Báo cáo Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất một số chế phẩm sinh học dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm

B .K H & C N V C N T P B .K H & C N V C N T P Bộ Khoa học và Công nghệ Viện Công nghiệp Thực phẩm 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất một số chế phẩm sinh học dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm 5748 05/4/2006 Hà Nội, 1/2006 Bản quyền 2006 thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện tr−ởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. Danh sách những ng−ời tham gia thực hiện đề tàI TT Họ và tên Cơ quan công tác 1 Chủ nhiệm đề tài TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm Viện Công nghiệp thực phẩm 2 Chủ nhiệm đề tài nhánh TS. Trịnh Thị Kim Vân Viện CNTP 3 ThS. Lê Thị Mai H−ơng Viện CNTP 4 ThS. Đỗ Thị Thuỷ Lê Viện CNTP 5 ThS. Đỗ Thị Thanh Huyền Viện CNTP 6 KS. Phạm Đức Toàn Viện CNTP 7 Cử nhân Nguyễn Thanh Hà Viện CNTP 8 KS. Chu Thắng Viện CNTP 9 KS. Bùi Thị Hồng Ph−ơng Viện CNTP 10 ThS. Phạm Thị Thu Viện CNTP 11 ThS. Trần Minh Hà Viện CNTP 12 ThS. Đào Thị Nguyên Viện CNTP 13 ThS. Tr−ơng H−ơng Lan Viện CNTP 14 Cử nhân Đỗ Thị Lan H−ơng Viện CNTP 15 Cử nhân Lê Văn Trọng Viện CNTP 16 Chủ nhiệm đề tài nhánh TS. Nguyễn La Anh Viện CNTP 17 KS. Đặng Thu H−ơng Viện CNTP 18 KS. Lê Văn Thắng Viện CNTP 19 ThS. Nguyễn Thị Lộc Viện CNTP 20 ThS. Ngô Mạnh Tiến Viện CNTP 21 Chủ nhiệm đề tài nhánh PGS. TS. Phạm Thu Thuỷ Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, Tr−ờng Đại học Bách khoa Hà Nội 22 TS. Quản Lê Hà Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 23 ThS. V−ơng Nguyệt Minh Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 24 Cử nhân Lã Thị Quỳnh Nh− Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 25 ThS. Lê Lan Chi Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 26 ThS. Phùng Thị Thủy Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 27 KS. Trần Xuân Diệu Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 28 Cử nhân Phạm Thị Quỳnh Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 29 Chủ nhiệm đề tài nhánh TS. Phạm Thuý Hồng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ VN 30 PGS.TS. Tr−ơng Nam Hải Viện CNSH, VKH &CNVN 31 CN. Trần Thị H−ờng Viện CNSH, VKH &CNVN 32 CN. Nguyễn Thanh Thuỷ Viện CNSH, VKH &CNVN 33 ThS. Đỗ Thị Huyền Viện CNSH, VKH &CNVN 34 ThS. Nguyễn Thị Trung Viện CNSH, VKH &CNVN 35 ThS. Trần Ngọc Tân Viện CNSH, VKH &CNVN 36 CN. Đặng Trần Hoàng Viện CNSH, VKH &CNVN 37 CN. Nguyễn Hồng Thanh Viện CNSH, VKH &CNVN 38 KS. Nguyễn Thị Kim Hoa Công ty Cổ phần Bánh kẹo Hải Hà 39 ThS. Trịnh Sỹ Công ty Cổ phần Tràng An 40 KS. Đỗ Huy Toàn Công ty Cổ phần Bánh kẹo Hữu Nghị BàI tóm tắt Vấn đề đảm bảo chất l−ợng và vệ sinh an toàn các sản phẩm thực phẩm hiện nay đang đ−ợc Nhà n−ớc Việt Nam đặc biệt quan tâm. Xu h−ớng sử dụng các thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, an toàn, không độc hại, có lợi cho sức khoẻ cả về giá trị dinh d−ỡng và chức năng phòng chống bệnh tật đ−ợc cả thế giới quan tâm. Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà n−ớc KC - 04 - 27 đã thực hiện những nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng một số sản phẩm từ vi sinh vật nh− chất màu β-caroten, chất nhũ t−ơng và hoạt động bề mặt glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs), dẫn xuất của axít amin S-adenosyl L-methionine (SAM) trong chế biến một số sản phẩm thực phẩm. Trong quá trình thực hiện, đề tài đã sử dụng các ph−ơng pháp nghiên cứu thông dụng trong lĩnh vực công nghệ vi sinh, lên men, chế biến thực phẩm. Các ph−ơng pháp phân tích vi sinh vật, hoá lý, sắc ký đã đ−ợc thực hiện trên các thiết bị thông dụng và hiện đại nh− sắc ký lỏng cao áp, sắc ký cột tinh sạch protein, quang phổ hấp thụ nguyên tử …để đảm bảo các số liệu nghiên cứu là chính xác và đáng tin cậy. Ph−ơng pháp xử lý giống vi sinh vật bằng hoá chất đột biến đã đ−ợc thử nghiệm để nâng cao khả năng tổng hợp β-caroten của chủng nấm sợi Blakeslea trispora. Các thiết bị nuôi cấy vi sinh vật theo ph−ơng pháp chìm, hiếu khí đã đ−ợc sử dụng có hiệu quả ở quy mô phòng thí nghiệm nh− các loại máy lắc, bình lên men 14 lít và quy mô x−ởng thực nghiệm nh− hệ thống thùng lên men 80, 500 và 1500 lít. Đề tài đã khảo sát, lựa chọn, sử dụng các biện pháp công nghệ, các thiết bị và chế độ lên men phù hợp để nâng cao hoạt tính 3 chủng nấm sợi Blakeslea trispora tổng hợp β-caroten đạt từ 2580-4930 mg/L, 2 chủng nấm men Pseudozyma antarctica và P. aphidis sinh chuyển hoá tổng hợp MELs đạt 80-130 g/L và 3 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và S. carlbergensis tổng hợp SAM đạt 10-18,5% so với sinh khối khô. Các kết quả này đã bằng và v−ợt các số liệu nghiên cứu đã đ−ợc công bố trên thế giới trong các điều kiện nghiên cứu và sản xuất t−ơng tự. Các ph−ơng pháp tách chiết, tinh sạch, phân tích đã đ−ợc nghiên cứu lựa chọn để ứng dụng trong phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm để tạo các sản phẩm và bán sản phẩm β-caroten MELs, SAM đạt các chỉ tiêu về thành phần chất l−ợng và vệ sinh an toàn thực phẩm. Lần đầu tiên, đề tài đã nghiên cứu và ứng dụng thành công công nghệ vi nang hoá sử dụng ph−ơng pháp nhũ hoá-sấy phun để tạo đ−ợc bột màu β-caroten tan trong n−ớc từ nguyên liệu β-caroten tan trong dầu sản xuất theo quy trình công nghệ vi sinh. Các sản phẩm nghiên cứu, sản xuất thử của đề tài đã đ−ợc nghiên cứu ứng dụng và sản xuất đại trà 3,5 tấn kẹo, 6,65 tấn bánh quy kẹp kem, xốp kem dùng các sản phẩm sản xuất theo công nghệ vi sinh là β-caroten thay phẩm màu tổng hợp hoá học, MELs thay cho chất nhũ hoá Lecithin, và chứa hoạt chất sinh học SAM có lợi cho sức khoẻ ng−ời tiêu dùng tại Công ty Cổ phần bánh kẹo Hải Hà, Tràng An, Hữu Nghị, H−ơng Sen, Phát Việt và Tùng Lâm. Ngoài các kết quả đạt đ−ợc trong nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm và ứng dụng trong công nghiệp chế biến bánh kẹo, đề tài đã tham gia đào tạo 13 sinh viên tốt nghiệp đại học, 5 thạc sĩ trong đó có 3 là cán bộ khoa học của cơ quan chủ trì đề tài, và góp phần nâng cao trình độ cán bộ khoa học của các cơ quan hợp tác thực hiện đề tài trong các lĩnh vực vi sinh, lên men, phân tích và chế biến thực phẩm. Với các kết quả đã đạt đ−ợc, đề tài mong muốn tiếp tục đ−ợc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ, dây chuyền thiết bị sản xuất và thực hiện các thử nghiệm lâm sàng tác dụng chức năng của các sản phẩm β-caroten, MELs và SAM đối với sức khoẻ con ng−ời. Để có thể đ−a các sản phẩm β-caroten, MELs và SAM ra đ−ợc thị tr−ờng, đề tài mong muốn Bộ Khoa học và Công nghệ ủng hộ để thực hiện Dự án sản xuất trong giai đoạn 2007-2010. Mục lục STT Tiêu đề Trang Mở đầu 1 1. Ch−ơng 1. Tổng quan 4 1.1. Giới thiệu về carotenoit và β-caroten 4 1.1.1. Khái quát về carotenoit và β-caroten. 4 1.1.2. Tính chất, chức năng và ứng dụng của β-caroten. 6 1.1.2.1. Tính chất của β-caroten. 6 1.1.2.2. Chức năng và ứng dụng của β-caroten. 6 1.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của β-caroten. 10 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten trên thế giới. 10 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten ở Việt Nam. 11 1.1.4. Giới thiệu về nấm sợi Blakeslea trispora. 11 1.1.4.1. Giới thiệu chung về nấm sợi Blakeslea trispora. 11 1.1.4.2. Đặc điểm hình thái và sinh sản loài Blakeslea trispora. 