Báo cáo Phương pháp ly trích,thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic trong mỡ cá basa pangasius bocourti sauvage

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC W X PHẠM THỊ ANH PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH,THU NHẬN VÀ LÀM GIÀU ACID DOCOSAHEXAENOIC TRONG MỠ CÁ BASA PANGASIUS BOCOURTI SAUVAGE KHÓA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC ĐỘNG VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2006 2 Lời cảm ơn Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới cô Nguyễn Kim Phi Phụng, người cô đã cho em những ý tưởng khoa học, đã chỉ dạy, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện để em có thể làm việc tại phòng thực tập hóa hữu cơ. Cô đã truyền đạt kiến thức cũng như các phương pháp cần thiết để xử lý một vấn đề khoa học. Em xin gởi lời cảm ơn đến thầy Phan Kim Ngọc. Thầy không những đã dìu dắt em suốt bốn năm qua, động viên trong những lúc em khó khăn mà còn cho em niềm đam mê và nhiệt huyết khoa học. Em cũng xin cảm ơn quý thầy cô trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Sinh học người và động vật. Thầy cô đã cho em những kiến thức làm hành trang trong cuộc sống. Cuối cùng, cảm ơn các bạn, các anh làm việc trong phòng thực tập Hóa hữu cơ, anh Thiện làm việc tại Viện Khoa Học và Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ em giải quyết các vấn đề phát sinh trong suốt quá trình hoàn thành bài luận văn này. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 7 năm 2006 Phạm Thị Anh 3 MỤC LỤC Lời mở đầu ..................................................................................................................................................1 PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO.............................................................................................................2 1.1.1. Lipid - Chất béo ..............................................................................................................................2 1.1.1.1. Định nghĩa .....................................................................................................................................2 1.1.1.2. Phân loại ........................................................................................................................................2 1.1.1.3. Vai trò của lipid .............................................................................................................................3 1.1.1.4. Tính chất vật lý ..............................................................................................................................3 1.1.2. Acid béo ............................................................................................................................................5 1.1.2.1. Công thức cấu tạo .......................................................................................................................... 5 1.1.2.2. Tính chất vật lý ..............................................................................................................................5 1.1.2.3. Phân loại ........................................................................................................................................7 1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo ..............................................................................................................8 1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học .............................................................................................12 1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic ........................................................................................12 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học ..........................................................................................................................12 1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể ...............................................................................................13 a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh ..............................................................................................13 b) Tác dụng đối với thị giác và màng tế bào..............................................................................................13 c) Tác dụng đối với não .............................................................................................................................13 d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương ........................................................14 e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch .....................................................................................................14 f) Tác dụng đối với sự viêm .......................................................................................................................15 g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp ..........................................................................................................15 h) DHA và bệnh ung thư ............................................................................................................................16 i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn .....................................................................................................16 1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA ..........................................................................16 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP DHA........................................................................................18 1.2.1. Phương pháp chưng cất phân đoạn bằng li tâm phân tử ...........................................................18 1.2.2. Phương pháp sắc kí khí định lượng .............................................................................................19 1.2.3. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................................................19 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn .....................................................................................................21 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc ......................................21 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................................22 1.3.1. Phương pháp transester hóa .........................................................................................................22 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid.....................................................................................................................22 4 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ ....................................................................................................................23 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym.................................................................................................................24 1.3.1.4. Xúc tác zeolit ................................................................................................................................25 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA ....................................................................................................26 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................................................26 1.3.2.2. Phương pháp tủa urê .....................................................................................................................27 1.3.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................29 1.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CÁ BASA Ở VIỆT NAM.....................................................................30 1.4.1. Phân loại .........................................................................................................................................30 1.4.2. Đặc điểm cá basa............................................................................................................................31 1.4.3. Những sản phẩm từ mỡ cá basa ...................................................................................................31 1.4.3.1. Tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá basa ................................................................................................32 1.4.3.2. Tinh luyện mỡ cá basa thành dầu mỡ thực phẩm..........................................................................34 PHẦN II: THỰC NGHIỆM 2.1. DỤNG CỤ - NGUYÊN LIỆU ........................................................................................................36 2.1.1. Dụng cụ...........................................................................................................................................36 2.1.2. Nguyên liệu .....................................................................................................................................36 2.2. PHƯƠNG PHÁP ............................................................................................................................37 2.2.1. Phương pháp transester hóa .........................................................................................................37 2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng......................................................................................................38 2.2.3. Phương pháp tạo phức giữa urê và các ester béo .......................................................................41 PHẦN III: KẾT QUẢ 3.1. Kết quả phản ứng transester hóa ................................................................................................43 3.1.1.. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol methanol/mol dầu cá ................................................................43 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa .................................................................................................................................................44 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác ......................................................................................................45 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác ....................................................................................46 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng....................................................................................47 3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo với urê ........................................................................49 PHẦN IV: KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................................................54 4.