sinh vật bằng cách gắn vào tiểu phần 50S của phân tử ribosome. - Chỉ định: +) Nhiễm trùng đường hô hấp trên: nhiễm trùng tai , mũi ,họng, viêm xoang, viêm họng, viêm tai giữa, viêm amidan.. +) Nhiễm trùng đường hô hấp dưới: Viêm phổi, viêm phế quản cấp. Tên thuốc : Acyclovir , dạng viên nén, tiêm , thuốc mỡ. - Thành phần: Acyclovir 200mg - Cơ chế tác dụng : Có tác dụng chọn lọc trên tế bào nhiễm vi khuẩn Herpes. Ở giai đoạn đầu: acyclovir được một enzyme của virus là Thymidinkinase àacyclovir monophosphatà acyclovir diphosphatà acyclovir triphosphat, khi đó, nó sẽ ức chế sự tổng hợp DNA và sự nhân lên của virus. Độc tính của acyclovir triphosphat đối với tế bào bình thường rất thấp so với tế bào bị nhiễm virus. - Chỉ định: Điều trị nhiễm herpes simplex ở da và niêm mạc , khởi phát hoặc tái phát. Dự phòng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch.. Tên thuốc: Lincomycin 500 mg , dạng tiêm hoặc viên nang - Thành phần: Lincomycin . Đây là kháng sinh thuộc nhóm Lincosamid. - Cơ chế tác dụng: chúng gắn vào tiểu phần 50S của ribosome gây ức chế quá tring sinh tổng hợp protein. - Chỉ định: thuốc có tác dụng kìm khuẩn là chủ yếu. Chống lại một số bệnh do vi khuẩn: staphylococcus, streptococcus, pneumococcus, ở người bệnh có dị ứng với penicillin như áp xe gan., nhiễm khuẩn xương, nhiễm khuẩn tan huyết, nhiễm khuẩn kháng penicillin… - Được chuyển hóa ở gan và thả trừ qua phân, thời gian bán thải: 5h. Tên thuốc: Mediclion. - Thành phần: Metronidazole 250mg. Là dẫn xuất của : 5-nitro-imidazol, có tác dụng lên động vật nguyên sinh( amip, giardia), vi khuẩn kỵ khí. - Cơ chế tác dụng: Khi vào trong tế , dẫn xuất 5-nitơ sẽ gây độc cho tế bào, chúng gắn vào các phân tử DNA và làm phá vỡ nó, gây chết tế bào. - Chỉ định: điều trị nhiễm khuẩn trichomonas ở bộ phận tiết niệu, nhiễm giardia lambia, lỵ amip, áp xe gan do lỵ amip… PHẦN 4 Khảo sát công nghệ sản xuất vacxin tại Xí nghiệp thuốc Thú y TW. Giới thiệu : Xí nghiệp được thành lập năm 1956 và đi vào hoạt động năm 1962, đến nay đã cung ứng được nhiều loại vacxin phòng bệnh, dược phẩm và các chế phẩm có hoạt tính sinh học cho ngành chăn nuôi, thú y. Xí nghiệp có riêng một phân xưởng ( khu nhà A) sản xuất vacxin, bao gồm cả vacxin có nguồn gốc từ vi khuẩn và virus, là một trong 3 cơ sở sản xuất vacxin trong cả nước. Thành tựu của Xí nghiệp: Từ năm 1962 – 1990: tạo ra được vacxin chống tụ dấu lợn. - Vacxin tụ huyết trùng nhược độc ở lợn: AvP53 chủng được phát hiện và phân lập tại Việt Nam. - Vacxin đóng dấu lợn : VR2 chủng được phân lập ở Rumani (1913) - Tạo được các giống ổn định, và sản xuất thành công môi trường nuôi cấy vi trùng. Từ năm 1990 – 2000 : - Tạo được các vacxin liều nhỏ nhờ hệ thống công nghệ mới. Từ chỗ 20 – 30 ml/liều giờ còn 2ml/liều - Tạo được thêm một số sản phẩm mới. Từ năm 2000 đến nay: Cho ra đời một số sản phẩm mới. Một số khâu công nghệ trong việc sản xuất vacxin: Phân xưởng sản xuất vacxin virus đông khô: Sản xuất vacxin virus đông khô trên môi trường thai trứng, phôi tế bào.. Chia liều: vacxin thu được, chia liều , sau đó được đưa vào hệ thống đông khô. Làm việc trong điều kiện vô trùng. Hai máy đông khô làm việc trong khoảng 2h – 13h cho ra 10 nghìn lọ vacxin, mỗi lọ khoảng 100 liều, hệ thống được điều khiển bằng máy tính. Hoàn thiện sản phẩm Kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm vacxin virus đông khô. Kiểm nghiệm trên mô bào sống, phôi thai(trứng), động vật ,sau đó, đặt trong tủ ấm (370C) để tạo điều kiện cho tổ chức sống phát triển. Phân xưởng sản xuất vacxin vi trùng : Tổ môi trường: nhiệm vụ là sản xuất các loại môi trường nuôi cấy cho vi trùng. Nguyên liệu ở đây là từ thịt bò (thịt bắp) à lọc bỏ gân, mỡ, mạch máuà xay nhỏà đun chin (bằng hơi nước). Sau đó cho sản phẩm thịt đã được đun chín một lượng men tiêu hóa (tripsin tách từ tế bào lục giác của mô tụy tạng), đun trong 6hà môi trường lên men ( nước + acid amin). Một số loại môi trường nuôi cấy: - Môi trường thịt yếm khí: để nuôi cấy vi trùng yếm khí, vi trùng hô hấp tùy tiện. (trong thành phần có bổ sung những phân tử glycogen) - Môi trường thạch nghiêng (thạch nấm): có thêm glucoza và bổ sung glycerin. - Môi trường thạch thường: chỉ gồm nước thịch thường và agar. - Môi tường có bổ sung formalin, muối chống nấm, để kiểm định vi trùng đã chết hoàn toàn hay chưa. Nếu trên môi trường này vẫn phát triển được thì các môi trường khác phải nghi ngờ. - Môi trường thạch máu: ngoài thạch có bổ sung hồng cầu của cừu. Ngoài việc nuôi cấy vi khuẩn còn có thể xác định vi khuẩn thuần khiết và vi khuẩn dung huyết.( Giúp trong quá trình kiểm định độ vô khuẩn cuả vacxin, nếu có mặt của vi khuẩn gây dung huyết, khi tiêm cho gia súc sẽ gây tử vong tất nhanh). - Ngoài ra, huyết thanh cũng là một nguyên liệu trong nuôi cấy một số vi trùng. Hệ thống lên men vi trùng : nồi lên men Pecnito. Sau khi đã sản xuất thành công môi trường, sẽ tiến hành quá trình lên men. Hệ thống lên men vi trùng ở đây gồm 2 nồi lên men: một nồi to có dung tích là 180l, một nồi nhỏ có dung tích là 10l, được tự động hóa điều khiển mọi thông số trong môi trường nuôi cấy nhờ hệ thống máy tính điện tử. Công nghệ lên men ở đây là lên men có sục khí.Năng suất của hệ thống : từ 6h-8h cho ra một mẻ (1 triệu liều vacxin). Ở đây luôn luôn duy trì một độ ẩm ( máy nén không khí à khô không khí đến độ ẩm W = 4%), và áp suất nhất định cho máy làm việc. Tổ tiêu độc dụng cụ thiết bị thí nghiệm: Tất cả dụng cụ, thiết bị sau khi làm xong, sẽ được cho vào lò hấp và hấp bằng hơi nước nóng. Hệ thồng lò hấp hai vỏ, muốn tăng nhiệt độ hấp, chỉ cần tăng áp lực hơi nước đi vào. Nhiệt độ quá cao, sẽ có hệ thống hút nhiệt. Tìm hiểu về quy trình kiểm nghiệm vacxin phó thương hàn lợn nhược độc. Đối tượng áp dụng: Quy trình này áp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin nhược độc chế từ chủng vi khuẩn Salmonella choleraesuis đông khô. Quy định về kỹ thuật: Lấy mẫu: Mẫu được lấy theo TCVN 160-2008 “ Quy trình lấy mẫu thuốc thú y và vacxin thú y để kiểm tra chất lượng”. Kiểm tra thuần khiết: Theo tiêu chuẩn 161-2008 “ Vacxin thú y- quy trình kiểm tra thuần khiết” bao gồm: Kiểm tra sự tạp nhiễm vi khuẩn. Kiểm tra sự tạp nhiễm nấm mốc. Kiểm tra sự tạp nhiễm Mycoplasma. Vacxin được kiểm tra trên các môi trường đặc biệt như: Môi trường MacConkey agar (màu đỏ) : đây là môi trường thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn Gr (-) và cho nó lên men lactose. Thành phần : - Pepton. - Lactose - Mật muối( hỗn hợp acid steroid với ion natri) - Nacl - Toluylene đỏ (thuốc nhuộm) - Agar - Nước. Môi trường KIA: màu đỏ. Thành phần : peptone, lactose/glucose = 10/1,dẫn xuất cuả lưu huỳnh, chất chỉ thị đỏ phenol, sắt (2) amoni citrate. Ngoài