15 1.1.4.3. Quá trình tổng hợp β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 21 1.1.5. ảnh h−ởng của môi tr−ờng và điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten của Blakeslea trispora 21 1.1.6. Vi nang và các ph−ơng pháp tạo vi nang. 25 1.1.6.1. Giới thiệu về công nghệ vi nang hoá và vi nang. 25 1.1.6.2. Các ph−ơng pháp tạo vi nang. 27 1.2. giớI thiệu về chất hoạt động bề mặt sinh học glycolipit mannosylerythritol lipit (MELs ). 32 1.2.1. Phân loại chất bề mặt sinh học có nguồn gốc vi sinh. 32 1.2.1.1. Glycolipit. 33 1.2.1.2 Lipopeptit và lipoprotein. 36 1.2.1. 3. Axit béo, photpholipit và lipit trung tính. 36 1.2.1.4. Chất bề mặt sinh học polymer. 36 1.2.1.5. Chất bề mặt sinh học dạng hạt. 37 1.2.2. Quá trình sinh tổng hợp chuyển hoá tạo glycolipit. 37 1.2.2.1. Các cơ chế vi sinh vật sản xuất glycolipit. 37 1.2.2.1.1. Ph−ơng pháp tổng hợp sinh học (Biosynthetic). 37 1.2.2.1.2. Ph−ơng pháp chuyển hoá sinh học (Biotransformation). 38 1.2.2.2. Một số quá trình sản xuất glycolipit. 38 1.2.3. Những ứng dụng của các chất sinh học hoạt động bề mặt. 40 1.2.3.1. Khả năng xử lý dầu tràn trên biển. 41 1.2.3.2. Khả năng cải tạo đất. 41 1.2.3.3. Khả năng cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại. 42 1.2.3.4. Khả năng làm sạch dầu trong các thiết bị l−u trữ. 42 1.2.3.5. Những nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và d−ợc phẩm. 42 1.2.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng MELs trên thế giới và ở Việt Nam. 44 1.3. giới thiệu về dẫn xuất của axít amin S-adenosyl-L-methionine (SAM) 45 1.3.1. Giới thiệu về SAM - Tính chất và công dụng. 45 1.3.1.1. Tính chất của SAM. 47 1.3.1.2. Những ứng dụng chính của SAM. 49 1.3.1.2.1. SAM - chất chống trầm cảm tự nhiên. 49 1.3.1.2.2 SAM là chất siêu dinh d−ỡng của gan. 52 1.3.2. Các ph−ơng pháp tổng hợp SAM. 58 1.3.2.1. Tổng hợp SAM bằng con đ−ờng hóa học. 58 1.3.2.2. Tổng hợp SAM bằng con đ−ờng enzyme. 58 1.3.2.3 Tổng hợp SAM bằng vi sinh vật. 59 1.3.3. Tổng hợp SAM từ nấm men, các yếu tố ảnh h−ởng. 60 1.3.3.1. Đặc điểm chung về nấm men Saccharomyces. 60 1.3.3.2. ứng dụng của nấm men S. cerevisiae. 62 1.3.3.3. Sinh tổng hợp SAM từ nấm men Saccharomyces. 63 1.3.4. Thu hồi và tạo sản phẩm SAM từ nấm men. 66 1.3.5. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM. 68 1.3.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM trên thế giới. 68 1.3.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng SAM ở Việt Nam. 69 2. Ch−ơng 2. Nguyên vật liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 71 2.1. Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy. 71 2.1.1 Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp β-caroten. 71 2.1.2 Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp MELs. 72 2.1.3 Vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy tổng hợp SAM. 73 2.1.4. Tổng hợp các thông tin về các chủng giống vi sinh vật nhập ngoại. 75 2.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu. 76 2.2.1. Các ph−ơng pháp xử lý dịch lên men, tách chiết sinh khối nấm sợi, phân tích và tạo sản phẩm chất màu β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 76 2.2.2 Các ph−ơng pháp thu nhận, tách chiết, phân tích và tạo sản phẩm MELs từ nấm men Pseudozyma. 77 2.2.3. Các ph−ơng pháp thu nhận, tách chiết, phân tích và tạo sản phẩm chứa SAM từ nấm men Saccharomyces. 77 2.2.3.1. Ph−ơng pháp trích ly SAM bằng dung môi. 77 2.2.3.2 Ph−ơng pháp làm sạch SAM. 78 2.2.3.3. Ph−ơng pháp đông khô. 79 2.3. Ph−ơng pháp phân tích. 80 2.3.1. Ph−ơng pháp quang phổ. 80 2.3.2. Ph−ơng pháp sắc ký bản mỏng. 82 2.3.3. Ph−ơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). 83 2.3.4 Ph−ơng pháp xử lý đột biến nấm sợi Blakeslea trispora tổng hợp β-caroten. 84 2.3.5 Ph−ơng pháp phân tích thành phần vệ sinh an toàn thực phẩm các sản phẩm, bán sản phẩm β-caroten, MELs và SAM. 87 2.4. Các ph−ơng pháp tạo sản phẩm. 87 2.4.1. Ph−ơng pháp tạo sản phẩm bột màu β-caroten bằng công nghệ vi nang hoá. 87 2.4.2. Ph−ơng pháp tạo sản phẩm chứa hoạt chất sinh học SAM. 89 2.5. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm. 90 2.5.1. Các thiết bị trích ly, phân tích, tinh sạch. 90 1.5.2. Các thiết bị lên men. 90 2.5.3. Các thiết bị thu hồi, tạo sản phẩm 91 3. Ch−ơng 3. Kết quả và bàn luận 92 3.1. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất màu β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 92 3.1.1. Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp β- caroten của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora. 92 3.1.1.1. Khảo sát khả năng phát triển và sinh tổng hợp β-caroten từ các chủng nấm sợi B. trispora trên môi tr−ờng nhân giống và lên men 92 cơ bản. 3.1.1.2. Nghiên cứu ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng và điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora. 99 3.1.2.1.1. ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng đến sự tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora. 99 3.1.1.2.2. ảnh h−ởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora. 104 3.1.1.3. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp β-caroten của các chủng B. trispora. 107 3.1.1.3.1. Nghiên cứu bổ sung một số chất đặc biệt nh− chất hoạt động bề mặt, tiền chất có cấu trúc vòng β. 107 3.1.1.3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp β-caroten của chủng B. trispora WH2 bằng ph−ơng pháp xử lý đột biến. 108 3.1.1.4. Kết quả nuôi cấy các chủng nấm sợi B. trispora trên môi tr−ờng và điều kiện nuôi cấy chọn lọc quy mô phòng thí nghiệm. 111 3.1.2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm sợi giàu β-caroten. 113 3.1.2.1. Kết quả lên men trên các thiết bị dung tích 14 lít tại Phòng thí nghiệm. 113 3.1.2.2. Kết quả lên men trên thiết bị dung tích 500 và 1500 lít tại X−ởng thực nghiệm. 114 3.1.3. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích và tạo sản phẩm bột màu thực phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm. 115 3.1.3.1. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 115 3.1.3.2. Tinh sạch dịch chiết β-caroten. 117 3.1.3.3. Thu hồi dung dịch đậm đặc và tạo sản phẩm β-caroten tan trong dầu. 119 3.1.3.4. Nghiên cứu các điều kiện công nghệ để tạo sản phẩm bột màu thực phẩm β-caroten từ nấm sợi B. trispora quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng TN. 120 3.1.3.4.1. Tạo vi nang bằng ph−ơng pháp bốc hơi dung môi. 120 3.1.3.4.2. Tạo vi nang bằng ph−ơng pháp tách pha đông tụ. 122 3.1.3.4.3. Tạo bột β-caroten bằng công nghệ vi nang hoá : nhũ hoá - sấy phun. 127 3.1.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm bột màu β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora quy mô x−ởng thực nghiệm trên các hệ thống thiết bị lên men dung tích 500 và 1500 lít. 131 3.1.5. Kiểm tra, phân tích các chỉ tiêu, chất l−ợng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. 134 3.1.6. Nghiên cứu ứng dụng chất màu β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora trong chế biến, sản xuất một số loại bánh, bánh kem, kẹo quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 137 3.1.6.1. Quy trình sản xuất kẹo mềm. 137 3.1.6.2. Quy trình sản xuất bánh quy kẹp kem. 138 3.1.7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và ứng dụng sản phẩm bột màu β-caroten từ vi sinh vật. Đăng ký, giới thiệu, chào bán công nghệ và sản phẩm. 140 3.2. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng chất nhũ t−ơng hoá và hoạt động bề mặt glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs). 143 3.2.1. Khảo sát lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính của các chủng giống nâm men sinh tổng hợp chuyển hóa glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs). 