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 5 LỜI MỞ ĐẦU Từ nhiều thập kỷ nay, vấn đề dinh dưỡng và sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu, đặc biệt là vấn đề chăm sóc trẻ em - nguồn nhân lực tương lai của đất nước. Hiện nay, cùng với những bước chuyển mình mạnh mẽ của thế giới thì các căn bệnh thời đại cũng có chiều hướng gia tăng. Chính vì vậy mà các sản phẩm trên thị trường đang được các nhà khoa học ra sức nghiên cứu để bổ sung thêm các thành phần quý, có tác dụng làm suy giảm và ngăn ngừa bệnh tật, đồng thời còn có ích cho việc phát triển trí não và tư duy của trẻ. Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy nguồn acid béo bất bão hòa trong mỡ cá rất dồi dào trong đó có DHA, và ở Việt Nam đã được tìm thấy trong các loại cá da trơn hay còn được gọi là catfish như cá ba sa, cá tra… là các loại cá có nhiều mỡ được nuôi khá phổ biến ớ đồng bằng sông Cửu Long. Đặc biệt đối với cá basa, đây là một nguồn DHA khá triển vọng, có thể thu được một lượng lớn mỡ cá phế thải từ các nhà máy chế biến thủy hải sản xuất khẩu. Việc cần thiết là phải tìm ra một phương pháp thu nhận DHA từ mỡ cá sao cho có hiệu quả, tiết kiệm nhất, phù hợp với điều kiện kinh tế trong nước, đặc biệt là sản xuất ra được DHA chi phí thấp và giảm bớt nhập khẩu từ nước ngoài. Mặt khác, có nhiều công trình nghiên cứu phản ứng transester hóa mỡ cá basa thành nhiên liệu diesel sinh học, thay thế diesel truyền thống, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường. Từ những thực tế trên, em chọn cá basa làm nguyên liệu để tìm hiểu và ly trích DHA, đồng thời sử dụng phương pháp transester hóa với hy vọng có thể tận dụng được nguồn mỡ cá basa thừa trong nước để vừa ly trích được thành phần quý DHA vừa tạo ra được nguồn năng lượng sạch cho tương lai. Từ đó góp phần cải thiện chế độ dinh dưỡng cho người Việt Nam, đặc biệt là thế hệ trẻ. 1.1. TỔNG QUAN VỀ ACID BÉO 1.1.1. Lipid - Chất béo 1.1.1.1. Định nghĩa [18] Chất béo là một nhóm gồm nhiều hợp chất hóa học khác nhau. Triacylglycerol còn gọi là triglycerid hay glycerid hoặc mỡ trung tính. Là một este của glycerol và acid béo, được cấu tạo bởi ba nguyên tố C, H và O. Công thức tổng quát: R1, R2, R3: là các gốc của acid béo Lipid có đặc tính chung là không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như chloroform, benzen, ether. Lipid gồm các acid béo, glycerid, glycerol, phospholipid, sterol. 1.1.1.2. Phân loại [8] a. Dựa vào phản ứng xà phòng hóa CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O 6 Lipid xà phòng hóa được. Nhóm này gồm các glycerid, glycerophospholipid và sáp nghĩa là những lipid mà trong phân tử có chứa este của acid béo cao phân tử. Lipid không xà phòng hóa được. Tức là những lipid trong phân tử không chứa chức este, nhóm này gồm các hydrocarbon, các chất màu và các sterol. b. Dựa vào độ hòa tan Lipid của acid béo (có từ bốn carbon trở lên) với một rượu. Nhóm này gồm: glycerolipid (este của glycerol), sphingolipid (amid của sphingozin), cerid (este của rượu cao phân tử), sterid (este của sterol), etoliteste tương hỗ của hợp chất đa chức acid rượu). Lipoid: Là những chất có độ hòa tan giống lipid. Nhóm này bao gồm: Các carotenoid và quinon, sterol tự do, các hydrocarbon. c. Dựa vào thành phần cấu tạo Lipid đơn giản: Là este của rượu và acid béo, thuộc nhóm này có: triacylglycerin, sáp (cerid), sterid. Lipid phức tạp: Trong phân tử của chúng ngoài acid béo và rượu còn có thành phần khác như acid phosphoric; bazơ nitơ; đường. 1.1.1.3. Vai trò của lipid [18] ™ Là thành phần cấu trúc màng sinh học (phospholipid, glycolipid). ™ Là cofactor của một số enzym. ™ Là các hormone và chất vận chuyển thông tin nội bào. ™ Là nguồn năng lượng dự trữ quan trọng cung cấp năng lượng cho cơ thể. Nếu oxi hóa hoàn toàn 1 g mỡ sẽ giải phóng 9 kcal lớn gấp 2 lần năng lượng thu được khi oxi hóa 1 g protein hoặc glucose. ™ Ngoài ra còn: giảm nhẹ chấn động cơ học đối với cơ thể (động vật chạy nhảy nhiều ở bàn chân có lớp đệm), vai trò trong sự vận chuyển hấp thu các chất hòa tan trong nó (hấp thu vitamin tan trong chất béo), lớp mỡ dưới da còn có vai trò cách nhiệt tốt giữ thân nhiệt ổn định nên có ý nghĩa đặc biệt đối với động vật ngủ đông ở các xứ lạnh. 1.1.1.4. Tính chất vật lý [18] ™ Chất béo có tỷ trọng thấp hơn nước (0,86 – 0,97). ™ Chất béo không tan trong nước, khi trộn với nước sẽ tạo thành hai lớp: nước ở dưới và chất béo ở trên, đầu COO- tiếp xúc với nước, đuôi kị nước nằm ở phía trên. Dưới tác động của các chất gây nhũ tương hóa như xà phòng (muối Na+ hay K+ của acid béo bậc cao) hoặc acid mật hay muối mật (do gan tiết ra), chất béo bị chia nhỏ trông như dạng sữa gọi là dạng nhũ tương bền. Nhờ vậy, xà phòng là chất tẩy rửa dầu mỡ sau các dung môi hữu cơ. Ngoài ra, điều đó cũng giải thích các bệnh nhân bị bệnh gan phải hạn chế thức ăn chứa chất dầu mỡ, mỡ, vì ở các cơ thể này, dầu mỡ trong thức ăn không được nhũ tương hóa, do đó lipase phân giải chậm. Lipid bao gồm các acid béo, các triglycerid, glycerol, các phospholipid và các sterol, trong đó acid béo là thành phần chính quan trọng nhất. ™ Tính chất của glycerid phụ thuộc vào thành phần acid béo của chúng, chiều dài mạch carbon và số lượng liên kết đôi trong phân tử. Ví dụ về điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid như bảng 1. 7 Bảng 1: Điểm nóng chảy của một số acid béo và glycerid Acid béo Điểm nóng chảy (oC) Triacylglycerol Điểm nóng chảy (oC) Palmitat 63,1 Tripalmitin ≈ 80 Stearat 69,6 Tristearin ≈ 80 Oleat 13,4 Triolein 0 Mỡ động vật chứa nhiều acid béo no, trong nhiệt độ bình thường ở trạng thái rắn, nhất là mỡ bò, mỡ cừu. Dầu thực vật cũng tùy theo tỷ lệ giữa acid béo no và không no, có điểm nóng chảy khác nhau. Ví dụ dầu ca cao chứa 35% palmitat và 40% stearat có điểm nóng chảy là 30 - 34oC. Ngược lại, dầu hướng dương chứa 85% acid béo không không no là oleat và linoleat, có điểm nóng chảy rất thấp: -21oC. Vì vậy, dầu thực vật luôn ở dạng lỏng. Nguyên nhân của trạng thái rắn hay lỏng của glycerid được giải thích là vì acid béo no, gồm một đầu phân cực (COO-) và đuôi kị nước (khung carbon của mạch) tạo nên cấu trúc ổn định và chặt, không bị phá vỡ. Acid béo không no có khung carbon bị gấp khúc, tạo sự sắp xếp lỏng lẻo dễ bị phá vỡ, do đó ở nhiệt độ bình thường chúng có trạng thái lỏng. 1.1.2. Acid béo 1.1.2.1. Công thức cấu tạo[18] Acid béo là thành chính của hầu hết các lipid. Cả lipid trong cơ thể lẫn thực phẩm. Công thức tổng quát: CH3 ─ (CH2)n ─COOH Số nguyên tử carbon trong acid béo thường là chẵn (14 - 22C). Các acid béo thường gặp có số carbon từ 16 - 18. Số thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch hydrocarbon của acid béo được tính từ nguyên tử carbon của nhóm carboxyl. H3Cω (CH2)n Cβ Cα 3 2 C OH O 1 Ký hiệu: α, β, γ, ω,….để chỉ thứ tự của nguyên tử carbon trong mạch. Về cơ bản acid béo là một mạch dài các nguyên tử carbon liên kết với nhau và được bao quanh bởi các nguyên tử hydrogen. Ở một đầu của phân tử được xác định là đầu alpha, gắn với một nhóm carboxyl (−COOH). Một đầu còn lại của mạch là đầu cuối (omega), là nhóm methyl (−CH3). (Trong bảng chữ cái Hy Lạp α là ký tự đầu tiên và ω là ký tự cuối). 1.1.2.2. Tính chất vật lý [18], [8] Các phân tử acid béo bão hòa có mạch thẳng, thường dễ gắn chặt với nhau. Ngược lại, các phân tử acid béo bất bão hòa có cấu tạo lệch, do đó chỉ gắn với nhau một cách lỏng lẻo và dễ bị phá vỡ bởi nhiệt độ hơn hơn các acid béo bão hòa. Vì vậy các chất béo giàu acid béo bất bão hòa có nhiệt độ tan chảy thấp hơn các chất béo giàu acid béo bão hòa (đặc biệt các acid béo có chuỗi carbon dài hơn 12 carbon). Tóm lại, mỡ hoặc dầu được phân loại thành bão hòa, bất bão hòa đơn hay bất bão hòa đa dựa trên hàm lượng cao hoặc thấp của các loại acid béo hiện diện. Chiều dài của mạch carbon trong acid béo ảnh hưởng đến độ rắn chắc của triglycerid ở nhiệt độ thường. Cụ thể, các acid béo bão hòa chuỗi dài từ 12 carbon trở lên hiện diện ở những trạng thái rắn khác nhau ở nhiệt độ thường, trong 8 khi các acid béo bão hòa chuỗi vừa từ 6 đến 10 carbon (ví dụ dầu dừa) và chuỗi ngắn dưới 6 carbon hiện diện ở dạng lỏng ở nhiệt độ thường. Các triglycerid chứa các acid béo bất bão hòa đa và đơn cũng tồn tại ở dạng lỏng . Vị trí nối đôi C=C trong chuỗi carbon của các acid béo bất bão hòa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Nếu nối đôi đầu tiên nằm cách 3 carbon so với đầu methyl (omega) của acid béo, nó là acid béo omega-3 (ω-3). Nếu nối đôi đầu tiên nằm cách đầu methyl 6 carbon, nó là acid béo omega-6 (ω-6). Theo qui ước tương tự, một acid béo omega-9 (ω-9) có nối đôi đầu tiên cách đầu methyl của acid béo 9 carbon. Trong thực phẩm, acid α- linolenic (ALA, 18:3 n-3) là acid béo ω-3 chủ yếu; acid linoleic (18:2 n-6) là acid béo ω-6 chủ yếu; và acid oleic (18:1 n- 9) chủ yếu. Bảng 2: Cấu trúc hóa học của các acid béo bất bão hòa tiêu biểu thuộc các nhóm ω-3, ω-6, ω-9. Tên acid Ký hiệu Công thức hóa học α-linolenic 18:3 n-3 CH3CH2(CH=CH_CH2)3(CH2)6COOH Linoleic 18:2 n-6 CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Oleic 18:1 n-9 CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH (Ghi chú: Trong cách viết ký hiệu của acid béo, số thứ nhất biểu thị số carbon, số thứ hai biểu thị số nối đôi và n- (hay ω- ) chỉ nhóm của acid béo bất bão hòa. Cũng có thể sử dụng những cách viết khác, ví dụ như acid oleic có thể được ký hiệu là C18:1 hoặc 18:1.) 