ra vacxin còn được kiểm tra sự ngưng kết với acriflavin ( hoạt chất kháng khuẩn) 1/500 ( phản ứng lên bông). Kiểm tra an toàn: dùng một trong những phương pháp sau đây: Tiêm vào dưới da cho 3 con lợn cai sữa khỏe mạnh ( không có kháng thể chống Salmonella choleraesuis) ,(20-30kg /con), mỗi con 10 liều vacxin quy định. Tất cả lợn phải sống khỏe mạnh và phát triển bình thường sau 7 – 10 ngày theo dõi. Tiêm vào dưới da cho ít nhất 5 con chuột lang ( mỗi con 300- 350g), mỗi con 2 liều vacxin quy định. Tất cả các chuột phải sống khỏe mạnh và phát trển bình thường sau 7 – 10 ngày theo dõi. Kiểm tra hiệu lực: vacxin được kiểm tra hiệu lực bằng một trong hai cách sau: Phương pháp đếm số vi khuẩn: Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch ( Brain heart agar: BHA). Vacxin tiêu chuẩn khi có số khuẩn lạc không thấp hơn 2.5×109/1 liều vacxin. Phương pháp tiêm chuột: Cho 5 chuột lang, trọng lượng 300 – 350 kg/con, mỗi con tiêm 1/5 liều vacxin ghi trên nhãn ( 0.5× 109 CFU), 5 chuột sau khi tiêm trở thành 5 chuột chú chuột miễn dịch. 21 ngày sau khi tiêm 5 chuột miễn dịch, ta tiêm một lượng chủng thương hàn lợn cường độc với liều MLD cho cả hai : 5 chuột miễn dịch và 2 chuột đối chứng. Trong 3 tuần theo dõi, chuột đối chứng phải chết hết trong khi chuột miễn dịch phải sống ít nhất 3 con. Ghi chú : MLD : liều nhỏ nhất gây chết hết động vật thí nghiệm.( Minimum Lethal Dose). CFU : đơn vị khuẩn lạc ( Colony Forming Unit). Một số vacxin đã thương mại hóa: Vacxin cúm gia cầm: Vacxin Lasota: đây là loại vacxin nhược độc đông khô chủng Lasota dùng để phòng “bệnh toi gà” cho gà con dưới 2 tháng tuổi. Thành phần: virus Newcastle nhược độ đông khô chủng Lasota, được sản suất trên phôi thai trứng gà. Mỗi liều vacxin chứ tối thiểu là 106EID50 virus Newcastle, chất bổ trợ. Cách dùng: hòa tan với nước muối sinh lý, dùng cho gà dưới hai tháng tuổi, cho uống hoặc nhỏ mắt. Vacxin Gumboro: Vacxin nhược độc đông khô chủng 2512, sản xuất trên môi trường tế bào xoư phôi gà một lớp. Thành phần : một liều vacxin chứa 103TCID50 VR, chất bổ trợ. Liều lượng và cách dùng: hòa tan với nước sinh lý, cho gà uống hoặc nhỏ mắt. Nếu gà mẹ chưa tiêm phòng vacxin Gumboro, thì phòng cho gà con vào lúc 5-7 ngày tuổi. Sau 2 tuần nhắc lại 2 lần. Nếu gà mẹ đã tiêm, thì sử dụng vacxin cho gà con đạt lúc 2 tuần tuổi. Vacxin phòng bệnh cho lợn: Vacxin phó thương hàn lợn . Thành phần : vi khuẩn Salmonella cholera suis, chất bổ trợ. Một liều vacxin chứa 2-2,5 tỉ CFU. Tiêm vào bắp thịt hoặc dưới da, tiêm cho các loại lơn ở mọi lứa tuổi 1ml/1con. Vacxin tụ huyết trùng lợn: vacxin vô hoạt, dạng nước để phòng bênh tụ huyết trùng cho lợn. Thành phần: giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn Pasteurella suis eptia, túyp B, formaldehyde, keo phèn. Cách dùng : tiêm dưới da cho lơn ở mọi lứa tuổi, mỗi con 1ml. Sauk hi tiêm 3 tuần, con vật sẽ có miễn dịch và miễn dịch kéo dài 6 tháng. Nơi mới có dịch tụ huyết trùng xảy ra nên tiêm phòng hai lần, cách nhau 3-4 tuần, tiêm cho toàm đàn. Không tiêm cho lợn ốm, sắp đẻ hay mới đẻ non. Vacxin nhiệt thán cho trâu, bò: vacxin vô độc nha bào dạng lỏng, phòng bệnh nhiệt thán cho trâu bò. Thầnh phần : nha bào của vi khuẩn nhiệt thán vô độc, không giác mô, mỗi liều vacxin cho khoảng 25 triệu nha bào, chất bổ trợ là glyxerin. Cách dùng: tiêm dưới da cho trâu, bò.