143 3.2.1.1. Chọn lọc chủng giống nấm men sinh chuyển hóa MELs. 143 3.2.1.2. Xác định đặc tính sinh lý sinh hoá của chủng nấm men lựa chọn. 146 3.2.1.3. Nghiên cứu điều kiện nâng cao hoạt tính các chủng giống nấm men sinh tổng hợp glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs). 149 3.2.2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm để sinh chuyển hóa MELs. 151 3.2.2.1. Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men sinh chuyển hóa MELs quy mô máy lắc. 151 3.2.2.2. Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men tổng hợp MELs quy mô 14 lít. 156 3.2.2.3. Xác định điều kiện công nghệ thích hợp lên men tổng hợp MELs quy mô 500 lít. 158 3.2.3. Tìm các điều kiện công nghệ, thiết bị thích hợp quy mô phòng thí 159 nghiệm để tách chiết, tinh sạch, phân tích MELs. 3.2.3.1. Xác định điều kiện tách chiết - Lựa chọn dung môi thích hợp. 159 3.2.3.2. Xác định điều kiện tinh sạch. 159 3.2.3.3. Xác định các ph−ong pháp phân tích MELs. 162 3.2.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất MELs từ vi sinh vật quy mô x−ởng thực nghiệm trên các hệ thổng x−ởng thực nghiệm . 164 3.2.5. Kiểm tra phân tích các chỉ tiêu chất l−ợng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm MELs. 167 3.2.6. Nghiên cứu ứng dụng MELs từ nấm men trong chế biến sản xuất một số bánh, bánh kem quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 169 3.2.7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và ứng dụng các sản phẩm MELs trong chế biến một số mặt hàng thực phẩm. 169 3.3. Kết quả nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng S- adenosyl L – methionil (SAM) từ nấm men Saccharomyces cerevisiae. 171 3.3.1. Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp S- adenosyl L – methionil (SAM) của các chủng nấm men Saccharomyces. 171 3.3.1.1. Khảo sát khả năng tổng hợp SAM của một số chủng nấm men Saccharomyces. 171 3.3.1.2. Nghiên cứu ảnh h−ởng của thành phần môi tr−ờng và điều kiện nuôi cấy nấm men Saccharomyces tổng hợp SAM trong điều kiện phòng thí nghiệm. 173 3.3.1.2.1. Khảo sát ảnh h−ởng thành phần môi tr−ờng. 173 3.3.1.2.2. Khảo sát chế độ thông khí trong nuôi cấy nấm men tổng hợp SAM. 174 3.3.2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm men chứa SAM. 175 3.3.2.1. Nghiên cứu động học quá trình phát triển tổng hợp SAM của nấm men Saccharomyces trên qui mô máy lắc và thiết bị lên men 14 lít. 175 3.3.2.2. Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men 14 lít. 180 3.3.2.3. Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men 80 lít tại X−ởng thực nghiệm. 181 3.3.2.4. Khảo sát các điều kiện công nghệ lên men tổng hợp SAM từ nấm men S. cerevisiae tại X−ởng thực nghiệm trên các thiết bị lên men 500 và 1500 lít. 182 3.3.3. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích và tạo các sản phẩm chứa SAM từ nấm men quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm. 183 3.3.3.1. Khảo sát các điều kiện tách chiết SAM từ nấm men Saccharomyces. 183 3.3.3.2. Khảo sát các điều kiện tinh sạch và phân tích SAM. 187 3.3.3.3. Nghiên cứu thu hồi và tạo sản phẩm SAM từ nấm men Saccharomyces. 193 3.3.4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm chứa SAM từ nấm men S. cerevisiae quy mô x−ởng thực nghiệm trên các hệ thống thiết bị lên men dung tích 500 và 1500 lít. 198 3.3.5. Phân tích, kiểm tra chất l−ợng vệ sinh an toàn thực phẩm của các sản phẩm chứa SAM. 200 3.3.6. Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm chứa SAM từ nấm men S. cerevisiae trong chế biến, sản xuất một số loại bánh kẹp kem quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 201 3.3.7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và ứng dụng các sản phẩm SAM từ vi sinh vật trong chế biến một số mặt hàng thực phẩm. 202 Kết luận và kiến nghị 205 Tổng quát hoá và đánh giá kết quả thu đ−ợc 207 Lời cám ơn 210 Tài liệu tham khảo 211 Phụ lục các chữ viết tắt AND Deoxyribonucleic acid ARN Ribonucleic acid ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosyl triphosphate BHT Butylated hydroxytoluen DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen EMS Ethylmethane sulfonate FDA Cơ quan quản lý thực phẩm và d−ợc phẩm Mỹ FPLC Fast protein liquid chromatography FMOC Fluovenyl methyl chloroformolt GC Gas chromatography HDL High density lipoprotein HPLC High perfomance liquid chromatography IFO Institute for Fermentation Osaka, Japan IL-2 Interleukin - 2 MELs Mannosylerythritol lipids MLV Multilamellar vesicle NBRC National Biological Resource Center, Japan OPA O-phthlaldehyde PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PDA Potato dextrose agar PCA Perchloric acid PITC Phenyl isothiocyanate PP Pyrophosphoric acid PSA Potato sucrose agar SAM S - adenosyl L - methionine SAH S - adenosyl homocysteine SUV Small unilamellar vesicle tARN Transport Ribonucleic acid TBME Ter butyl methyl este TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLC Thin layer chromatography UV-VIS Ultra violet visible 1 mở đầu Chất l−ợng của sản phẩm thực phẩm không những bao hàm giá trị dinh d−ỡng mà còn bao hàm cả giá trị cảm quan trong đó mầu sắc là một chỉ số quan trọng. Mầu sắc của sản phẩm thực phẩm không chỉ có giá trị về mặt hình thức mà còn có tác dụng về mặt sinh lí rõ rệt vì mầu sắc thích hợp sẽ giúp cơ thể đồng hoá thực phẩm đó dễ dàng. Do đó trong chế biến thực phẩm ng−ời ta th−ờng bổ sung chất màu để làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm. Carotenoit là nhóm chất màu lớn nhất trong tự nhiên. Màu đặc tr−ng của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là dải màu từ vàng đến đỏ là do các hợp chất carotenoit tạo thành. Trong các hợp chất carotenoit thì β-caroten đ−ợc quan tâm nhiều nhất do các đặc tính sinh lý quý báu nh− tiền chất của vitamin A, chống oxy hoá, ngăn ngừa bệnh ung th−, giảm nguy cơ các bệnh tim mạch, giảm các bệnh về mắt… Một phân tử β-caroten sau khi thuỷ phân cho hai phân tử vitamin A. Vì vậy, β-caroten đ−ợc đánh giá là hợp chất có hoạt tính sinh học cao và quan trọng nhất trong nhóm carotenoit. Mặt khác vấn đề an toàn thực phẩm đang trở thành mối quan tâm của toàn cầu hiện nay. ở Việt nam tình trạng ngộ độc thức ăn ngày càng tăng. Theo kết quả điều tra vệ sinh dịch tễ của Bộ Y tế Việt Nam cho thấy 90% chất mầu sử dụng cho thực phẩm hiện nay trên thị tr−ờng là không đ−ợc phép. Tình trạng trên cho thấy việc sử dụng chất mầu độc hại đang lan tràn trên thị tr−ờng. Có thể thu nhận chất mầu bằng các con đ−ờng: tổng hợp hoá học, khai thác từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên, từ vi sinh vật. Chất mầu có nguồn gốc tự nhiên ngày càng đ−ợc các công trình khoa học khuyến cáo nên dùng. Những công trình này đã chỉ những −u thế của chất mầu tự nhiên: chịu đ−ợc nhiệt độ, ánh sáng, có khả năng ngăn ngừa quá trình oxy hoá và đặc biệt là không ảnh h−ởng tới sức khoẻ của con ng−ời. Trong thực tế, β-caroten có thể nhận đ−ợc bằng tổng hợp hoá học, tách chiết từ thực vật hay sản xuất từ vi sinh vật. Trên thế giới đã có một số n−ớc nh− Đức, Hàn Quốc, Italia, Nhật, Anh, Nga, Australia, Bồ Đào Nha, Hy Lạp, Trung Quốc …có nghiên cứu sản xuất carotenoit, đặc biệt là β-caroten từ vi sinh vật nh− vi tảo, nấm men đỏ. ở một số n−ớc, nấm men đỏ đã đ−ợc nghiên cứu tạo bột nấm men giàu protein-carotenoit ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô thực nghiệm để bổ sung vào thành phần thức ăn cho gia cầm. Trong các nguồn vi sinh vật có thể sử dụng để sản xuất β-caroten, loài nấm sợi Blakeslea trispora đ−ợc chú ý nhất vì khả năng sinh tổng hợp carotenoit với hàm l−ợng