1.1.2.3. Phân loại[18],[10] Dựa vào số liên kết đôi để phân loại thì có 3 loại. Liên kết đôi được ký hiệu là ∆ (denta). Vị trí của liên kết đôi trên mạch hydrocarbon ghi ở phía trên, góc phải. a) Acid béo bão hòa (saturated): acid không có nối đôi C=C trong cấu tạo của nó. Công thức cấu tạo: CnH2nO2 Ví dụ: acid palmitic: CH3(CH2)14COOH (C16) Acid stearic: CH3(CH2)16COOH (C18) b) Acid béo bất bão hòa ™ Acid béo bất bão hòa đơn (monounsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa một nối đôi trong cấu tạo của nó. Ví dụ: Acid oleic: C18 có một nối đôi ở C9 Ký hiệu: C18∆9 Công thức hóa học: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH ™ Acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated fatty acids): là những acid béo có chứa hai nối đôi trở lên. Ví dụ: Acid linolenic: C18 có ba nối đôi ở C9, C12, C15 Ký hiệu : C18∆9, 12, 15 9 Công thức hóa học: CH3(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2COOH Acid béo bất bão hòa thường có cấu hình cis C C HH CCH2 H2 Dạng cis (dạng thuyền) Dạng trans (dạng ghế) Đối xứng qua mặt phẳng Đối xứng qua tâm Khi đun nóng có mặt chất xúc tác thì dạng cis chuyển thành dạng trans. Mạch carbon của acid béo no thường ở dạng zic zắc, kéo thành chuỗi dài không cong. Các acid béo không no, có một liên kết đôi dạng cis thì mạch carbon bị uốn cong 30o, càng có nhiều liên kết đôi, mạch carbon càng bị uốn cong nhiều hơn. Có giả thiết cho rằng mạch carbon của acid béo không no dạng cis có ý nghĩa quan trọng đối với màng sinh học. Theo Paul B.Kelter và cộng sự,[14] các nghiên cứu gần đây cho thấy các acid béo dạng trans- trong chế độ ăn có thể liên quan đến sự gia tăng nguy cơ xảy ra các cơn đau tim. Các phân tử không thể chuyển từ dạng cis- sang trans- hoặc ngược lại trong trường hợp bình thường. Khi có sự hydrogen hóa từng phần của acid béo được thực hiện, vài nối đôi còn lại kết thúc ở dạng trans- hơn là dạng cis- ban đầu. Kiểu đồng phân cis- hoặc trans- là nguyên nhân dẫn đến tính chất khác nhau. Vị trí của các nối đôi trong chuỗi carbon của acid béo bất bão hòa đa tạo nên sự khác biệt lớn trong việc cơ thể con người chuyển hóa chúng. Các tế bào của cơ thể của con người chỉ có thể tạo nối đôi C=C trong acid béo kể từ carbon thứ 9 trở đi. Điều này có nghĩa là cơ thể con người không thể tự tổng hợp được acid béo Ω-3 và Ω-6. Do đó 2 loại acid béo nay chỉ có thể được lấy qua chế độ ăn hàng ngày. 1.1.2.4. Nguồn hiện diện acid béo[4] Triglycerid là lipid dự trữ có trong mỡ động vật và dầu thực vật. Trong thực vật: có nhiều ở nhiều cơ quan như củ, quả, hạt (như đã trình bày ở phần trên). Ví dụ: Dầu chiếm 65-70% ở hạt thầu dầu; 40-63% ở hạt vừng; 40-60% ở hạt lạc; 18% ở hạt đậu tương. Ở động vật: trong mô mỡ acid béo chiếm 70-97%; trong tủy sống 14-20% khối lượng tươi. Phần trăm acid béo chứa trong một số loại thức ăn điển hình, acid béo bất bão hòa thường gặp được trình bày trong bảng 3, 4, 5. Bảng 3: Phần trăm acid béo chứa trong một số loại thức ăn điển hình [4] Acid béo không no Nguyên liệu Hàm lượng chất béo (%) Acid béo no (%) Loại một nối đôi (%) Loại nhiều nối đôi (%) Ghi chú Dầu mè 46,4 – 56 12,7 48,1 40 Từ hạt mè Dầu lạc 44,5 19,0 39,0 42 Từ hạt lạt Dầu đậu tương 18,4 15,0 25 60 Từ hạt đậu tương C C H2CH CH2 H 10 Dầu ngô 30 – 40 16,0 30 54 Từ phôi Dầu cám gạo 16 – 18 20,0 40 40 Từ cám gạo Dầu hướng dương 40 – 50 10,0 13 77 Từ hạt hướng dương Dầu dừa 47,6 94,0 5 1 Từ cơm dừa già Dầu cọ 44,63 50 40 10 Từ cơm dầu cọ Mỡ cá ba sa 25 36 35,0 14,7 Từ mỡ phần (mỡ trong) Bơ 83,5 66 30 4 Tách từ sữa Mỡ lợn 20 – 30 47 50 3 Từ con heo Mỡ bò 10 – 20 44 43 26 Từ con bò Bảng 4: Các acid béo thường gặp [28],[35] Tên thông thường Số nguyên tử C Số nối đôi Tên khoa học Nguồn hiện diện Acid butyric 4 0 Acid butanoic Bơ Acid caproic 6 0 Acid hexanoic Bơ Acid caprylic 8 0 Acid octanoic Dầu dừa Acid capric 10 0 Acid decanoic Dầu dừa Acid lauric 12 0 Acid dodecanoic Dầu dừa Acid myristic 14 0 Acid tetradecanoic Dầu cọ Acid palmitic 16 0 Acid hexadecanoic Dầu cọ Acid palmitoleic 16 1 Acid 9-hexadecenoic Mỡ động vật Acid stearic 18 0 Acid octadecanoic Mỡ động vật Acid oleic 18 1 Acid 9-octadecenoic Dầu olive Acid linoleic 18 2 Acid 9,12-octadecadienoic Dầu bắp Acid alpha-linolenic (ALA) 18 3 Acid 9,12,15-octadecatrienoic Dầu hạt lanh Acid arachidic 20 0 Acid eicosanoic Dầu phộng, dầu cá Acid gadoleic 20 1 Acid 9-eicosenoic Dầu cá 11 Acid arachidonic (AA) 20 4 Acid 5,8,11,14-eicosatetraenoic Mỡ gan Acid eicosapentaenoic (EPA) 20 5 Acid 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic Dầu cá Acid behenic 22 0 Acid docosanoic Hạt cải dầu Acid erucic 22 1 Acid 13-docosenoic Hạt cải dầu Acid docosahexaenoic (DHA) 22 6 Acid 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic Dầu cá Acid lignoceric 24 0 Acid tetracosanoic Mỡ các loại Bảng 5: Các acid béo bất bão hòa thường gặp [28] Tên hệ thống Tên thông thường Ký hiệu Trọng lượng phân tử Điểm nóng chảy (oC) Acid 9,12- octadecadienoic Acid linoleic 18:2 (n-6) 280,4 -5 Acid 6,9,12- octadecatrienoic Acid γ- linoleic 18:3 (n-6) 278,4 Acid 8,11,14- eicosatrienoic Acid dihomo-γ- linolenic 20:3 (n-6) 306,5 Acid 5,8,11,14- eicosatetraenoic Acid arachidonic 20:4 (n-6) 304,5 -50 Acid 7,10,13,16- docosatetraenoic - 22:4 (n-6) 332,6 Acid 4,7,10,13,16- docosapentaenoic - 22:5 (n-6) 330,6 Acid 9,12,15- octadecatrienoic Acid α-linolenic 18:3 (n-3) 278,4 -11 Acid 6,9,12,15- octadecatetraenoic Acid stearidonic 18:4 (n-3) 276,4 -57 Acid 8,11,14,17- eicosatetraenoic - 20:4 (n-3) 304,5 Acid 5,8,11,14,17- eicosapentaenoic EPA 20:5 (n-3) 302,5 -54 12 Acid 7,10,13,16,19- docosapentaenoic DPA 22:5 (n-3) 330,6 Acid 4,7,10,13,16,19- docosahexaenoic DHA 22:6 (n-3) 328,6 -44 Acid 6,9,12,15,18,21- tetracosenoic Acid nisinic 24:6 (n-3) 356,6 Acid 5,8,11- eicosatrienoic Acid mead 20:3 (n-9) 306,5 1.1.2.5. Vai trò của acid béo trong sinh học [23] „ Thành phần cơ bản của lipid và chất béo „ Thành phần quan trọng trong cấu trúc màng tế bào. „ Giúp cho sự vận chuyển các chất dinh dưỡng hòa tan trong chất béo ngang qua màng tế bào cũng như trong máu. „ Quan trọng cho sự phát triển của não. „ Quan trọng cho sự sản sinh năng lượng, duy trì thân nhiệt. „ Hoạt động như những tiền chất của một số hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm prostaglandin, prostacyclin và leukotriene. „ Quan trọng cho sự tăng trưởng. „ Quan trọng trong việc duy trì một làn da khỏe mạnh. 1.1.3. Tổng quan về acid docosahexaenoic 1.1.3.1. Cấu trúc hóa học[10] Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là : CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2COOH Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -440C. DHA còn được kí hiệu là 22:6 n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. Hình 1: Cấu trúc không gian của acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. [1] 1.1.3.2. Tác dụng của DHA đối với cơ thể a) Tác dụng đối với bào thai và trẻ sơ sinh[25] 13 Trẻ sơ sinh không có khả năng chuyển tiền tố DHA từ dầu thực vật hay thức ăn thay thế sữa mẹ khác sang DHA nên người mẹ phải làm động tác trung chuyển đó, bằng cách sử dụng nhiều các sản phẩm có chứa DHA rồi cho con bú. Sự phụ thuộc vào DHA nhiều nhất là ở bào thai trong suốt 3 tháng cuối thai kỳ và trẻ sơ sinh trong suốt ba tháng đầu sau khi sinh. Trong sữa mẹ chứa: 12% acid linoleic, 0,5% acid alpha linolenic, 0,6% acid arachidonic, 0,3% DHA trong tổng số trong lượng acid béo. b) Tác dụng đối với thị giác [1] và màng tế bào [26] Sự cạn kiệt DHA ảnh hưởng đến các thụ thể nằm trên màng là rhodopsin và làm thay đổi chức năng của nó. Sự thiếu DHA làm giảm hoạt động thần kinh của võng mạc, làm giảm độ nhạy của thị giác, làm thay đổi những phản ứng hành vi và gây ra những cơn khát bất thường, và cả những phản ứng bất thường về thính giác và khứu giác. Những sự bất thường này có thể được gây ra do những receptor bề mặt bị ảnh hưởng do thiếu DHA. Khi được ester hóa vào trong những phospholipid màng, DHA làm thay đổi một cách đáng kể nhiều tính chất cơ bản của màng tế bào. Sự tương tác của DHA với những lipid khác trên màng, đặc biệt là cholesterol, có thể đóng một vai trò nổi bật trong việc điều hòa cấu trúc và chức năng cục bộ của màng. DHA giúp giảm 50% nguy cơ mắc bệnh cận thị khi lớn lên. c) Tác dụng đối với não[38],[27],[36] Não được tạo nên từ hàng tỷ tế bào thần kinh gọi là neuron. Cấu tạo gồm vỏ myelin phủ lên đầu axon của tế bào giống như một dây điện được cách ly bằng việc phủ lên nó chất cách điện. Nó gia tăng sự dẫn truyền dòng điện một chiều dọc theo axon. Thiếu chất dinh dưỡng để tạo nên myelin, như acid béo thiết yếu, sẽ làm trì hoãn việc dẫn truyền thần kinh. Chất dẫn truyền thần kinh như: serotonin, dopamin, và norepinephrine truyền thông tin từ một tế bào đến các tế bào khác. Não chỉ chiếm 2% trọng lượng cơ thể nhưng dùng hết 20% lượng ôxy và 40% lượng gluxid ta hấp thụ được. Não được cấu tạo chủ yếu từ lipid. Khoảng 2/3 não bộ được tạo nên từ những acid béo. Chúng là thành phần cơ bản của màng tế bào, qua màng này sẽ diễn ra sự giao lưu, liên lạc với mọi tế bào thần kinh trong các vùng của não và cơ thể. Acid béo trong phosphatidylethanolamine của màng tế bào chất xám ở người khoảng 25% DHA, 25% stearic, 14% arachidonic, 12% oleic. d) Tác dụng đối với huyết áp và hàm lượng lipid trong huyết tương[3],[39] Trong máu, cholesterol được chất đạm protein chuyên chở và được gọi là lipoprotein. Tùy theo tỷ lệ protein nhiều ít, ta có lipoprotein tỷ lệ thấp LDL (Low density lipoprotein), hay tỷ lệ cao HDL (high density lipoprotein). HDL đưa cholesterol vào tích trữ trong gan để rồi được phế thải ra khỏi cơ thể, do đó làm bớt mỡ lưu thông trong máu, giảm nguy cơ đóng mỡ ở thành động mạch, giảm nguy cơ bệnh vữa xơ động mạch. Ngược lại LDL chuyển cholesterol vào các tế bào của cơ thể. Khi cholesterol trong máu lên cao, tế bào không đủ chỗ nhận cholesterol, hóa chất này sẽ lởn vởn trong máu và tăng gia sự đóng bựa ở thành động mạch. DHA hạ thấp lượng triglyceride, làm tăng độ lỏng của màng tế bào hồng cầu, từ đó làm tăng độ biến dạng, khả năng linh hoạt để chúng có thể di chuyển dễ dàng qua các mao mạch, dẫn đến việc giảm độ nhớt của máu và giảm huyết áp. DHA làm giảm huyết áp bằng cách giảm hàm lượng cortisol trong máu. e) Tác dụng đối với các bệnh tim mạch[10],[39] 14 Trong bệnh vữa xơ động mạch, thành động mạch có những bựa giống như cháo gồm có cholesterol và tế bào máu đóng vào, khiến nó trở nên gồ ghề, thu hẹp gây trở ngại cho sự vận chuyển của máu. Máu huyết tới tim giảm, tim kém được nuôi dưỡng, giảm hoạt động rồi một lúc nào đó đưa đến cơn kích tim. Những miếng bựa có thể bứt rời thành mạch máu, ngao du khắp cơ thể theo hệ tuần hoàn gây ra nghẽn mạch. Lên đến não nó tạo ra tai biến mạch máu não, tới tim nó gây ra nhồi máu cơ tim. DHA có tác dụng ngăn ngừa tiểu huyết cầu dính với nhau, và còn có tác dụng ngăn các mảng vụn bám vào vách mạch máu do đó giúp mạch máu khỏi bị nghẽn, tránh được nguy cơ nhồi máu cơ tim. DHA tinh khiết còn làm giảm độ nhớt của máu. DHA và EPA (acid eicosapenraenoic) trong màng tế bào tim được phóng thích khi có sự thiếu hụt của dòng máu đi đến một phần của tim. Hai loại acid này bảo vệ những tế bào tim khỏi việc tham gia vào hoạt động nhanh của tim, liên quan đến sự gia tăng nguy cơ đột tử. f) Tác dụng đối với sự viêm[22],[25] Dầu cá được sử dụng như là một chất chống viêm trong bệnh viêm khớp mãn tính. Mặc dù DHA dễ bị oxide hóa hơn acid arachidonic (AA), các sản phẩm phân hủy của AA (endoperoxide và eicosanoid) tạo ra nhiều gốc tự do hơn sản phẩm của DHA nhưng DHA cũng ức chế sự tổng hợp nitric oxide (làm giảm sự hình thành các gốc tự do peroxynitrite) và ức chế sự phiên mã yếu tố NF-κB (giảm sự hình thành các cytokine tiền phản ứng viêm). Các cytokine và các yếu tố điều hòa sự viêm khác như interleukin IL và yếu tố hoại tử khối u TNF có một hoạt động tế bào tiền phản ứng viêm. DHA cùng với acid eicosapentaenoic ức chế sự hình thành các cytokine IL-1β và TNF-α qua một cơ chế hiện vẫn chưa được biết đến. g) Tác dụng đối với bệnh thấp khớp [10] DHA có khả năng ngăn chặn phản ứng của hệ miễn dịch gây ra chứng viêm khớp, khiến khớp bớt cứng và sưng, làm thuyên giảm các triệu chứng của bệnh này. Một số công trình nghiên cứu khi cho bệnh nhân dùng những liều dầu cá từ 2-4g, thậm chí 5g/ngày, đã cho một số kết quả khá hứa hẹn: khớp bớt cứng và ít đau hơn. h) DHA và bệnh ung thư [3] Noding và các cộng sự đã quan sát được rằng sự nhạy cảm của các tế bào khối u in vitro đối với DHA và những sản phẩm oxid hóa của DHA phụ thuộc vào trạng thái chống khối u. Có bằng chứng đề nghị rằng các ω-3 LC PUFAS, đặc biệt là DHA, làm tăng sự nhạy cảm của các tế bào ung thư đối với các tác nhân chống ung thư vú và các tiền chất oxid hóa. Đề nghị này được ủng hộ bởi các kết quả nghiên cứu có uy tín của Bougnoux và các cộng sự, người đã theo dõi phản ứng được cải thiện đối với việc hóa trị liệu (chemotherapy) ở những bệnh nhân ung thư vú có hàm lượng DHA cao trong mô mỡ ở ngực. i) Ăn nhiều cá giúp bạn bớt … cáu bẳn[37] Các nghiên cứu đang chứng minh cho thấy, thiếu acid béo trong chế độ ăn sẽ làm cho chúng ta... dữ dằn hơn và kém thông minh hơn. Tiến sĩ Jackie Stordy, cựu trưởng khoa nghiên cứu dinh dưỡng đại học Surrey (Anh) cho biết sự hấp thu nhiều cá giàu acid béo có mối liên hệ tới khả năng làm dịu đi sự hằn học, cáu bẳn. Thực phẩm có tác động trực tiếp đến cảm xúc và tâm trạng. 1.1.3.3. Nguồn hiện diện và tình hình nghiên cứu DHA.[29] DHA được tìm thấy nhiều ở cá, đặc biệt là các loại cá béo, chứa nhiều mỡ và dầu như cá trích, cá thu, cá mòi, cá hồi, cá ngừ, cá tuyết và các loại cá da trơn. Vài loại thực vật nhất định bao gồm dầu đậu nành và dầu cải cũng chứa tiền 15 chất của DHA là α-linolenic acid. Ngoài ra, DHA cũng là một trong những acid béo chính trong thành phần acid béo của một số loài vi nấm sống ở biển như Tharaustochytrium roseum, T. aureum và Schizochytrium aggeratum.[2] Hiện nay, dầu cá là nguồn thu nhận DHA chủ yếu, nhưng DHA cũng có thể được sản xuất bằng cách sử dụng vi sinh vật. Các vi sinh vật biển có thể chứa một lượng lớn DHA và được xem như là nguồn thu nhận hiệu quả của acid béo quan trọng này. Vài loài trong đó có thể tăng trưởng theo lối dị dưỡng trên những chất nền hữu cơ ở điều kiện không có ánh sáng (như vi tảo crypthecodinium cohnii). Gần đây đã có nhiều tiến bộ trong việc sản xuất DHA trong công nghệ sinh học từ các vi sinh vật biển.[5],[11] Như vậy, DHA có trong mỡ cá vùng biển sâu, vùng Green land Nhật Bản, hoặc đi theo con đường tổng hợp nhưng hiện nay đã xác định được trong thành phần mỡ cá basa Việt Nam (Pangasius baucourti) cá nước ngọt, nuôi bè trên dòng sông Mêkông không những có đủ thành phần acid béo không no – acid béo thiết yếu mà còn có thành phần DHA. Ở Việt Nam hiện nay phát hiện có 2 loại cá chứa DHA đó là cá tra và cá ba sa với thành phần chất béo như bảng 6. Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng của cá tra, cá basa [30] Thành phần dinh dưỡng trên 100g sản phẩm ăn được Tên Calo (cal) Calo từ chất béo Tổng lượng chất béo (g) Chất béo bão hòa (g) Cholesterol (mg) Natri (mg) Protein (g) Cá tra 124,52 30,84 3,42 1,64 25,2 70,6 23,42 Cá basa 170 60 7 2 22 70,6 28 Qua bảng 6 nhận thấy rằng nguồn dinh dưỡng của cá ba sa nhiều hơn đặc biệt là tổng lượng chất béo, đó là lý do hiện nay ở nước ta đang cố gắng làm giàu DHA, tiến tới tách DHA từ mỡ cá basa dần dần khỏi phải nhập ngoài, để bổ sung vào sản phẩm thực phẩm nhằm góp phần cho con em chúng ta sau này thông minh hơn, khỏe mạnh hơn. Hình 2: Cá tra Tên khoa học: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878) 16 Hình 3: Cá basa Tên khoa học: Pangasius bocourti (Sauvage, 1880) 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CÔ LẬP DHA 1.2.1. Phương pháp chưng cất phân đoạn bằng li tâm phân tử[19] Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa hàm lượng acid béo lần lượt là 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 45oC, làm lạnh trong 18 giờ ở 16oC, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 13oC qua đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, làm khan dung dịch ether với Na2SO4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. 1.2.2. Phương pháp sắc kí khí định lượng (preparative scale gas chromatography)[16] Dầu gan cá tuyết chứa 3 loại acid béo không bão hòa cần thiết (C18:4, C20:5, C22:6) được xà phòng hóa, và acid được tìm thấy có chỉ số iod là 205. Phổ UV cho thấy sự hiện diện của 0,11% nối đôi liên hợp và 0,07% nối ba liên hợp, những đồng phân khác không hiện diện. Từ 200g dầu, polyenoic ester được cô đặc bằng phương pháp urea – MeOH và hydro hóa để cho 36,5g các acid có giá trị iod 401. Hỗn hợp này được ester hóa với MeOH-H2SO4 và hỗn hợp ester qua sắc kí cho thấy có chứa 11% C18:4, 32,6% C20:5 và 49,7% C22:6, trong khi phổ UV cho thấy 1,5% nối đôi tiếp cách. Sắc kí định lượng được tiến hành trên cột cao 152,4 cm được nhồi bằng 5% Apiezon trên Chromosorb G. Dòng khí N là 150ml/phút. Nhiệt độ cột và ống góp là 225oC. Phân đoạn thu được có thể được là tinh sạch hơn bằng sắc kí cột. 1.2.3. Phương pháp sắc kí cột (column chromatography)[12] Các acid béo bất bão hòa và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc kí cột sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc CO2 lỏng như là pha động và oxid nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Việc xử lý trước, tốt nhất là với NaOH trong dung môi nước hữu cơ, cho thấy những kết quả được cải thiện với acid béo bất bão hòa đa. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate và cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc kí cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0,5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng. 17 Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane. 0,1ml dichloromethane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải li tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc kí cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng l3 với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải li cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. 1.2.4. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) [20] CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 33oC và áp suất thấp 17.7MPa để tránh sự oxid hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Các acid béo được trích ly từ cá bằng cách sử dụng một máy đặc biệt gọi là “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). Ba mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), ba mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 45oC) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 40oC và 300 phút. 1.2.5. Phương pháp sắc ký điều chế với pha tĩnh được sử lý với nitrate bạc (silver nitrate method) [8] Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc kí lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 100oC. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bản mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. 18 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.1. Phương pháp transester hóa [13] Trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật, một triglycerid sẽ phản ứng với một alcol có mặt chất xúc tác sẽ thu được sản phẩm là một hỗn hợp alkyl ester của acid béo và glycerin. Phương trình phản ứng : 3ROH C C C H2 H2 H OH OH OH R1COOR R2COOR R3COOR xuùc taùc CH2 O R1 O C O R2 CH2 O C O R3 CH C O Triglycerid Rượu Glycerin Hỗn hợp akyl ester Để thực hiện phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật có thể sử dụng các loại xúc tác khác nhau như: 1.3.1.1. Sử dụng xúc tác acid[33],[9] a) Ưu điểm: Là loại xúc tác cơ bản từ lâu đời. Dễ sử dụng, cho hiệu suất cao, rẻ tiền. b) Nhược điểm: Quá trình transester hóa được xúc tác bằng acid Bronsted như acid sulfuric cho một hiệu xuất rất cao nhưng lại xảy ra chậm, đòi hỏi nhiệt độ trên 100oC và 3giờ mới đạt độ chuyển hóa hoàn toàn. Ngoài ra, phản ứng trên phải được thực hiện trong môi trường không có nước để tránh có sự cạnh tranh tạo ra acid carboxilic làm giảm hiệu suất phản ứng. Thiết bị phản ứng mau hư do bị ăn mòn. Theo William W. Christie (Scotland) thông thường lipid được hòa tan trong chất phản ứng và hỗn hợp được đun nóng khoảng 2 giờ, nhưng nó có thể cũng được đun nóng trong ống kín ở nhiệt độ cao và thời gian ngắn hơn. Lượng xúc tác H2SO4 cho vào khoảng 1-2% trong dung môi là methanol. 1.3.1.2. Sử dụng xúc tác bazơ [9],[31] Xúc tác bazơ thường được sử dụng trong công nghiệp như: NaOH, KOH, Carbonat kim loại kiềm, CH3ONa,… Trong đó, CH3ONa được xem là xúc tác hoạt động tốt nhất (cho hiệu suất trên 98% trong 30 phút với một lượng nhỏ 0,5%). a) Ưu điểm: - Xúc tác bazơ ít có tính ăn mòn đồng thời cũng thúc đẩy tiến trình xảy ra nhanh hơn khi so sánh với xúc tác acid. - Giá thành rẻ (KOH, NaOH). Việc tăng nồng độ xúc tác lên khoảng 1% hoặc 2% là có hiệu suất cao không kém gì alkoxid kim loại. - K2CO3 được dùng với nồng độ 2% hoặc 3% cũng cho hiệu suất cao đồng thời tránh được sự thủy phân ester do bicarbonat được tạo thành thay vì nước ở xúc tác hydroxyd. 19 b) Nhược điểm: - KOH và NaOH với giá thành rẻ nhưng kém hoạt động hơn K2CO3, CH3ONa. Tuy nhiên, với loại xúc tác hyroxyd này sẽ làm sản sinh ra một lượng nước ngay cả trong môi trường khan nước ban đầu (do phản ứng với rượu), điều này sẽ làm giảm hiệu suất phản ứng (do có nước sẽ thúc đẩy quá trình thủy phân ester tạo thành). - Việc sử dụng xúc tác bazơ mạnh trong phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật rất dễ xảy ra quá trình xà phòng hóa, điều đó dẫn đến làm giảm hiệu suất phản ứng và việc tách loại ester và glycerin tạo thành cũng gặp khó khăn. Theo nghiên cứu của trường đại học Idaho [31], quá trình transester hóa dầu cải chịu tác động của nhiều yếu tố: 1) nhiệt độ, 2) xúc tác, 3) tốc độ khuấy trộn, 4) nước trong alcol được sử dụng, 5) lượng alcol dư được sử dụng. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là: 1) nhiệt độ phòng, 2) xúc tác NaOCH3 0,5% hoặc KOH 1% so với trọng lượng dầu cải, 3) tốc độ khuấy trộn nhanh, mãnh liệt trong những giai đoạn đầu của phản ứng và không quan trọng lắm sau khi đã trở thành hỗn hợp đồng nhất, 4) ethanol tuyệt đối thì cho tốc độ chuyển hóa nhanh, 5) lượng alcol dư là hơn 50% đối với NaOCH3 và hơn 100% đối với KOH. Theo cuộc nghiên cứu đó thì quá trình transester hóa trải qua ba giai đoạn: 1) phản ứng transester hóa, 2) sự phân lớp, 3) quá trình rửa. 1.3.1.3. Sử dụng xúc tác enzym[41],[42] Sự tạo thành acid docosahexaenoic (DHA) đã được nghiên cứu trong dầu cây anh thảo (Oenothera biennis L) và dầu cây borage (Borago officinalis L.) (một loại cây mà hoa và lá được dùng làm món sà lát và tạo hương vị cho thức uống) bằng con đường transester hoá với xúc tác lipase.[41] Có 6 loại lipase: Novozym 435 từ Candida antarctica, Lipozyme IM từ Mucor miehei, PS-30 từ Pseudomonas sp., AP-12 từ Aspergillus niger, AY-30 từ Candida rugosa, và Novozym-677BG từ Thermomycelanuginosus được kiểm tra cho khả năng hợp thành DHA (22:6 ω-3) trong dầu cây anh thảo. Trong số các enzym đã ví dụ thì Novozym 435 từ Candida antarctica được chọn làm xúc tác cho phản ứng transester hóa vì lý do hợp thành DHA cao. Khi có sự tập trung của enzym cao, tỷ lệ chất nền, và thời gian ủ tăng thì sự hợp thành DHA cũng tăng. Trong một tiến trình phản ứng sự hợp thành DHA tăng lên 25,2% sau 24giờ. Cao nhất là 37,4% khi tỷ lệ dầu cây anh thảo/DHA là 1/3. Cây anh thảo[42] (Oenothera biennis L.) là cây hai năm thuộc họ dừa nước (Onagraceae) là một loại cây thông thường sống ở Bắc Mỹ. Điều thú vị là dầu anh thảo có chứa γ-linolenic acid (GLA; 18:3 ω-6) (Senanayake và Shahidi, 1999a). Ưu điểm:[14] Đa số các enzym làm xúc tác đều được thực hiện ở điều kiện bình thường (nhiệt độ phản ứng là 20-40oC), không tốn năng lượng và không đòi hỏi thiết bị phức tạp. Các chất thải enzym dễ bị phân hủy nên không gây ô nhiễm môi trường. Hiệu lực xúc tác của enzym lại rất lớn (vận tốc phản ứng gấp 108-1011 lần) so với những phản ứng dùng xúc tác hóa học thông thường. Nhược điểm:[14] Mỗi loại enzym chỉ xúc tác nên một số chất nền và kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử. Ngoài ra, việc sử dụng xúc tác enzym có mặt hạn chế là thời gian phản ứng rất lâu (20 giờ). Đồng thời phải tìm được loại enzym phù hợp với đối tượng nghiên cứu. 20 1.3.1.4. Xúc tác zeolit[9] Trong những năm gần đây, người ta thường ứng dụng xúc tác acid, bazơ rắn,… đặc biệt là zeolit đang được xem là một chất xúc tác hiệu quả cho phản ứng transester hóa dầu mỡ động thực vật do có một số ưu điểm nổi bật sau: • Có tính chọn lọc cao • Việc tách các sản phẩm sau phản ứng dễ dàng. • Xúc tác zeolit sau khi thu hồi có thể sử dụng lại. • Hiệu suất phản ứng cao • Phản ứng không sinh ra sản phẩm phụ (do không có hiện tượng xà phòng hóa so với các xúc tác bazơ cổ điển). Ngoài ra người ta còn thường sử dụng các chất xúc tác khác cho hiệu quả cao nhưng qui trình thực hiện lại khá phức tạp. Ví dụ như sử dụng chất xúc tác calicined Mg-Al hydrotalcites[43]. Xúc tác này gồm: 187ml dung dịch chứa Mg/Al theo tỷ lệ Mg(NO3)2.6H2O và Al(NO3)3.9H2O (tổng metal nitrat, 0,375mol), thêm từ từ 187ml dung dịch thứ hai chứa NaOH (0,4375 mol) và Na2CO3 (0,1125 mol), pH = 8-10. Trong phần thực nghiệm này chúng tôi không sử dụng xúc tác là Zeolit vì qui trình tổng hợp hơi phức tạp. Chúng tôi sử dụng loại xúc tác có sẵn là bazơ (KOH, NaOH) rẻ tiền và kinh tế với hàm lượng nhỏ khoảng 1-2%. 1.3.2. Phương pháp làm giàu DHA 1.3.2.1. Phương pháp sắc kí cột[12] Theo Teshima, S. et al [40], mô tả về phương pháp cô lập của EPA và DHA từ dầu cá bằng xà phòng hóa với ethanol xúc tác KOH. Phần metyl ester của acid béo thô được làm tinh bằng sắc kí cột trên silica gel và sau đó EPA được phân chia ra khỏi DHA bằng sắc kí cột trong hỗn hợp bạc nitrat và silica gel. Sắc ký pha lỏng trên cột (Sắc ký cột hở) là tên gọi chung cho một số hệ thống vật lý trong đó một cột được nạp chặt chẽ bởi chất hấp thu và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Sắc ký cột nhanh khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc giải ly của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được. Ưu điểm của sắc ký nhanh cột khô là nhờ có lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly nên thời gian triển khai nhanh hơn sắc ký cột cổ điển. Ngoài ra, kỹ thuật này còn có thuận lợi là sử dụng các thiết bị có sẵn trong phòng thí nghiệm (phễu, bình tam giác, vòi nước tạo áp suất kém.v.v…). Hệ thống bao gồm: phễu lọc xốp thủy tinh loại 150ml, fiole, và hệ thống tạo áp suất bằng vòi nước (20-70 mmHg). Chất hấp thu là silica gel khô vào phễu đến tận miệng, gõ nhẹ ngoài thành phễu để chất hấp thu gọn lại. Gắn phễu vào hệ thống tạo áp suất kém và dùng nút thủy tinh có đáy bằng để nén ép đều silica gel xuống đáy phễu, tạo thành một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt bằng phẳng. Chiều cao của chất hấp thu sau khi nén cao khoảng 5cm. Tiền giải ly cột bằng ether dầu hỏa. Rót dung môi lên đầu cột, gắn vào hệ thống tạo áp suất kém, dung môi sẽ đi xuống xuyên qua cột. Thực hiện vài lần để có cột đồng nhất. Cột được rút khô, tắt áp suất kém. 1.3.2.2. Phương pháp tủa urê [40],[43] 21 Các acid béo bất bão hòa đa (polyunsaturated fatty acid(s)) có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp, tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những acid béo bất bão hòa đa được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê. Đây là một phương pháp để tách các acid béo bão hòa ra khỏi acid béo bất bão hòa dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) với các acid béo bão hòa ở nhiệt độ thấp. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này có thể gia tăng hàm lượng acid béo bất bão hòa đặc biệt là omega-3 trong hỗn hợp lên đến 60-85% (trong trường hợp là dầu cá hồi). Trong việc xử lý với urê, urê được thêm vào dung môi hữu cơ mà có thể hòa tan được cả urê và cả acid béo trong đó, ví dụ như methanol, ethanol, isopropanol, ether dầu hỏa, benzen, trichoroethylene và methyl isobutyl ketone. Ethanol được sử dụng tốt hơn do ít độc. Urê được hòa tan trong dung môi, nếu cần thiết thì đun nóng, lượng urê cho vào khoảng từ 10 – 20%. Dung dịch urê và hỗn hợp ester của acid béo được trộn chung với nhau. Khi trộn hỗn hợp acid béo vào trong dung dịch urê tốt hơn hết là hỗn hợp acid béo được pha loãng trong dung môi hữu cơ để tạo khả năng bảo vệ acid béo chống lại nhiệt độ cao của dung dịch urê. Lượng dung môi urê được điều chỉnh để tối thiểu là 0,5 phần trọng lượng. Dung dịch urê được trộn thành một hỗn hợp đồng nhất với acid béo. Urê sau đó sẽ được tủa bằng cách làm lạnh hỗn hợp. Vào lúc này acid béo bão hòa trong hỗn hợp acid béo sẽ hình thành phức với tinh thể urê và tủa xuống. Sự làm lạnh được kiểm soát bằng cách để dung dịch trong một khoảng thời gian thật lâu, nếu được yêu cầu (thường là qua đêm). Urê kết tinh khi có sự hiện diện metyl ester của acid béo, nó hình thành nên tinh thể hình lục giác có lỗ rỗng ở giữa, với lỗ rỗng này một vài acid béo có thể lọt vừa khít vào và nhờ thế được lọc, loại bỏ ra khỏi dung dịch. Acid béo mạch thẳng thì hình thành phức dễ dàng , nhưng acid béo, ester có nối đôi hoặc cầu metyl làm tăng mức độ phức tạp của cấu tạo thì hình thành kết tinh khó hơn hoặc không thể kết tinh. Khi tiến trình kết tinh hoàn thành, acid béo bão hòa và một phần acid béo bất bão hòa tạo phức, trong khi đó acid béo bất bão hòa đa, có phân nhánh, hoặc có vòng sẽ ở lại trong dung dịch. Phương pháp: Metyl ester (100mg) trộn trong hexan (4ml), methanol (1ml) và urê (1,5g). Để qua đêm, phần rắn được lọc ra khỏi dung dịch và rửa với hexan, phần được rửa và phần lọc trộn chung rồi rửa lại với nước, làm khô bằng muối sulfat natri khan và làm bay hơi. Còn lại phần bất bão hòa và/hoặc có phân nhánh. Một phương pháp khác từ Shucheng Liu và cộng sự[43]: Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kỹ ở 60 – 70oC đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Ban đầu để kết tinh ở nhiệt độ phòng sau đó ở các nhiệt độ khác nhau (25oC, 15oC, 0oC, -15oC, -25oC). Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -5oC trong 20 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H2SO4 đậm đặc sao cho pH = 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp: lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa. 22 1.3.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng [7] Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn lỏng; trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp thụ trơ. Chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng. Loại bản mỏng được sử dụng trong đề tài này là bản nhôm tráng silica gel có trộn thêm chất phát huỳnh quang (Merck) và sắc ký lớp mỏng được khai triển theo kiểu dung môi giải ly di chuyển xuống. Mẫu chất cần phân tích được hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất thành một vết nhỏ gọn lên tấm lớp mỏng; vết chấm ở cách vị trí đáy 1 cm. Sấy nhẹ để đuổi một phần dung môi hòa tan mẫu, như thế mẫu chất chỉ còn ở dạng bột khô trên tấm bản mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng, vào trong một ly có chứa sẵn một loại dung môi phù hợp (chiều dày của lớp dung môi không quá 1cm). Trước khi đặt bản vào ly, ly đựng dung môi phải ở trạng thái bão hòa dung môi để có được một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách phủ lên bề mặt trong cua ly một tờ giấy lọc có tẩm ướt dung môi dùng để giải ly. Dung môi sẽ được lực mao quản hút di chuyển cao lên trong tấm bản, quá trình như thế thì sẽ phân chia hỗn hợp mẫu chất ban đầu thành những vết riêng biệt. Khi dung môi lên gần hết tấm bản (còn cách khoảng 0,5cm), lấy tấm bản ra khỏi bình, sấy khô. Các vết mẫu được xác định bằng phương pháp hóa học với dung dịch thuốc thử là H2SO4 đậm đặc. Bản mỏng sau đó được lưu trữ trong bao plastic. Dung môi giải ly phù hợp là dung môi có thể làm cho hỗn hợp các chất ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau. Các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 - 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 - 0,7). Mỗi hợp chất sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Rf được tính bằng công thức: Mục đích chính của sắc ký lớp mỏng trong bài thực nghiệm này là để theo dõi diễn tiến của quá trình transester hóa . Sắc ký lớp mỏng có các ưu điểm: ¾ Mẫu để phân tích chỉ cần một lượng rất ít. ¾ Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. ¾ Việc triển khai sắc ký nhanh, nên trong một thời gian ngắn có thể biết kết quả mẫu cần phân tích. ¾ Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. ¾ Sau quá trình giải ly, dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hoặc hóa học để phát hiện sự hiện diện chất, nên không phải lo đến vấn đề hậu sắc ký như ở sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 1.4. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ CÁ BASA Ở VIỆT NAM 1.4.1. Phân loại [17] Cá Basa là một trong số 11 loài thuộc họ Cá tra (Pangasiidae) đã được xác định ở sông Cửu Long. ™ Giới động vật Animalia Rf Khoaûng ñöôøng di chuyeån cuûa hôïp chaát Khoaûng ñöôøng di chuyeån cuûa dung moâi Rf  1 23 ™ Ngành có giây sống hoàn chỉnh Chordata ™ Ngành phụ có xương sống Vertebrata ™ Nhóm có hàm Gnathostomata ™ Tổng lớp cá Pisces ™ Lớp cá xương Osteichthyes ™ Lớp phụ cá vây tia Actinopterygii ™ Tổng bộ cá toàn xương Teleostei ™ Bộ cá nheo Siluriformes ™ Họ Chilbeidea ™ Giống Pangasasius ™ Loài Pagasius bocourt (Sauvage, 1880) (Cấp phân loại từ giới đến bộ được tham khảo từ tác giả Trần Thanh Tòng) 1.4.2. Đặc điểm cá basa [32] Cá basa phân bố ở sông Tiền và sông Hậu; có tập tính di cư ngược dòng sông Mekong để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên; có tính ăn tạp thiên về động vật. Trên thế giới có bốn nước ở lưu vực sông Mekong: Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan nuôi cá basa. Ở Việt Nam, cá basa được nuôi thương phẩm chủ yếu trong bè trên sông nước chảy vì chịu đựng kém ở môi trường có hàm lượng oxi hòa tan thấp. Khu vực ương nuôi cá giống tập trung chủ yếu ở huyện Hồng Ngự (Đồng Tháp) và huyện Châu Đốc (An Giang), nay phát triển nhiều ở Cần Thơ… Hiện nay riêng An Giang có hơn 2.300 bè nuôi cá basa với sản lượng khoảng 23.000 tấn. Bụng cá trắng bạc, và đặc biệt có buồng mỡ rất lớn, chiếm khoảng 25% khối lượng cá. Lượng mỡ cá basa thu hồi từ các cơ sở chế biến thủy sản hàng năm 4000 - 5000 tấn mỡ cá. 1.4.3. Những sản phẩm từ mỡ cá basa [33] Trước đây, lượng mỡ lớn từ cá basa chưa được chế biến công nghiệp, chưa tinh luyện nên chưa đạt chỉ tiêu dầu mỡ thực phẩm. Chủ yếu là chiên mỡ cá, bằng gia nhiệt trực tiếp thành dạng lỏng, sau đó đem trộn với mỡ heo bán cho tư nhân hoặc bán ở vùng cao, Campuchia, Trung Quốc… Ngoài ra, mỡ cá thô sau khi tinh luyện làm dầu thực phẩm, được phối trộn sử dụng thay thế shortening- một loại mỡ để chiên mì ăn liền hay đem phối chế sản xuất margarin. 1.4.3.1. Tách chiết mỡ lỏng từ mỡ cá basa[32] Qui trình công nghệ chiết tách mỡ lỏng từ mỡ cá basa được trình bày trong sơ đồ 1. Tỷ lệ acid béo không bão hòa và bão hòa có trong nguyên liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô được trình bày trong bảng 8. Nhận xét với loại cá basa đạt trọng lượng 1 - 1,5kg: - Tỷ lệ mỡ cá so với trọng lượng cá 25% - Trong đó tỷ lệ mỡ phần (mỡ trong) 12,03% - tỷ lệ mỡ bụng (mỡ ngoài) 12,25% Mỡ cá thô có đặc tính: 24 - Tỷ trọng 30oC 0,917 - Chỉ số chiết quang ở 40oC 1,460 - Chỉ số acid 0,22 mg KOH/g - Chỉ số peroxyd 4 ml Na2SO3 - Chỉ số xà phòng 196,96 mg KOH/g - Chỉ số Iod 78,72 g I2/100g Hiệu suất thu hồi mỡ cá lỏng: - Ðạt 94-95% so với trọng lượng mỡ phần (mỡ trong) - Ðạt 60-62% so với trọng lượng mỡ bụng (mỡ ngoài) Mỡ cá basa thô nên tách riêng 2 phần - Phần đặc chiếm 10% (tạm gọi mỡ cá basa) - Phần lỏng chiếm 90% (tạm gọi dầu cá basa) Sơ đồ 1: Qui trình công nghệ chiết tách mỡ lỏng từ mỡ cá basa Mỡ cá (mỡ phần hay mỡ bụng) Rửa và làm sạch trong nước lạnh (xay nhỏ 3- 5mm) Gia nhiệt gián tiếp (hơi nước 1kg/cm2, 90-95oC) Ép cơ học Mỡ cá lỏng 25 Rửa bằng dung dịch nước muối 10% Lắng tách nước Mỡ lỏng sạch Bảng 7: Tỷ lệ acid béo không bão hòa và bão hòa có trong nguyên liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô (*) Thứ tự Nguyên liệu Acid béo loại một nối đôi (%) Acid béo loại nhiều nối đôi (%) Acid béo bão hòa (%) 1 2 3 4 5 6 Dầu dừa Dầu cọ Bơ Mỡ heo Mỡ bò Mỡ cá basa thô 5,00 40,00 30,00 50,00 43,00 31,52 1,0 10,0 4,0 3,0 2,6 12,72 94,00 50,00 66,00 47,00 44,4 44,35 (*) Thông tin lấy từ dầu cọ của hiệp hội những người phát triển dầu cọ Malaysia năm 96 (Malaysian Palm Oil Promotion Council 96). Thành phần mỡ cá basa có acid béo một nối đôi 31,5%, nhiều nối đôi 12,72% và acid béo bão hòa 44,35% gần tương đương với đầu cọ nhập ngoại. 1.4.3.2. Tinh luyện mỡ cá basa thành dầu mỡ thực phẩm[32] Từ kết quả nghiên cứu, các cơ sở khai thác chế biến mỡ cá basa tiến hành tinh luyện thành dầu mỡ thực phẩm, mục đích để tận dụng triệt để các sản phẩm phụ từ mỡ cá: phần đặc sau khi tinh luyện phối trộn thay thế shortening chiên mì ăn liền, phần lỏng làm dầu thực phẩm phối trộn thành dầu ăn, sản xuất margarin có thành phần mỡ cá đặc biệt có ω-3 đạt 0,34% rất tốt cho trẻ em, người già. Thành phần acid béo trong mỡ cá basa thô và sau khi tinh luyện được trình bày ở bảng 8. Bảng 8: Thành phần acid béo trong mỡ cá basa thô và sau khi tinh luyện 26 Trong mỡ cá sau tinh luyện (%) Thứ tự Thành phần acid béo Trong mỡ cá thô (%) phần lỏng (%) phần đặc (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C14:0 acid myristic C16:0 acid palmitic C18:0 acid stearic C18:1 acid oleic C18:2 acid linoleic C18:3 acid linolenic C20:0 acid arachidic C20:1 acid gadoleic C22:1 acid cetoleic C22:6 acid docosahexaenoic 0,22 28,66 6,49 33,60 12,63 1,48 0,34 0,60 0,83 0,59 1,21 22,22 6,70 44,43 16,76 0,91 0,37 0,62 0,43 0,34 1,25 32,96 13,11 35,40 11,93 0,24 0,94 0,33 0,33 0,11 (Trung tâm Dịch vụ Phân tích và Thí nghiệm kiểm định theo phiếu số 9812507, 9906107, 991181) 2.3. DỤNG CỤ - NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Dụng cụ Bình cầu 150ml Becher 100ml, 250ml Erlen 150ml,500ml Ống đong 10ml Pipette 1ml Lọ thủy tinh loại 10ml và 100ml Ống nghiệm Phễu thủy tinh Bình lóng 250ml Giấy lọc Ống vi quản Đèn cồn Bản mỏng Silica gel 20x20cm (Merck) Bình giải ly Đá bọt Thiết bị Máy cô quay chân không Máy đun cách thủy Máy khuấy từ Cân điện tử Máy sắc ký ghép khối phổ Tủ đông Hóa chất: Ether dầu hỏa (Trung Quốc) Benzen (Trung Quốc) Diethy ether Chloroform Ethyl acetate Ethanol Methanol Iso propanol Acetone Dung dịch H2SO4 98,08% NaOH KOH Na2SO4 khan 2.1.2. Nguyên liệu Mỡ cá basa (mỡ lỏng) lấy từ Phân Viện Công NghiệpThực Phẩm thành phố Hồ Chí Minh - 58 Nguyễn Bỉnh Khiêm, Quận 1 - TP.HCM. 2.4. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp transester hóa (transesterification)[31] Cách thực hiện : Bước1: 0,05g chất xúc tác KOH hoặc NaOH cho vào bình cầu 150ml Thêm 30g methanol vào bình cầu. Đun hoàn lưu ở nhiệt độ nhẹ (khoảng 40-50oC) cho đến khi chất xúc tác tan hoàn toàn trong dung môi. Bước 2: Dầu cá basa (5g) được cho vào bình cầu. Đun hoàn lưu ở nhiệt độ 70-80oC. Khuấy từ (400 vòng/phút), trong khoảng thời gian 1-8 giờ. Sau mỗi khoảng thời gian khoảng 1 giờ lấy ra một ít chấm sắc ký bản mỏng để kiểm tra mức độ hoàn thành của phản ứng. Bước 3: Sau khi phản ứng hoàn tất, hỗn hợp được để qua đêm. Hỗn hợp tách làm 2 pha: pha trên là hỗn hợp ester, pha dưới là glycerin. Sử dụng bình lóng tách riêng lấy phần trên. Bước 4: Rửa ester với nước. Glycerin và xúc tác dư tan vào nước chìm xuống phía dưới bình lóng và được loại bỏ. Trong suốt quá trình rửa, ester chuyển thành dạng nhũ tương trắng. Bước 5: Cho thêm dung môi với lượng vừa đủ vào phần nhũ tương để hòa tan. Dung môi có thể là methanol, ether dầu hỏa, ethyl acetate, chloroform. Làm khan nước bằng Na2SO4. Lọc và đuổi dung môi bằng cách cô quay hoặc đun ở nhiệt độ thấp, thu được ester sạch dạng lỏng. Cân trọng lượng sản phẩm thu được. Quy trình phản ứng được trình bày ở sơ đồ 2. Trong phản ứng transester hóa chúng tôi khảo sát một số yếu tố khác nhau như sau. a) Thay đổi dung môi thực hiện phản ứng transester hóa lần lượt là: methanol, ethanol tuyệt đối, propanol. b) Thay đổi tỷ lệ dung môi/dầu cá lần lượt là 20/1; 15/1; 12/1; 10/1; 8/1; 7/1; 6/1; 5/1; 4/1; 3/1. c) Thay đổi hàm lượng xúc tác (%) cho phản ứng transester hóa lần lượt là: 0,5%; 1%; 1,5%; 2%; 2,5%. 28 d) Thay đổi 2 loại xúc tác thực hiện phản ứng transester hóa lần lượt là NaOH và KOH. e) Thay đổi thời gian phản ứng từ 1giờ; 2giờ; 3giờ; 4giờ; 5giờ; 8giờ; 10giờ; 24giờ; 48giờ; 72giờ. Trong mỗi phản ứng sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra tiến trình của phản ứng. 2.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp thực hiện được trình bày ở sơ đồ 3. Tiếp thu những kết quả có sẵn từ anh chị đi trước chúng tôi chỉ khảo sát vài loại dung môi giải ly như chlorofom:methanol là 9:1, 95:5, benzen. Sơ đồ 2: Qui trình transester hóa Chaát xuùc taùc, dung moâi Daàu caù basa (5g) Ñun cho tan Ñun hoaøn löu coù khuaáy töø ôû nhieät ñoä 70-80oC Theo doõi tieán trình phaûn öùng theo thôøi gian baèng saéc kyù lôùp moûng Hoãn hôïp goàm ester acid beùo, glycerol, chaát xuùc taùc Ñeå yeân qua ñeâm ôû nhieät ñoä phoøng Theâm dung moâi cho ñuû Hoãn hôïp chia laøm hai pha. Loùng laáy pha treân laø ester cuûa acid beùo Röûa ester baèng nöôùc baèng bình loùng Hoøa tan nhuõ töông vaøo dung moâi. Laøm khan baèng Na2SO4 Ñuoåi dung moâi Ester saïch (metyl ester, etyl ester) Laáy phaàn ester saïch beân treân (baây giôø ñang ôû daïng nhuõ töông) Caân löôïng ester thu ñöôïc 29 Sơ đồ 3: Phương pháp sắc ký lớp mỏng Chuaån bò maãu (laáy moät gioït trong maãu ñang thöïc hieän phaûn öùng transester hoùa) Chuaån bò taám lôùp moûng, oáng vi quaûn, dung moâi giaûi ly Duøng oáng vi quaûn chaám ít maãu leân taám lôùp moûng Khai trieån giaûi ly ñeå dung moâi di chuyeån leân Saáy khoâ taám lôùp moûng Thaám öôùt baûn baèng dung dòch H2SO4 50% SaÁy khoâ baûn ñeå hieän caùc veát treân baûn moûng 2.2.3. Phương pháp kết tinh của ester với urê (urea crystallization)[40] Bước 1: Cân 2g ester đã transester hóa thu được ở sơ đồ 2 cho vào erlen A. - Cho 100ml ether dầu hỏa cho chung vào erlen A. - Lắc trộn để ester tan vào trong ether dầu hỏa tạo thành dung dịch đồng nhất. Bước 2: Cân 15g urê cho vào erlen 500ml. - Cho 100ml ether dầu hỏa vào erlen 500ml đã chứa urê. - Đun cho urê tan trong ether dầu hỏa tạo thành một hỗn hợp đồng nhất (ở nhiệt độ khoảng 60-70oC, đun hoàn lưu có khuấy từ). Bước 3: Đổ erlen A vào chung trong erlen 