β- caroten cao (85-95% carotenoit) và có thể sản xuất ở qui mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu rẻ tiền. Hiện tại, β-caroten đ−ợc sản xuất từ nấm sợi Blakeslea trispora trên 2 qui mô công nghiệp ở một vài quốc gia nh− Nga, Ukaraina, Hà Lan, Trung Quốc… Năng suất 400-2000 tấn β-caroten tinh khiết/năm. Hiện nay thị tr−ờng thế giới đòi hỏi một nhu cầu lớn về chất hoạt động bề mặt. Glycolipit là nhóm phổ biến nhất trong các chất hoạt động bề mặt sinh học đ−ợc sinh tổng hợp bởi vi sinh vật thuộc tất cả các nhóm vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc. Các vi sinh vật này có khả năng chuyển hoá hydratcarbon, n- alkan (C10- C20), chất béo (C10- C22) thành glycolipit. Có nhiều nghiên cứu đã công bố về Candida bombicola có khả năng sản xuất sophorose lipit, Rhodococcus erythropolis sản xuất trehalose lipit, Pseudomonas sp. sản xuất ra rhamnose lipit, Acinetobacter calcoaceticus sản xuẩt ra emulsan (lipoheteropolysaccharide), Candida antarctica, Ustilago maydis, Kurtzmanomyces sp. có khả năng sản xuất mannosylerythritol lipit (MELs). Các hợp chất trên có đặc điểm giống nhau là có cấu trúc gồm 2 cấu phần: phần −a n−ớc (hydrophylic) và phần kị n−ớc (hydrophorbic). Do đó glycolipit có tính chất là chất nhũ t−ơng và huyền phù hóa, và là chất hoạt động bề mặt. Những −u thế của các chất này so với các chất tổng hợp hoá học là xuất phát từ tự nhiên, chịu phân huỷ sinh học, có tính năng hoạt động tốt ở rải pH và nhiệt độ rộng, đa dạng và không có tính độc. Do vậy chất hoạt động bề mặt sinh học có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau. Trong công nghiệp thực phẩm chất hoạt động bề mặt sinh học đ−ợc sử dụng nh− chất nhũ t−ơng hoá. Quá trình nhũ t−ơng hoá đóng vai trò quan trọng trong việc đồng hoá các thành phần, tạo độ đặc và kết cấu của sản phẩm. Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, chúng có tính làm nhũ tuơng hoá những mô mỡ vỡ trong bột nhào. Glycolipit từ Candida utilis đ−ợc sử dụng trong n−ớc trộn salát. Rất nhiều sản phẩm có hoạt tính sinh học đ−ợc tổng hợp nhờ công nghệ lên men. Một trong số các hoạt chất này là S - adenosyl L- methionil (SAM) - đ−ợc tổng hợp nhiều trong nấm men. SAM tham gia vào trên 40 phản ứng sinh hoá và còn là nguồn d−ợc liệu quý trong lĩnh vực Y - D−ợc. SAM đ−ợc sử dụng để điều trị một số bệnh nh− suy nh−ợc lâm sàng, làm giảm nguy cơ ung th− ruột và gan và có vai trò quan trọng ngăn ngừa bệnh tim, viêm khớp, chứng đột qụy và thiểu năng thần kinh… Tuy vậy cho đến nay SAM mới chỉ đ−ợc −a sử dụng ở một số n−ớc phát triển nh− Mỹ, ý và một số n−ớc Châu âu khác vì giá thành của sản phẩm rất cao. Còn ở Việt Nam vẫn ch−a có nghiên cứu nào cũng nh− ch−a có nơi nào sản xuất SAM. Để tạo ra các sản phẩm bột màu β-caroten tự nhiên, chất hoạt động bề mặt glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs) và dẫn xuất của axít amin S - adenosyl L – methionil 3 (SAM) có nguồn gốc từ vi sinh vật, đề tài KHCN cấp Nhà n−ớc KC-04-27 đã thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: 1. Khảo sát, lựa chọn và nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp β-caroten của các chủng nấm sợi Blakeslea trispora, các chủng nấm men sinh tổng hợp chuyển hoá glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs) và các chủng nấm men sinh tổng hợp S-adenosyl L – methionil (SAM); 2. Tìm các điều kiện công nghệ thích hợp để lên men trên quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm sợi giàu β-caroten, sinh tổng hợp chuyển hoá MELs và sinh khối nấm men chứa SAM; 3. Nghiên cứu các điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích và tạo sản phẩm bột màu thực phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora; chất hoạt động bề mặt sinh học MELs và các sản phẩm chứa SAM từ nấm men quy mô phòng thí nghiệm và x−ởng thực nghiệm; 4. Hoàn thiện công nghệ và sản xuất chế phẩm bột màu β-caroten, MELs và chế phẩm chứa SAM từ vi sinh vật quy mô x−ởng thực nghiệm trên các hệ thống thiết bị lên men dung tích 500 và 1500 lít; 5. Kiểm tra, phân tích các chỉ tiêu, chất l−ợng vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora; MELs và SAM từ nấm men; 6. Nghiên cứu ứng dụng chất màu β-caroten, MELs và SAM từ nấm men trong chế biến, sản xuất một số loại bánh, bánh kem, kẹo quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp. 7. Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu quả kinh tế trong sản xuất và ứng dụng các sản phẩm β-caroten, MELs và SAM từ vi sinh vật trong chế biến một số mặt hàng thực phẩm. Đăng ký, giới thiệu, chào bán các công nghệ và sản phẩm β-caroten, MELs và SAM từ vi sinh vật. 4 Ch−ơng 1 tổng quan 1.1. Giới thiệu về carotenoit và β-caroten. 1.1.1. Khái quát về carotenoit và β-caroten. Carotenoit là nhóm chất màu isoterpen không no, không tan trong n−ớc, tan trong chất béo, có màu từ vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65 - 70 sắc tố tự nhiên, và là một trong những hợp chất màu quan trọng nhất đ−ợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Carotenoit th−ờng đ−ợc phân làm 2 nhóm. Thứ nhất là nhóm các caroten hydrocacbon nh− là β-caroten, torulen và nhóm còn lại là xantophyl bị ôxy hoá nh− là torularhodin và astaxantin (Sutter và Whitaker 1981). Bản chất tự nhiên của carotenoit là các hợp chất tetratecpen (C40H56) chứa 8 gốc isoprene (Lampila và cộng sự, 1985). Cấu trúc cơ bản của các carotenoit là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon đ−ợc cấu thành từ 8 đơn vị 5-cacbon isoprenoit liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm, một số khác chứa các vòng sáu cạnh, còn một số khác nữa chứa thêm oxy nh− các gốc r−ợu, aldehyde, ketone, carboxylic, epoxide. Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen. Chính cấu trúc này đã tạo nên các đặc tính quan trọng nh−: dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng (đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất (màu càng đậm khi hệ thống dây nối càng dài) (Sutter và Whitaker 1981). Từ cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: cộng hợp H2 hoặc dehydro hoá, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt thành nhiều chuỗi nhỏ…Tạo nên một l−ợng lớn các cấu trúc khác nhau. Kết quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã đ−ợc tách chiết và xác định đặc tính. Một số cấu trúc chính của các ca rotenoit nh− lycopen, caroten đ−ợc trình bày ở hình 1.1.1. Lycopen: Lycopen có trong quả cà chua, d−a hấu, nho hồng và ổi. Mầu đỏ của cà chua chín chủ yếu là do có mặt của lycopen mặc dầu trong cà chua còn một loạt trong các carotenoit khác nữa. Trong quá trình chín, hàm l−ợng lycopen trong cà chua tăng lên 10 lần. Tuy nhiên chất mầu này không có hoạt tính vitamin. Lycopen là tiền β-caroten, nó có tác dụng chống lại ung th− tuyến tiền liệt, có tác dụng chống oxy hoá mạnh. Trong cơ thể tuyến tiền liệt, tinh hoàn, ngực là nơi chứa nhiều lycopen. Lycopen có ở dạng cis và trans, Bằng cách tạo vòng ở một đầu hoặc cả hai đầu của phân tử lycopen thì sẽ đ−ợc các đồng phân α, β, γ-caroten. 