500ml chứa dung dịch urê - ether dầu hỏa. - Tráng lại erlen vài lần cho sạch. - Đun tiếp cho đến khi tạo thành hỗn hợp đồng nhất. - Lấy ra để nguội tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Bước 4: Bỏ vào tủ mát một thời gian (khoảng 1 tiếng) rồi mang erlen cho vào tủ đông -5oC. Để qua đêm để urê tạo thành kết tinh với các ester bão hòa. Bước 5: Lấy erlen ra, lúc này dung dịch chia làm hai pha: pha rắn và pha lỏng. - Lọc bằng giấy lọc, lấy pha lỏng. - Pha rắn rửa lại thật kỹ bằng dung môi là ether dầu hỏa rồi lại lọc tiếp. 30 - Cho chung hai phần phần lọc và phần được rửa vào một erlen sạch khác. - Đem cô quay đuổi dung môi được phần dầu cá chứa ester béo bất bão hòa. Phương pháp được trình bày ở sơ đồ 4. Sơ đồ 4: Phương pháp kết tinh của ester với urê. Ñun noùng cho tan heát ureâ 15g ureâ ether daàu hoûa 100ml Ñun noùng Dung dòch ñoàng nhaát - Ñeå nguoäi, cho vaøo tuû laïnh - Cho vaøo tuû ñoâng (qua ñeâm) - Dung dòch taùch laøm hai pha Pha raén Pha loûng Röûa Loïc Troän chung Coâ quay ñuoåi dung moâi Ester baát baõo hoøa 2g daàu 100ml ether daàu hoûa Laéc Dung dòch ñoàng nhaát - Caân löôïng ester thu ñöôïc - Khaûo saùt baèng GC/MS Dung dòch daàu transester hoùa vaø ureâ trong eter daàu hoûa 3.1. Kết quả phản ứng transester hóa 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ methanol/dầu cá theo thể tích Tỷ lệ methanol/mol dầu cá là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng transester hóa. Chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng bằng cách thay đổi tỷ lệ methanol/dầu cá theo thể tích lần lượt là 20/1; 15/1; 12/1; 10/1 ; 8/1; 7/1; 6/1; 5/1; 4/1; 3/1 và giữ cố định các yếu tố còn lại: khối lượng dầu cá (5g), khối lượng xúc tác (0,5g), nhiệt độ phản ứng (70-80oC), tốc độ khuấy (400vòng/phút). Kết quả trình bày ở bảng 9, hình 4. 31 Bảng 9: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ methanol/dầu cá theo thể tích Số thứ tự Tỷ lệ methanol/dầu cá (V:V) Khối lượng dầu ban đầu (g) Khối lượng dầu sau phản ứng (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 20:1 5,50 5,35 97,3 2 15:1 5,47 5,31 97,1 3 12:1 5,06 4,91 97,0 4 10:1 5,01 4,83 96,5 5 8:1 4,99 4,80 96,0 6 7:1 5,78 5,50 95,2 7 6:1 5,23 4,86 93,0 8 5:1 5,54 4,71 85,0 9 4:1 - - - (xúc tác: NaOH 1%, nhiệt độ: 70-75oC, thời gian phản ứng: 7 giờ, tốc độ khuấy: khoảng 400 vòng/phút). Hình 4: Ảnh hưởng của tỷ lệ methanol/dầu cá (thể tích : thể tích) Ả n h h ư ở n g c ủ a t ỷ lệ m e t h a n o l / d ầ u c á l ê n p h ả n ứ n g t r a n s e s t e r h ó a 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 9 8 5 : 1 6 : 1 7 : 1 8 : 1 1 0 : 1 1 2 : 1 1 5 : 1 2 0 : 1 T ỷ lệ m e t h a n o l /d ầ u c á H iệ u su ất (% ) Nhận xét: Bảng 9 cho thấy với tỷ lệ methanol/dầu cá là 4:1 phản ứng xảy ra rất kém, nên chúng tôi không xác định hiệu suất. Khi tỷ lệ được tăng lên 5:1 hiệu suất phản ứng có tăng. Tỷ lệ 7:1 hiệu suất chuyển hóa tốt là 95,2%. Tiếp tục tăng tỷ lệ lên 8:1; 10:1; 12:1; 15:1; 20:1 hiệu suất có tăng nhưng không đáng kể. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ methanol/dầu cá là 7:1 cho các quá trình khảo sát tiếp theo. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi thực hiện phản ứng transester hóa. Trong phản ứng transester hóa loại dung môi có ý nghĩa quan trọng xác định hiệu suất phản ứng. Chúng tôi đã sử dụng ba loại dung môi khác nhau là methanol, ethanol tuyệt đối, propanol và giữ nguyên các yếu tố khác như (nhiệt độ, xúc tác, thời gian phản ứng , tốc độ khuấy…). Kết quả trình bày ở bảng 10. 32 Bảng 10: Kết quả ảnh hưởng loại dung môi lên phản ứng Số thứ tự Loại dung môi Khối lượng dầu ban đầu (g) Khối lượng dầu sau phản ứng (g) Hiệu suất (%) 1 Ethanol 5,22 5,12 4,28 3,95 82,0 77,1 79,6 2 Methanol 5,21 5,56 4,57 4,75 5,00 4,26 91,2 89,9 93,2 91,4 3 Propanol 5,00 4,87 4,25 4,18 85,0 85,8 85,4 (xúc tác: NaOH 1%, nhiệt độ: 70-75oC, thời gian phản ứng: 7 giờ, tốc độ khuấy: khoảng 400 vòng/phút). Nhận xét: Bảng 10 cho thấy methanol là loại dung môi tốt nhất cho phản ứng vì cho hiệu suất cao. Nguyên nhân: - Methanol hòa tan tốt dầu cá. - Ethanol cho hiệu suất không cao có thể là do tuy sử dụng ethanol tuyệt đối nhưng chai này được mua ở những cửa hàng, có thể trong quá trình bảo quản đã khá lâu nên đã hút ẩm khiến ethanol đã lẫn một ít nước, làm giảm hiệu suất phản ứng. - Propanol cho hiệu suất cũng không cao bằng có thể do không hòa tan tốt dầu cá. 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác Trong thí nghiệm chúng tôi thử sử dụng hai loại xúc tác đó là NaOH và KOH thì nhận thấy rằng không có sự khác biệt giữa hai loại. Vì vậy có thể sử dụng bất kỳ loại nào cho những phản ứng tiếp theo. 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác Trong phản ứng transester hóa, lượng xúc tác cho vào cũng ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng. Để khảo sát lượng xúc tác chúng tôi thay đổi lần lượt là 0,5%; 0,8%; 1%; 1,2%; 1,5%; 2% và 2,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 11 và hình 5. Bảng 11: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác lên phản ứng transester hóa. Số thứ tự Lượng xúc tác (g) Hàm lượng (%) Khối lượng dầu ban đầu (g) Khối lượng dầu sau phản ứng (g) Hiệu suất (%) 1 0,0125 0,5 2,50 1,75 70,0 2 0,0160 0,8 2,00 1,84 92,0 3 0,0250 1,0 2,50 2,31 92,2 4 0,0300 1,2 2,44 2,25 92,4 5 0,0300 1,5 2,00 1,85 92,5 6 0,0512 2,0 2,56 2,38 93,0 7 0,0612 2,5 2,45 - - (xúc tác: NaOH , dung môi methanol 30g, nhiệt độ: 70-75oC, thời gian: 7giờ, tốc độ khuấy: khoảng 400vòng/phút) Hình 5: Ảnh hưởng của hàm lượng xúc tác lên phản ứng transester hóa 33 Ả n h h ư ở n g c ủ a h à m lư ợ n g x ú c t á c lê n p h ả n ứ n g t r a n s e s t e r h ó a 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 0 . 5 1 1 . 5 2 2 . 5 H à m l ư ợ n g x ú c t á c ( % ) Hi ệu s uấ t ( % ) y Nhận xét: Phản ứng xảy ra tốt nhất khi lượng xúc tác vào khoảng 0,8 – 1,2%. Nếu tăng hàm lượng xúc tác quá cao không xác định được hiệu suất phản ứng vì sau phản ứng hỗn hợp trở nên đặc khó cô lập sản phẩm, có thể là do phản ứng đã tạo ra quá nhiều xà phòng. Nếu cho quá ít xúc tác thì hiệu suất quá thấp. 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng Để khảo sát thời gian tối ưu của phản ứng transester hóa chúng tôi thực hiên phản ứng trên 2g dầu cá, thay đổi thời gian phản ứng từ 1 giờ đến 3 ngày. Sử dụng sắc ký lớp mỏng để khảo sát mức độ hoàn thành của phản ứng theo thời gian. Kết quả được trình bày trong bảng 12 và hình 6. Bảng 12: Kết quả ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên phản ứng transester hóa Số thứ tự Thời gian phản ứng (giờ) Khối lượng đầu (g) Khối lượng cuối (g) Hiệu suất phản ứng (%) 1 1 - - - 2 2 2,5 2,13 85,2 3 3 2,23 2,01 90,1 4 4 2,01 1,85 91,3 5 5 1,99 1,83 92,0 6 8 2,32 2,14 92,5 7 10 2,15 2,00 93,0 8 24 2,5 2,37 94,8 9 48 2,56 2,43 94,9 10 72 2,81 2,7 95,0 (xúc tác: NaOH 1%, dung môi methanol 30g, nhiệt độ: 70-75oC, tốc độ khuấy: khoảng 400vòng/phút) Hình 6: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên phản ứng transester hóa 34 Ả n h h ư ở n g c ủ a t h ờ i g ia n p h ả n ứ n g lê n p h ả n ứ n g t r a n s e s t e r h ó a 2 1 0 8 5 4 3 7 24 82 4 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 T h ờ i g ia n p h ả n ứ n g ( g iờ ) H iệ u su ất (% ) Nhận xét: Bảng 12 cho thấy sau khi đun 1 giờ. phản ứng chưa xảy ra. Sau 2 giờ, phản ứng đã có xảy ra nhưng chưa hoàn tất. Tiếp theo sau 3 giờ, 4 giờ phản ứng đã có suất hiện sản phẩm. Từ 4 giờ trở đi phản ứng xảy ra mạnh, hiệu suất đạt được lên đến 91,3%. Từ 5 đến 10 giờ hiệu suất không tăng bao nhiêu khoảng 92 – 93%. Khi đun lâu 2 ngày hoặc 3 ngày hiệu suất có tăng chút ít nhưng thời gian phản ứng dài, do đó chúng tôi chọn thời gian tối ưu là 3 giờ - 4 giờ. Do sản phẩm tạo ra sau phản ứng cũng là một dạng ester, mặc dù mạch hydrocarbon đã ngắn hơn rất nhiều nhưng độ phân cực cũng không khác nhau mấy. Rất khó sử dụng sắc ký lớp mỏng để phát hiện sản phẩm tạo ra đến mức độ nào do đó chúng tôi buộc phải khảo sát ở nhiều thời gian khác nhau và sau đó dùng cân để xác định hiệu suất phản ứng. Kết quả sắc ký lớp mỏng: Kết quả được trình bày ở hình 7, 8, 9, 10. Từ các hình 7, 8 nhận thấy rằng vết của sản phẩm (vết thứ nhì) đã có sự khác biệt so với vết của dầu cá ban đầu (vết thứ nhất), điều đó chứng tỏ rằng phản ứng đã xảy ra nhưng để xác định phản ứng xảy ra hoàn toàn hay chưa cần kết hợp với phương pháp cân, xác định hiệu suất. Từ hình 9 cho thấy dung môi giải ly tốt là benzen, vì các vết hiện lên rõ, đẹp. Hình 10 cho thấy dù phản ứng xảy ra sau 3 giờ và 9 giờ thì vết sắc ký cũng không khác nhau bao nhiêu. Điều đó cho thấy không thể chỉ sử dụng sắc ký lớp mỏng để xác định mức độ hoàn thành của phản ứng transester hóa. 3.2. Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo bằng phương pháp tủa urê Để khảo sát khả năng kết tinh của ester với urê chúng tôi thử nghiệm trên hai điều kiện nhiệt độ khác nhau lần lượt là -5oC và -10oC, 15g urê, 200ml ether dầu hỏa, 2g dầu transester hóa. Sau khi để qua đêm, làm khan bằng Na2SO4, lọc thu được sản phẩm. Cân và khảo sát thành phần hóa học bằng sắc ký ghép khối phổ (GC/MS). Kết quả được trình bày ở bảng 13 và phục lục 1, 2. Bảng 13: Kết quả làm giàu metyl ester của acid béo bằng phương pháp tủa urê Số lượt phản ứng Nhiệt độ phản ứng (oC) Lượng dầu trước khi tủa (g) Lượng ester metyl của acid béo thu được (g) Ghi chú 1 -5 2,0 1,5 Khảo sát GC/MS 2 -10 2,0 1,2 Khảo sát GC/MS Kết quả lần khảo sát GC/MS của hai mẫu thử nghiệm được trình bày ở bảng 14. So sánh với phương pháp tủa của acid béovới urê của bạn Lê Hoàng Anh được trình bày ở sơ đồ 5, bảng 15. Bảng 14: Thành phần acid béo trong hỗn hợp ester sau khi tủa ở nhiệt độ -5oC, -10oC 35 Phần trăm trong hỗn hợp (%) Số thứ tự Tên acid của methyl ester Tủa ở -5oC Tủa ở -10oC 1 Tetradecanoic 5,14 4,51 2 Pentadecanoic 0,18 3 9-Hexadecenoic 1,65 1,21 4 Hexadecanoic 28,63 29,26 5 Heptadecanoic 0,23 6 6,9,13-Octadecatrienoic 0,17 7 9,12-Octadecadienoic 13,50 13,22 8 9-Otadecenoic 35,45 37,80 9 Octadecanoic 10,45 9,35 10 5,8,11,14-Eicosatetraenoic 0,27 11 5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic 0,34 0,50 12 7,10,13-Eicosatrienoic 0,54 0,46 13 10,13-Eicosadienoic 8,11-Eicosadienoic 0,40 0,50 14 10,13-Eicosadienoic 11,13- Eicosadienoic 0,56 15 11-Eicosenoic Cyclopropaneoctanoic 1,65 1,34 16 Eicosanoic 0,40 17 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic (DHA) 0,47 1,81 36 Sơ đồ 5: So sánh các bước cơ bản của hai tiến trình thí nghiệm Daàu caù