5 Polyen Lycopen γ− Caroten β− Caroten α− Caroten Hình 1.1.1. Cấu trúc của các carotenoit 6 Caroten: Trong các loại rau quả nh− cà rốt, quả mơ, bí ngô, bắp cải, rau spinach có chứa nhóm caroten. Trong nhóm caroten thì β-caroten có vai trò quan trọng nhất, α-caroten có cấu trúc rất giống β-caroten, chỉ khác nhau ở vị trí nối đôi. Hiện nay các nghiên cứu chỉ tập trung vào β-caroten, chỉ biết một chút về α-caroten. Những test thử đã cho thấy α- caroten có thể có hiệu quả hơn β-caroten trong việc chống lại các tác nhân gây ung th−. Một nghiên cứu về dịch tễ học cho rằng nếu đ−a vào cơ thể một l−ợng α-caroten lớn có khả năng giảm nguy cơ mắc bệnh ung th− phổi. Crypthoxanthin: Crythoxanthin có công thức nguyên là C40H56O (3 hoặc 4- hydroxyl-β-caroten). Màu da cam rất đẹp của quýt, của cam chủ yếu là do crypthoxanthin. Trong số các hợp chất carotenoit, α, γ, β-caroten và crypthoxanthin là những tiền chất vitamin A quan trọng, cung cấp vitamin A cho cơ thể ng−ời và động vật. Một phân tử γ, α-caroten và crypthoxathin vào cơ thể động vật, sau khi thuỷ phân cho một phân tử vitamin A, nh−ng một phân tử β-caroten sau khi thuỷ phân cho hai phân tử vitamin A. Vì vậy β-caroten đ−ợc đánh giá là chất có hoạt tính sinh học mạnh và quan trọng nhất của nhóm các carotenoit (Young và cs, 2003). 1.1.2. Tính chất, chức năng và ứng dụng của β-caroten. 1.1.2.1. Tính chất của β-caroten. - Công thức hoá học của β-caroten C40H56. Khối l−ợng phân tử: 536,88. - β-caroten là một dẫn xuất isoprene ch−a bão hoà. β-caroten có dạng tinh thể hình kim, màu nâu đỏ. - β-caroten bền trong môi tr−ờng kiềm và không bền trong môi tr−ờng axít. - β-caroten tan trong dầu và các dung môi hữu cơ nh− axeton, etyl-ete, metanol v.v…đặc biệt tan tốt trong dầu, ête, hecxan, β-caroten không tan trong n−ớc. - Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-caroten có ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxi hoá, đồng phân hoá khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng hay nhiệt độ. - Quang phổ hấp thụ cực đại của β-caroten là ở 450 nm [Goodwin, 1980]. 1.1.2.2. Chức năng và ứng dụng của β-caroten. Trong tự nhiên, cơ thể sinh vật có thể tự tổng hợp carotenoit nhằm mục đích bảo vệ, chống lại các tác động bên trong (bao gồm các gốc tự do) và bên ngoài (tia tử ngoại ánh sáng mặt trời v.v...). Ng−ời và động vật không x−ơng sống sử dụng 50 trong 600 hợp chất carotenoit để tổng hợp chuyển đổi thành vitamin qua niêm mạc ruột vào gan và nhiều tổ chức cơ thể khác. Trong số các carotenoit này β-caroten có hoạt tính sinh học cao hơn 7 hẳn, gấp 2-3 lần so với các carotenoit khác [Ausich, 1997] và có rất nhiều chức năng và ứng dụng nh−: - β-caroten tham gia vào quá trình tạo sắc tố (tiền Vitamin A). - Các hợp chất carotenoit, caroten tan trong n−ớc hoặc tan trong dầu đ−ợc dùng rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, tạo màu hoặc chuẩn hoá màu của magarin, dầu ăn, bơ, trong các sản phẩm n−ớc giải khát, bắp rang, các loại súp đóng hộp, bánh kẹo, kem, mỳ ăn liền ... - Là chất dinh d−ỡng chống oxi hoá có tác dụng điều hoà sự đáp ứng miễn dịch trong cơ thể bằng cách trao đổi thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức phận của màng tế bào và tăng sự đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể. - Làm tăng hiệu quả sinh sản do có khả năng tăng c−ờng quá trình tổng hợp một số hoocmon giới tính. - Ngoài ra β-caroten còn ngăn cản quá trình tạo khối u, gây đột biến và trao đổi nhiễm sắc thể chị em, làm giảm các nguy cơ của bệnh tim mạch, động mạch vành cũng nh− đột quỵ. - Do là một loại sắc tố nên β-caroten tham gia vào phản ứng quang hoá tăng c−ờng hoạt động của một số enzim ví dụ nh− cytochrom P450. Cơ chế chống oxi hoá : Trong cơ thể, carotenoit nói chung và β-caroten nói riêng có khả năng triệt tiêu các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây chuyền. Nhờ có hệ thống nối liên hợp, nó vô hiệu hoá phân tử oxi bị kích hoạt (1O2). Một phân tử β-caroten có thể hấp thụ năng l−ợng của hàng ngàn phân tử 1O2 rồi giải phóng năng l−ợng ấy d−ới dạng nhiệt vô hại. 1O2 + β-caroten ặ β-caroten * + β-caroten *ặ β-caroten + Q( vô hại) Chức năng sinh học của β-caroten: Nhờ có những đặc tính −u việt nh− vậy, β-caroten đ−ợc ứng dụng trong rất nhiều trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, d−ợc phẩm và trong y tế. Beta-caroten đ−ợc sử dụng phổ biến làm chất màu trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm, là nguồn bổ sung chất dinh d−ỡng quan trọng trong khẩu phần ăn. Để đáp ứng nhu cầu về β-caroten có thể sử dụng 2 ph−ơng pháp sản xuất chính. Đó là sản xuất theo con đ−ờng hoá học và sản xuất theo con đ−ờng sinh học. Sản phẩm β-caroten tổng hợp theo con đ−ờng nhân tạo chỉ có một loại đồng phân duy nhất trong khi đó sản phẩm β-caroten tổng hợp theo con đ−ờng tự nhiên không những có chứa β-caroten mà còn có α-caroten và γ-caroten do đó hệ số tiêu hoá của sản phẩm β-caroten tổng hợp nhân tạo chỉ bằng 10% hệ số của β- caroten tổng hợp theo con đ−ờng tự nhiên. Hơn nữa, hoạt tính sinh học của sản phẩm tự nhiên cao hơn so với hoạt tính sinh học của sản phẩm tổng hợp. 8 Trong lĩnh vực d−ợc phẩm và y học, β-caroten đ−ợc coi là một loại biệt d−ợc rất hữu hiệu trong việc phòng, chữa trị các bệnh nan y và còn đ−ợc coi nh− một liều thuốc làm tăng tuổi thọ cho loài ng−ời. Những nghiên cứu gần đây cho thấy β-caroten nhân tạo có liên quan đến hiện t−ợng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ −ng th− trong khi đó thì β-caroten tự nhiên lại có khả năng chống lại sự sai khác này do đó có khả năng ngăn ngừa đ−ợc bệnh −ng th−. Tính độc của β-caroten cũng đ−ợc quan tâm nhiều, đối với các sản phẩm tự nhiên do có thêm một số các đồng phân khác nên không gây độc tính dù sử dụng với liều l−ợng cao trong khi đó β-caroten tổng hợp hóa học lại chỉ bao gồm toàn bộ cấu hình trans nên gây độc khi sử dụng với liều cao. Vì vậy xu h−ớng hiện nay chủ yếu tập trung vào sản xuất β-caroten theo con đ−ờng sinh tổng hợp tự nhiên. Đối với β-caroten khi ở dạng tiền vitamin A, nó bảo vệ nhiễm sắc tố da để chống lại hiệu ứng có hại của các tia tử ngoại. Ng−ời ta khuyên nên dùng bổ sung β-caroten tr−ớc khi làm việc lâu dài d−ới ánh nắng mặt trời. Nó có thể giúp da phòng chống không những các tia tử ngoại gây hại mà còn phòng chống lại bệnh ung th− da khi dùng trong thời gian dài. Dựa trên các nghiên cứu những gốc tự do ng−ời ta thấy rằng, gốc tự do là một phân tử nguy hiểm, bởi vì nó không bền và hoạt động mạnh. Nó có khả năng kết hợp rất nhanh đối với các phân tử khác đặc biệt là lipid và có thể gây nên một phản ứng dây chuyền cực kỳ nguy hiểm đối với tế bào. Chính các gốc tự do này là nguyên nhân gây nên phản ứng dị ứng, ung th−, các bệnh tim mạch, tai mũi họng, da, niệu bộ, các trạng thái suy nh−ợc, mệt mỏi, giảm trí nhớ, giảm khả năng t− duy, quá trình lão hoá. Cùng với vitamin C, E, đồng, mangan, thì vitamin A và β-caroten có vai trò quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do này (Young và cs 2003). Đối với động vật có vú, β-caroten giữ chức năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể nh−: phát triển thị giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng. Tác động chủ yếu của carotenoit không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi thông tin từ tế bào này đến tế bào khác, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng c−ờng sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Chính vì vậy mà carotenoit đ−ợc xác định là chất điều hoà dinh d−ỡng. Đặc biệt β-caroten không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài. Dùng vitamin A kéo dài và liều cao sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan. Nguyên nhân là do cơ thể chuyển hoá β-caroten chuyển thành vitamin A khi có nhu cầu. Chỉ 1/6 l−ợng β-caroten chuyển thành vitamin A [Goodwin, 1980]. 