basa (haøm löôïng DHA 0,34%) - Thuûy giaiû vôùi KOH/ethanol - Acid hoùa Tuûa ureâ Hoãn hôïp acid beùo baõo hoøa vaø baát baõo hoøa Acid beùo baát baõo hoøa Metyl ester hoùa Metyl ester cuûa acid beùo Phaân tích baèng GC/MS Sô ñoà tieán haønh maãu thí nghieäm cuûa Leâ Hoaøng Anh Daàu caù basa (haøm löôïng DHA 0,34%) Metyl transester hoùa Hoãn hôïp metyl ester acid beùo baõo hoøa vaø baát baõo hoøa Tuûa ureâ Metyl ester acid beùo baát baõo hoøa Phaân tích baèng GC/MS Sô ñoà tieán haønh thí nghieäm Bảng 15: So sánh hàm lượng các acid béo chủ yếu trong mẫu thí nghiệm với mẫu của Lê Hoàng Anh Hàm lượng (%) Tên acid béo Mẫu thí nghiệm Mẫu của Lê Hoàng Anh Tổng acid béo bão hòa Myristic Palmitic Stearic 43,12 4,51 29,26 9,35 1,01 -- 1,01 -- Tổng acid béo bất bão hòa Palmitoleic Oleic Linoleic Linolenic Arachidonic Eicosapentaenoic Docosahexaenoic (DHA) 56,88 1,21 36,10 13,22 -- -- 0,49 1,81 98,99 7,2 -- 40,62 -- 4,62 -- 5,87 Nhận xét: a) Hàm lượng acid béo DHA thu được ở lần tủa thứ nhất là 0,47% và lần tủa thứ nhì là 1,81%. Cả hai lần tủa đều cho DHA hàm lượng thấp. 37 b) Kết quả GC/MS cho thấy sản phẩm thu được sau khi tủa urê vẫn còn chứa khoảng 43% ester béo bão hòa. Bảng 15 cho thấy hàm lượng acid béo bão hòa vẫn còn quá nhiều (43,2%), trong khi đó việc tủa acid béo với urê của bạn Lê Hoàng Anh lại cho tổng acid béo bão hòa là 0,1%. điều này có thể việc tủa urê với ester béo không hiệu quả bằng tủa urê với acid béo và cần được khảo sát lại kỹ hơn. 4.1. KẾT LUẬN Từ dầu cá basa dạng lỏng chúng tôi đã chuyển thành dạng ester của các acid béo bằng phương pháp thực hiện phản ứng transester hóa. Phản ứng transester hóa được khảo sát với nhiều loại dung môi, xúc tác, nhiệt độ, thời gian phản ứng, cuối cùng tìm được điều kiện tối ưu cho phản ứng đó là sử dụng dung môi methanol, xúc tác KOH 1%, thời gian phản ứng 3 giờ, nhiệt độ 70-80oC. Từ sản phẩm là metyl ester của acid béo có chứa nhiều loại ester của acid béo bão hòa và bất bão hòa, nhằm muốn thu được DHA chúng tôi sử dụng phương pháp tủa urê ở điều kiện nhiệt độ lạnh (-5oC). Ở điều kiện này các ester béo bão hòa sẽ tạo phức với urê, lắng xuống đáy bình chứa, phức này được lọc, loại ra khỏi dung dịch, còn lại là ester béo bất bão hòa. Như vậy hàm lượng ester béo bão hòa sẽ tăng lên cũng đồng nghĩa với việc làm giàu DHA trong hỗn hợp. Từ dầu metyl ester của acid béo thu được sau khi transester hóa, thực hiện 2 thí nghiệm tủa urê. - Sản phẩm của thí nghiệm tủa số 1 cho hàm lượng DHA là 0,47%, số liệu này cho thấy hàm lượng DHA tăng rất ít so với tài liệu (0,34%). - Sản phẩm của thí nghiệm tủa số 2 cho hàm lượng DHA là 1,81% có tăng lên nhưng vẫn thấp so với các phương pháp xử lý khác của các tác giả khác. Một trong những nguyên nhân của kết quả thu DHA hàm lượng thấp có thể là: - Khi phản ứng transester hóa kết thúc, sản phẩm ester không có điều kiện bảo quản tốt trong khi chờ kết tinh với urê, dầu mỡ thì rất khó bảo quản, do đó có thể một số chất trong đó có DHA đã bị biến đổi thành chất khác. - Phản ứng transester hóa là một phản ứng thuận nghịch, nên khi phản ứng transester hóa kết thúc sản phẩm bao gồm các ester béo và triglycerid ban đầu chưa phản ứng hết. Khi sử dụng nước để rửa loại glycerol và chất xúc tác, sản phẩm thu được vẫn là các ester béo và triglycerid ban đầu – Cả hai loại hợp chất này đều là ester mang dây dài nên tính phân cực không khác nhau nhiều, không thể tách riêng chúng ra được. Trong phản ứng tủa urê thì urê tạo tủa tốt với acid béo hơn là với ester béo nên bài thực nghiệm là tạo tủa urê với ester béo, sản phẩm cho thấy vẫn còn chứa rất nhiều (43,12%) các ester bão hòa. Vậy cần khảo sát lại để xác định nên hay không nên áp dụng tạo tủa urê với ester béo. Mặt khác do điều kiện thí nghiệm không cho phép và không đủ thời gian để thử ở những điều kiện nhiệt độ cũng như hàm lượng urê khác nhau, do đó mà hàm lượng thu được không đạt yêu cầu. Trong quá trình thực hiện phản ứng transester hóa, để theo dõi phản ứng chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng nhưng kết quả giải ly không rõ ràng lắm nên phải kết hợp với phương pháp cân để tính hiệu suất phản ứng. Nguyên nhân là do sản phẩm sau phản ứng cũng là một dạng ester (mỡ cá ban đầu là một triglycerid-bản chất cũng là một ester, có trọng lượng phân tử lớn hơn) do dó khi sử dụng sắc ký lớp mỏng xuất hiện những vệt không khác nhau bao nhiêu. Vì vậy cần có nhiều nghiên cứu thêm cách kiểm tra mức độ hoàn thành của phản ứng transester hóa. 4.2. ĐỀ NGHỊ * Trong phản ứng transester hóa: 38 - Nên sử dụng các loại xúc tác khác nếu có điều kiện như zeolit để phản ứng diễn ra nhanh hơn và quá trình rửa ester cũng đỡ vất vả. - Dung môi sử dụng vẫn nên dùng là methanol, vì các acid béo chuỗi dài từ 20 carbon trở nên có thể hòa tan tốt trong methanol, phản ứng transester hóa diễn ra với hiệu suất cao. - Nên tìm kiếm cách khác tốt hơn để theo dõi mức độ hoàn thành của phản ứng transester hóa vì ester và mỡ cá ban đầu có mức độ phân cực gần như nhau, rất khó phát hiện sự khác biệt của các vết trên bản mỏng. * Trong việc kết tinh ester với urê: - Nên sử dụng hàm lượng dầu cá/urê theo tỷ lệ 1:15 và kéo dài thời gian tạo phức là 20 giờ. - Thử quá trình kết tinh trong điều kiện lạnh hơn. Có thể xuống -20oC hoặc thấp hơn nữa. - Urê kết tinh với acid béo có thể dễ dàng hơn nhưng nếu sử dụng ester thì chúng ta có thể tận dụng được nguồn dầu diesel có sẵn, vì hiện nay có rất nhiều công trình khoa học đang sử dụng mỡ cá basa dư thừa làm nhiên liệu sinh học bằng phản ứng transester hóa và ở Việt Nam hiện nay đã có công ty TNHH Minh Tú sản xuất loại dầu này (báo Người lao động, thứ 6, 14-7-1006) với quy mô 3 triệu lit/năm. Như vậy, chúng ta vừa có thể trích ly được thành phần quý vừa có thể sử dụng nguồn năng lượng sạch này. SÁCH THAM KHẢO [1]: Algis J. Vingrys, James A. Armitage, Harrison S. Weisinger, B.V.Bui, Andrew J. Sinclar, Richard S. Weisinger, The role of omega-3 polyunsaturated fatty acids in retinal function, Fatty Acids, 193-217, 2001 (CA 136:117762). [2]:Barbara B. Ellenbogen, S. Aaronson, S. Goldstein, M. Belsky. Polyunsaturated fatty acids of aquatic fungi: possible phylogenetic significance. Comp. Biochem. Physiol. 29,805,1969 (CA 71:10511x). [3]: Gerard Hornstra, Omega-3 Long chain Polyunsaturated Fatty Acids and Health. Benefits, Maastricht University, 3-26, 2002. [4]: Hoàng Đức Như, Dầu thực vật và sức khỏe, Trung tâm Dinh dưỡng Trẻ em TP. HCM, trang 12 – 15, 1997. [5]: L.Sijtsma, M.E.De Swaaf. Biotechnological production and applications of the ω-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid. Applied Microbiology and Biotechnology. 64, 146-153, 2004 (CA 141:52900). [6]: Lê Hoàng Anh, Phương pháp ly trích, thu nhận và làm giàu acid docosahexaenoic trong mỡ cá basa pangasius bocourti sauvage. Khóa luận cử nhân khoa học, khoa Sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, 2006. [7]: Lê Ngọc Thạch, Trần Hữu Anh, Hóa Học Hữu Cơ, NXB Giáo dục, 155-171, 1999. [8]: Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, trang 175-205, 1998. [9]: Lê Trần Duy Quang, Nghiên cứu chế tạo và khảo sát ứng dụng của zeolit NaX trong phản ứng transester hóa mỡ động vật thành biodiesel. Luận văn Kỹ sư Công nghệ hóa học, trường Đại Học Bán Công Tôn Đức Thắng, 2006. [10]: Lương Thị Nguyên Linh, Tìm hiểu quy trình nhận danh, cô lập và trích ly docosahexaenoic acid (DHA) trong mỡ cá tra Pangasius hypophthalmus sauvage. Khóa luận cử nhân khoa học, khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2005. [11]: Martin E. de Swaaf, Theo C. de Rijk, Pieter van der Meer, Gerrit Eggink, Lolke Sijtsma. Analysis of docosahexaenoic acid biosynthesis in Crypthecodinium cohnii by 13C labelling and desaturase inhibitor experiments. Journal of Biotechnology. 103, 21-29, 2003 (CA 139:210565). [12]: Nguyễn Kim Phi Phụng, Các phương pháp nhận danh, trích ly, cô lập các hợp chất hữu cơ. Học phần cao học chuyên ngành Hóa Hữu Cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 7, 2000-2001. 39 [13]: Nguyễn Thiệt Thuật, Bước đầu nghiên cứu phản ứng transester hóa dầu hạt bông vải Việt Nam, khoa Hóa, Khóa luận Tốt nghiệp, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2004. [14]: Nguyễn Vũ Anh Thư, Điều chế biodiesel từ dầu dừa dùng xúc tác PPL. Tiểu Luận Tốt Nghiệp, khoa Hóa, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, 2004. [15]: Paul B. Kelter, James D. Carr, Andrew Scott, Chemistry: A world of Choices, McGraw – Hill, 513, 1999. [16]: R. Hardy, J.N. Keay, The isolation of the polyunsaturated acids of the fish oil as their methyl esters by preparative scale gas chromatography. Journal of Chromatography, 27, 1967 (CA 67:34068b). [17]: Trần Thanh Tòng, Thực tập động vật có xương sống. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 28-35, 2001. [18]: Trần Thị Áng, Hóa sinh học. Nhà xuất bản Giáo dục, 177-126, 2001. [19]: Virginia F.Stout, A simple procedure for obtaining docosahexaenoic acid, Journal of American Oil Chemists’Society, 40, 40, 1963 (CA 58:7051). [20]: Yukihisa Tanaka, Ikuko Sakaki, Takeshi Ohkubo. Extraction of phospholipids from salmon roe with supercritical carbon dioxide and an entrainer, Journal of Oleo Science, 53, 417-424, 2004 (CA 141:394384). TÀI LIỆU INTERNET [21]: [22]: [23]: [24]: [25]: [26]: [27]: [28]: [29]: [30]: [31]: [32]: HNMD/congnghiep/CABASA.htm [33]: [34]: [35]: [36]: [37]: [38]: [39]: [40]: United States Patent, Patent Number: 4,792,418, Date of Patent: Dec. 20, 1988. [41]: S.P.J. Namal Senanayake, Fereidoon Shahidi, Lipase-catalyzed incorporation of docosahexaenoic acid (DHA) into borage oil: optimization using response surface methodology, Food chemistry 77,115-123, 2002. [42]: S.P.J. Namal Senanayake, Fereidoon Shahidi, Incorporation of docosahexaenoic acid (DHA) into evening primrose (Oenothera biennis L.) oil via lipase-catalyzed transesterification, Food chemistry 85, 489-496, 2004. 40 [43]: Shucheng Liu, Chaohua Zhang, Pengzhi Hong, Hongwu Ji, Concentration of docosahexaenoic acid (DHA) anh eicosapentaenoic acid (EPA) of tuna oil by urea complexation: optimization of process parameters, Journal of food engineering 73, 203-209, 2006. [44]: Wenlei Xie, Hong Peng, Ligong Chen, Calcined Mg-Al hydrotalcites as solid base catalysts for methanolysis of soybean oil, Journal of Molecular Catalysis 246, 24-32, 2005 [45]: thông tin từ hội công nghiệp hóa nghề cá Nhật Bản the Japanese Society of Scientific Fisheries), 44 (8) 927 (1978)