9 β-caroten có hai đồng phân: trans β-caroten và cis β-caroten, trong đó trans β-caroten có thể chuyển thành dạng cis β-caroten. Trong hai đồng phân trên thì trans β-caroten có vai trò rất quan trọng do cơ thể con ng−ời có thể hấp thụ đ−ợc. Hiện tại các nghiên cứu chỉ ra sử dụng β-caroten tự nhiên (có cả dạng cis và trans) tốt hơn là sử dụng β-caroten tổng hợp bằng con đ−ờng hoá học chỉ chứa dạng trans. Bác sĩ Phillip Gaffney là một nhà khoa học hàng đầu ở bệnh viện Royal Brisbane đã khám phá ra rằng nếu ng−ời bệnh đ−ợc cung cấp β-caroten đã làm tăng mức HDL (HDL là dạng rất tốt của cholesterol) giảm rủi ro cho các bệnh về tim mạch. Một nghiên cứu khác với 22000 bác sĩ nam đ−ợc cung cấp β-caroten đã giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch hơn hẳn nhóm không đ−ợc cung cấp β-caroten [Goodwin, 1980] β-caroten và bệnh ung th−: Ung th− là sự đột biến hoặc thay đổi DNA của tế bào. Sự thay đổi này có thể bị gây ra bởi virus, môi tr−ờng, đề kháng yếu, yếu tố về gen, tất cả các yếu tố trên xuất hiện trên cơ thể chúng ch−a phát triển đến khi có những tác động của điều kiện môi tr−ờng chúng mới phát triển mạnh mẽ. Sự đột biến này xẩy ra ở một tế bào hoặc một nhóm các tế bào. Các tế bào này tự nhân lên đến khi tạo thành một vùng lớn của chuỗi gây bệnh. Sau một thời gian các tế bào ung th− phát triển ở khắp mọi nơi trên cơ thể theo hệ thống bạch cầu hoặc đ−ờng máu. Ung th− phổi khó phát hiện hơn ung th− da do chúng phát triển ở bên trong cơ thể rất khó phát hiện hoặc cảm thấy đ−ợc trên cơ thể ng−ời bệnh. Có hàng trăm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, trong đó tế bào đ−ợc cho tiếp xúc với những chất gây ung th−, virus và các tia phóng xạ. Vitamin A và β-caroten cho thấy chúng có khả năng ngăn cản các tế bào chuyển thành các tế bào gây ung th− [Goodwin, 1980]. β-caroten cũng có những tác dụng chống ung th− riêng cho nó, không phụ thuộc vào vitamin A. Các nghiên cứu invitro đã cho thấy rằng β-caroten và capthaxanthin (một carotenoit không phải tiền chất của vitamin A) có tác dụng ức chế sự chuyển sang dạng CH2OH Carotenase 2 Vitamin A 10 tân sản của các tế bào invitro d−ới tác dụng của các tác nhân vật lý và hoá học. Điều này có nghĩa là tác dụng chống oxy hoá là một tính chất quan trọng của các carotenoit. Trong các nghiên cứu trên động vật, vitamin A cũng cho thấy sự ngăn cản sự thành lập khối u trên động vật thử nghiệm khi tiếp xúc với các chất gây ung th− và làm chậm lại sự phát triển của khối u đã bị biến đổi. Ngoài bệnh ung th− phổi, rất nhiều nghiên cứu trên những tập thể ng−ời sống ở khắp nơi trên thế giới từ Mỹ, Anh, Nhật, Phần Lan…đã cho thấy mối liên hệ giữa nguồn thực phẩm giàu vitamin A và β-caroten với tỉ lệ thấp mắc các bệnh ung th− khác nh−: ung th− khí quản, màng trong dạ con, bàng quang, cổ tử cung, vú, tuyến tiền liệt, trực tràng, manh tràng và dạ dày, kể cả melanoma (một loại ung th− da nguy hiểm). Các kết quả thay đổi từ giảm 8 lần trong ung th− phổi đến giảm 80% trong ung th− cổ tử cung. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten. 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten trên thế giới : β-caroten sản xuất theo con đ−ờng hoá học hiện nay chiếm khoảng 70%- 80% sản l−ợng trên thế giới, tập trung chủ yếu ở: Thuỵ sỹ, Mỹ (Công ty Hofmanroche) và ở Đức (Công ty Basf). Sản l−ợng của các nhà máy này đ−ợc xây dựng vào những năm đầu của thập kỷ 90 đạt khoảng 400- 500 tấn/năm β-caroten tinh khiết 98%. Các nghiên cứu trích ly β-caroten từ nguyên liệu thực vật đã đ−ợc nghiên cứu và sản xuất với quy mô nhỏ tại Mỹ, Nhật, Phần Lan, Anh từ các loại cà rốt chuyển gene chứa khoảng 5,2-12,2 mg/100gam cà rốt t−ơi, dầu cọ chứa hàm l−ợng carotenoit khoảng 5mg/100gam dầu cọ thô với khoảng 1/2 là β-caroten và α-caroten. Trên thế giới ở một số n−ớc: Đức, Hàn Quốc, ý, Nhật, Anh, Nga, úc, Bồ Đào Nha, Hy Lạp, Trung Quốc…đã có những nghiên cứu sản xuất carotenoit đặc biệt là β-caroten từ vi sinh vật. Một số vi tảo nh− tảo lam Dunaliella salina, Heamatococcuss pluvialis, Mantoniella squamata đã đ−ợc nghiên cứu nuôi cấy, tách chiết các hợp chất carotenoit có chứa β-caroten và các dẫn xuất nh−: asthaxanthin, zeaxanthin, violaxanthin (Công ty Nutralite Ltd, Microalgae International Company, Cyanotech INC- Mỹ; Betatene Ltd, Western Biotechnology- úc). Các chủng nấm men tự nhiên hoặc là gây đột biến có sắc tố đỏ nh−: Rhodotorula glutinis, R. Mucilaginosa, R. rubra cũng đ−ợc nghiên cứu nhiều ở các n−ớc nh−: ấn Độ, Canada, Pháp, Nga song còn gặp nhiều hạn chế (Lampila và cs 1985). β-caroten đã đ−ợc tổng hợp sinh học từ nấm sợi Blakeslea trispora trên qui mô pilot và quy mô công nghiệp ở Nga, Ukaraina, Hà Lan, Trung Quốc… Năng suất 400-2000 tấn β-caroten tinh khiết/năm. Hiệu suất tổng hợp β-caroten đạt 900-1200 mg/lít trong phòng thí nghiệm và 1350-3500 mg/lít ở quy mô công nghiệp. Sản phẩm bột màu từ vi sinh vật 11 đã đ−ợc th−ơng mại hoá ở Châu âu, Trung Quốc và đã đ−ợc công nhận là chất màu thực phẩm, chất vi dinh d−ỡng và đ−ợc sử dụng với liều l−ợng không hạn chế (trên 5% trong thực đơn bữa ăn) (Tài liệu của HĐ thực phẩm Châu âu, 2000). 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng β-caroten ở Việt Nam. ở Việt Nam, các nghiên cứu thu nhận β- caroten nh− tiền vitamin A từ các nguồn thực vật nh− gấc, vi sinh vật nh− tảo, nấm men đã đ−ợc bắt đầu từ những năm 70-80 của thế kỷ tr−ớc và vẫn đ−ợc tiếp tục trong những năm gần đây (Lâm Xuân Thanh, 2003). Công ty TNHH chế biến dầu thực vật và thực phẩm Việt Nam (VNPOFOOD). Đại diện tại Tp.HCM là Công ty D−ợc phẩm Quận 10 đã sản xuất dầu gấc viên nang VINAGA chiết xuất từ gấc có chứa β-caroten 1,5 mg/g và lycopen 0,12 mg/g. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Trung tâm Dinh d−ỡng Trẻ em Tp.HCM đã nghiên cứu nuôi cấy tảo Spirulina có hàm l−ợng β-caroten 1,7 mg/g sinh khối khô và Viện Công nghệ Sinh học nuôi cấy tảo Dunaliella salina 5,4mg/g β-caroten trên quy mô phòng thí nghiệm (Nguyễn Ngọc Doãn và Lê Văn Tri, 1998). Viện Công nghiệp thực phẩm trong những năm gần đây đã tiến hành một số các đề tài cấp Bộ Công nghiệp nghiên cứu tổng hợp màu đỏ từ nấm mốc đỏ Monascus sp. theo ph−ơng pháp bề mặt trong bình tam giác qui mô phòng thí nghiệm; nghiên cứu tổng hợp và tạo chế phẩm bột giàu protein - carotenoit từ nấm men đỏ Rhodotorula sp theo ph−ơng pháp lên men chìm ở máy lắc hoặc các bình thuỷ tinh dung tích 10 lít có sục khí. Tuy nhiên, hàm l−ợng chất màu, β-caroten tách chiết từ sinh khối vi sinh vật còn rất thấp và ch−a có các nghiên cứu tạo đ−ợc chất màu th−ơng phẩm (Phạm Việt Cẩm và Nguyễn Ngọc Tú, 2000; Phan Tố Nga và Phan Thị Sửu, 2001). Gần đây Viện Lúa ĐBSCL đã thông báo chọn lựa đ−ợc nhiều dòng lúa mà trong phôi nhũ có hàm l−ợng caroten cao. Những dòng lúa này đang đ−ợc khảo nghiệm trên diện rộng, hy vọng những năm tới sẽ có những giống lúa vừa cho năng suất cao vừa giàu vitamin A (Le T Vuong, 2000). 1.1.4. Giới thiệu về nấm sợi Blakeslea trispora. 1.1.4.1. Giói thiệu chung chung về nấm sợi Blakeslae trispora. Nấm sợi Blakeslea trispora thuộc Lớp Nấm tiếp hợp, Ngành Nấm tiếp hợp, Bộ Mucorales theo sơ đồ phân loại trình bày ở hình 1.1.2. (Mantzouridou và cs, 2002). Lớp nấm tiếp hợp Zygomycetes. Năm 1973 theo hệ thống của Takhtadjan giới nấm mới đ−ợc công nhận (Hesseltine và Ellis). 12 Ngành nấm tiếp hợp có hai lớp nấm là Zygomycetes và Trichomycetes. Lớp nấm Zygomycetes chỉ chiếm 1% trong giới nấm và sự dụng nguồn cácbon chủ yếu là đ−ờng và tinh bột. Theo từ điển của nấm mốc, Zygomycetes bao gồm 10 bộ, 32 họ, 124 chi, 870 loài (Thaxter 1914). Trong đó 2 bộ Basidiobolales và Mortierellales đã đ−ợc miêu tả bởi Cavalier-Smith, tám bộ còn lại đã đ−ợc thảo luận và minh họa trong các bài báo của Benjamin (1966, 1979), Benny và Donnell (1978). Đặc điểm của lớp nấm này là hữu tính, hệ sợi không có vách ngăn, phổ biến ở bộ Mucorales và Zoopagales, nh−ng hệ sợi có vách ngăn lại phổ biến ở bộ Dimargaritales và Kickxellales (Benny 2001). Sinh sản vô tính th−ờng ở các loài không chuyển động, bào tử đơn bào trong các nang bào tử là đa hoặc đơn bào. Họ Choanephoraceae. Theo Hesseltine và Ellis (1893) họ Choanephoraceac chỉ có một chi là Choanephora. Sau đó một số tác giả đã tìm ra một vài chi trong các họ sau không có mối liên hệ với nhau Cunninghamella (Cunninghamellaceae), Radiomyces (Radiomycetaceae), Cokeromyces (Thamnidiaceae), Mycotypha (Mycotyphaceae) và Gilbertella (Gilbertellaceae), Rhopalomyces (Helicocephabidaceace), Simoideomyces và Thamnocephalis (Sigmoideomycetaceae) (Kirk 1984, Kirk và cs 2001). Sau một quá trình sắp xếp thì hiện nay họ Choanephoraceac gồm hai chi là Blakeslea và Choanephora. Giới : Nấm (fungi) Ngành: Nấm tiếp hợp (Zygomycota) Lớp: Nấm tiếp hợp (Zygomycetes) Bộ: Mucorales Chi: Blakeslea Họ: Choanephoraceae Loài: trispora Hình 1.1.2. Sơ đồ phân loại nấm sợi Blakeslea trispora 13 Chi Blakeslea. Blakeslea có hai loại nang bào tử tách ra từ cuống nang. Nang bào tử lớn chứa từ 1-8 nang bào tử nhỏ hình cầu. Có đ−ờng nối giữa thành tế bào và các bào tử trong các bào tử nhỏ vì vậy các bào tử dễ dàng tách ra khỏi vỏ nang, thậm chí khi chỉ có một bào tử trong đó. Các bào tử hình ô van dài, có sắc tố, có khía, có râu ở hai đầu bào tử, bào tử sinh ra bằng sinh sản hữu tính hoặc vô tính (Thaxter 1914). Các loài của Blakeslea bao gồm: - Blakeslea monospora do Mehrotra và Baijal (1968) phân lập đ−ợc tại ấn Độ và Đài Loan. - Blakeslea sinensis do Zheng và Chen (1986) phân lập ở hoa và đất tại Trung Quốc. - Blakeslea trispora do Thaxter (1914) phân lập đ−ợc đầu tiên từ loài sâu gây bệnh trên cây đậu đũa ở Gainesville, Florida, Mỹ. Sau đó một vài chủng khác cũng đ−ợc phân lập từ đất ở Florida và một vài nơi khác ở vùng Đông Nam n−ớc Mỹ và Châu á nh− ấn Độ, Trung Quốc (Hsiao và Chang 2003, Ho và Chang 2003) Nấm sợi là loại tế bào Eukaryote có cấu tạo t−ơng đối phức tạp, có cấu tạo từ các bộ phận chính nh−: vỏ tế bào, nhân, ty lạp thể, nguyên sinh chất và không bào là những thành phần có thể nhìn thấy d−ới kính hiển vi quang học, còn các phần khác nh−: màng nguyên sinh chất, l−ới nội chất…chỉ nhìn thấy đ−ợc d−ới kính hiển vi điện tử. Tế bào của nấm là một tế bào thực sự (eucyte) bao gồm màng tế bào, chất nguyên sinh, tế bào chất, thể hạt nhỏ, ribôxôm, nhân, không bào, các hạt dự trữ. Nấm mốc sống theo kiểu dị d−ỡng, hấp thụ thức ăn qua vách tế bào của cơ thể nấm. Màng tế bào của nấm mốc không có lớp xenluloza mà là chất kitin. Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ, các chất dinh d−ỡng đi vào trong tế bào và các sản phẩm trao đổi chất đi từ tế bào ra môi tr−ờng xung quanh qua những lỗ nhỏ này. Bên ngoài thành tế bào không có lớp nhầy vì thế mà các tế bào không bị dính lại với nhau Thành tế bào Blakeslea trispora có cấu trúc sợi nhỏ từ chitin, chitosan và 1 tổ chức giống gel bao gồm polyglucuronic axít, glucuronomannoproteins và polyphosphate. L−ợng hydrát cácbon dự trữ trong cơ thể d−ới dạng glycogen. Cơ thể nấm mốc không có cơ quan thần kinh. Nấm mốc phát triển chủ yếu ở phần ngọn của sợi nấm. điều này phụ thuộc vào cấu tạo bên trong của ngọn sợi nấm và thành sợi nấm. Phần ngọn sợi nấm tập trung các hoạt động liên quan tới quá trình tổng hợp prôtít. Đây là yếu tố điều khiển, xử lý các dây chuyền tổng hợp: nhân tế bào, hệ thống các axit nucleic, hệ thống enzim cần thiết. Prôtít ngoài việc duy trì hoạt động sống của cơ thể nấm mốc còn dùng để xây dựng phần nấm sợi mới. Thành của sợi nấm ở phần đỉnh mỏng hơn các phần khác. Nh−ng phần đỉnh vẫn đ−ợc coi là phần bảo vệ, nó phải tiếp xúc với vật cản đầu tiên, khi cần là mũi nhọn luồn lách vật cản. Một bào tử nấm mốc có ít nhất 2-3 sợi nấm non (cũng có thể 14 coi đây là ống nảy sợi), từ một sợi nấm non sẽ hình thành hàng trăm sợi nấm khác, đây là hiện t−ợng mọc nhánh của sợi nấm. Nguyên sinh chất của tế bào bao gồm màng nguyên sinh chất, tế bào chất và nhân: + Màng nguyên sinh chất nằm sát bên trong thành tế bào và làm nhiệm vụ hấp thụ các chất dinh d−ỡng. + Tế bào chất là hệ thống keo phức tạp đ−ợc tạo thành từ protein, gluxit, lipit, các chất khoáng phân tán trong môi tr−ờng n−ớc. Trong tế bào chất có các ty thể, riboxom, thể golgi, mạng l−ới nội chất, thể màng biên (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999). Trong sợi nấm dòng nguyên sinh chất chuyển động theo h−ớng từ phần sợi nấm đã tr−ởng thành tới ngọn sợi nấm. Phần ngọn sợi nấm các thành phần cấu tạo liên quan đến quá trình tạo chất tế bào và các nguyên liệu cần thiết cho quá trình này cũng nhiều hơn các thành phần khác của sợi nấm. Nhân tế bào có vai trò quan trọng đối với nhiều hoạt động của sợi nấm, thành phần cơ bản của nhân tế bào gọi là prôtít nhân (hay nucleprotein). Nhân của tế bào là hình cầu có màng bao bọc, trong nhân có nhân con (nucleolus) bao gồm có protein, ADN, ARN và enzim. Chức năng của nhân là quyết định tính di truyền và tham gia điều kiện hoạt động sống. Các enzim không những tham gia có tính chất quyết định vào các hoạt động sinh lý cơ bản bên trong sợi nấm mà còn đóng góp quyết định vào quá trình hấp thụ thức ăn bên ngoài. Enzim đóng vai trò cắt các phân tử tinh bột thành các phân tử đ−ờng, các phân tử chất xơ thành đ−ờng, phân tử prôtít động thực vật thành các axit amin. Trong các sợi nấm có chất dự trữ là gluxít, một số loài dự trữ ở dạng lipit. Lipit có trong thành phần của vách sợi nấm (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999). Nấm mốc hấp thụ các axit amin tạo nên các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào d−ới dạng các thành phần (các bazơ nitơ) của axit nhân (axit nucleic). Thứ tự bazơ nitơ trong phân tử mốc đối với mỗi loại mốc là khác nhau. Các thể riboxom nằm rải rác trong chất nguyên sinh, đây là nơi sản xuất ra protein. Ty thể của tế bào nấm nhiều và đa dạng. Không bào chứa dịch tế bào (Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999). Thức ăn không chỉ cung cấp các nguyên liệu để cơ thể nấm mốc sản xuất th−ờng xuyên chất nguyên sinh, sợi nấm, chất dự trữ mà còn cung cấp năng l−ợng cho các hoạt động của cơ thể sống, trong đó có các hoạt động "sản xuất" các thành phần cấu tạo nên cơ thể. Thức ăn và các thành phần cấu tạo nên cơ thể gồm một hoặc một số các hợp chất hoá học nh−: gluxít, prôtít, lipid, axit nhân, vitamin, muối phốtphát, nitrát. Mỗi hợp chất hoá học đều do nhiều thành phần liên kết với nhau. Các hợp chất đơn giản nh− n−ớc, muối vô cơ các phần này chỉ là các nguyên tố: H2, O2, P, S...Năng l−ợng tạo ra các liên kết đó là hoá năng. Mỗi dạng liên kết t−ơng đ−ơng với một số năng l−ợng nhất định. Một số mối liên kết của các hợp chất trong cơ thể sống giữ một l−ợng năng l−ợng đặc biệt lớn, đó là những liên kết cao năng. Sự phát triển của nấm mốc còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi tr−ờng: nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy...(Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế 1999). 15 1.1.4.2. Đặc điểm hình thái và sinh sản loài Blakeslea trispora. Blakeslea trispora là nấm sợi, giữa hệ sợi không có vách ngăn, sinh sản vô tính hoặc hữu tính (Hình 1.1.3.). * Sinh sản hữu tính. Trong tất cả các thí nghiệm đã thực hiện, sự sinh sản hữu tính sảy ra khi khuẩn lạc của 2 chủng có giới tính đối lập phát triển tạo sợi nấm. Hai sợi nấm song song vói nhau mang giới tính đối lập (-) và (+) hay còn gọi là giao tử đực và giao tử cái, sợi nấm phát triển dài ra theo h−ớng phía tr−ớc và hình thành túi giao tử non ở đầu các sợi nấm. Vách ngăn trong túi giao tử non phát triển vào tạo tạo nang giao tử, các nang giao tử này sẽ dung hợp giới tính với nhau tạo thành trứng, đầu mỗi nhánh phình to ra, chỗ tiếp xúc của hai đầu nhánh xuất hiện một khối cầu mầu đen xù xì. Khi nhánh của mỗi sợi nấm chạm đầu vào nhau có nghĩa là giao tử đực và giao tử cái tiếp xúc với nhau (Lampila và cs 1985). Khi đó vách tế bào ở chỗ tiếp xúc bị tiêu huỷ để hai giao tử thông với nhau. Chất tế bào và nhân tế bào ở giao tử đực bị hút sang giao tử cái sau đó cả chất tế bào và nhân tế bào của 2 giao tử hoà trộn với nhau để thành 1 tế bào trong cái vỏ của giao tử cái. Tế bào mới này chính là trứng đã đ−ợc thụ tinh, trứng này phòng to, lớn lên, vỏ cũng dầy lên và càng ngày càng đen, càng sù sì, khối sù xì này là bào tử tiếp hợp, bào tử này không nảy mầm ngay thành cơ thể mới mà phát triển thành nhánh thẳng đứng, sau đó tiếp tục phát triển thành nang bào tử kín. Nang bào tử kín vỡ ra tung bào tử kín ra bên ngoài. Rất khó phân biệt đ−ợc bào tử kín có giới tính đối lập (+) và (-) vì không có đặc điểm khác biệt. Các bào tử tiếp tục nẩy mầm và có thể phối hợp hữu tính tiếp tục hoặc phát triển riêng biệt theo ph−ơng pháp vô tính. Bào tử tiếp hợp có chức năng tổng hợp các sản phẩm sinh học trong khi sợi nấm (hyphae) không có vai trò gì trong việc sản xuất β-caroten. Nh− vậy có sự t−ơng ứng tuyến tính giữa vùng không gian của bào tử tiếp hợp và hàm l−ợng β- caroten. Blakeslea trispora là loại vi nấm đa hình (polymorphíc) tổng hợp β-caroten với chu trình vòng đời bao gồm sợi nấm (hyphae), sợi nấm tiếp hợp (zygophores) và bào tử tiếp hợp (zygospo res)(Lampila và cs 1985). 16 Hình 1.1.3. Chu trình sinh sản vô tính và hữu tính của Blakeslea trispora. Trứng hình thành trong chu trình sinh sản hữu tính của Blakeslea trispora trên môi tr−ờng PDA 17 * Sinh sản vô tính: Trong sinh sản vô tính, bào tử đ−ợc hình thành ở phía trong do có cấu tạo túi bào tử. Túi bào tử có cấu trúc điển hình hơn cả chúng có dạng hình cầu nhỏ đ−ờng kính khoảng 80-120 àm chứa từ một đến hàng nghìn bào tử. Những bào tử chứa đầy ở bên trong khoang của túi (Ho và Chang 2003). * Các giai đoạn hình thành và phát triển của Blakeslea trispora. Khuẩn lạc Blakeslea trispora phát triển trên môi tr−ờng thạch đĩa, giai đoạn đầu hệ sợi có màu trắng, phát triển dầy đặc dần, hệ sợi cong có nhánh phủ kín bề mặt đĩa. Các giai đoạn phát triển thể hiện nh− sau (hình 1.1.4.) (Ho và Chang 2003): 1. Cuống nang hình cong trong giai đoạn nang bào tử kín đang phát triển (S). 2. Nang bào tử kín phát triển đến giai đoạn chín, bên trong có nhiều bào tử (S). 3. Trụ nang C và cổ trụ nang Co. 4. Thành các nang bào tử kín tách ra (SW) giải phóng các bào tử kín. 5. Các nang bào tử kín giải phóng khỏi nang bảo tử lớn, dọc theo chiều dài của nang bào tử kín có phần râu mọc ở 2 đầu (A). 6. Đỉnh của các bào tử kín thắt lại với nhau, gắn lên trên bề mắt hình cầu (V). Các cuống nang sinh ra các nang bào tử kín mọc ra từ hệ sợi, cuống nang mọc thẳng, không phân nhánh, cuống nang cao 1- 4mm, rộng 13-20 àm, nang bào tử kín khi còn nhỏ hình cầu có đ−ờng kính (30-) 60-90 (-210) àm. Giai đoạn đầu màu trắng sau đó có màu nâu đen. Khi tr−ởng thành nang bào tử lớn có màng bên ngoài bao bọc, mầu nâu, lớp vỏ ngoài chắc, sau đó nứt ra làm hai nửa, cuống nang biến mất khỏi các nang bào tử nhỏ, tại thời điểm đó các nang bào tử nhỏ có hình quả lê, trong suốt dài (40-) 55- 90 (-100) àm, rộng 30-40 àm, th−ờng có núm.. 7. Giai đoạn phát triển nang bào tử hình cầu (V), sau đó tách thành các nang hình cầu nhỏ bám trên bề mặt hình cầu lớn. 8. Ba bào tử đ−ợc tách ra. 9. Phá vỡ thành tế bào để các bào tử tách ra. 10. Các bào tử tách ra có cuống noãn. 11. Bào tử tiếp hợp cùng với cuống noãn Bào tử từ nang bào nhỏ hình ellíp, phần rộng của ellíp khoảng (5-) 6-8 àm màu nâu đỏ, chiều dài (10-) 12-18 àm. Hai đầu bào tử có râu, râu dài gấp 2 lần chiều dài bào tử. Cuống nang sinh ra nang bào tử từ hệ sợi cao 1-5 mm, rộng 13-20 àm, ở phía đầu không phân nhánh, thành hệ sợi trơn nhẵn, trong suốt không có vách ngăn, các nhánh bắt đầ thắt lại và giai đoạn cuối tạo ra một hình cầu lớn có đ−ờng kính 22-35 àm, các nang bào tử sinh ra trên bề mặt của đoạn phình hình cầu lớn, mỗi cuống nang sinh ra (1-) 8- 16 (-32) hình cầu nhỏ. Nang bào tử nhỏ hình ellip, gắn vào hình cầu lớn là các cuống của 18 hình cầu nhỏ dài 3-5àm, rộng 2,5 àm, mỗi hình cầu nhỏ chứa 3 bào tử (thậm chí còn có thể lên tới 4 bào tử) chúng rất mảnh nh−ng chắc, trong suốt, khi tr−ởng thành phá vỡ đ−ờng nối thành hai đoạn. Các bào tử từ nang bào tử hình ellip, chiều rộng của ellip có màu nâu đỏ, dài 12.5- 15(-18) àm, rộng 6-7.5(-8) àm, phần râu có chiều dài bằng chiều dài của bào tử. Bào tử tiếp hợp đ−ợc tạo thành ở d−ới bề mặt của môi tr−ờng, có đ−ờng kính 40-80 àm, hình cầu, mảnh, phẳng, ở tâm hình cầu có giọt dầu nhỏ ở giai đoạn tr−ởng thành, lớp thành phía ngoài mỏng hơn, có đ−ờng kẻ sọc. Thành bên trong dầy, nhẵn, cuống noãn kẹp ép vào, không có phần phụ, sinh ra từ vòng xoắn của sợi nấm, đ−ờng kính khoảng 10-80 àm mảnh. 19 1 2 3 4 5 6 Hình 1.1.4.Các giai đoạn phát triển của bào tử Blakeslea trispora 1. Cuống nang hình cong trong giai đoạn nang bào tử kín đang phát triển (S). 2. Nang bào tử kín phát triển đến giai đoạn chín, bên trong có nhiều bào tử (S). 3. Trụ nang C và cổ trụ nang Co. 4. Thành các nang bào tử kín tách ra (SW) giải phóng các bào tử kín. 5. Các nang bào tử kín giải phóng khỏi nang bảo tử lớn, dọc theo chiều dài của nang bào tử kín có phần râu mọc ở 2 đầu (A). 6. Đỉnh của các bào tử kín thắt lại với nhau, gắn lên trên bề mắt hình cầu (V). 20 7 8 9 10 11 Hình 1.1.4. Giai đoạn phát triển của bào tử 7. Giai đoạn phát triển nang bào tử hình cầu(V), sau đó tách thành các nang hình cầu nhỏ bám trên bề mặt hình cầu lớn 8. Ba bào tử đ−ợc tách ra 9. Phá vỡ thành tế bào để các bào tử tách ra 10. Các bào tử tách ra có cuống noãn 11. Bào tử tiếp hợp cùng với cuống noãn 21 1.1.4.3. Quá trình tổng hợp β-caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora. Các terpenoit đều bắt nguồn từ tiền chất chung là isopentenyl pyrophosphate. Chất này đ−ợc tổng hợp theo chu trình Mevalonate (Hình 1.1.5.). 3-Hydroxymethylglutaryl coenzim A (HMG-CoA) và mevalonate là các chất trung gian của chu trình mevalonate. Gene mã hoá cho hai enzim đầu tiên của chu trình mevalonate là HMG-CoA synthase và HMG-CoA reductase đã đ−ợc tách dòng ở Phycomycetes và nó đã đ−ợc giải trình tự từ bốn chủng thuộc bộ Mucorales. Sinh tổng hợp terpenoid đ−ợc hình thành thông qua quá trình trùng ng−ng mạch 5 cacbon tạo thành các phân tử lớn hơn nh− geranyl pyrophosphate, farnesyl pyrophosphate, geranylgeranyl pyrophosphate. Qúa trình tổng hợp carotenoid cần 2 phân tử geranylgeranyl-PP sau đó enzim dehydrogenase xúc tác phản ứng dehydro liên tiếp 4 lần trên phytoen. Khi giải phóng nhóm pyrophosphate đầu tiên sẽ tạo ra tiền phytoene pyrophosphate và giải phóng nhóm pyropohossphate thứ hai tạo nên phytoene. Theo các tài liệu nghiên cứu công bố gần đây, quá trình bão hoà đ−ợc tạo nên thông qua các phản ứng dehydrogen trong đó hydrogen chuyển đến phân tử NADP hoặc FAD. Một enzim khác là cyclase vòng hoá lycopen hình thành α-caroten, tiếp tục vòng hoá α-caroten tạo β-caroten (Goodwin, 1980). 1.1.5. ảnh h−ởng của điều kiện nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp β-caroten của Blakeslea trispora. Thành phần môi tr−ờng và điều kiện nuôi cấy là nhân tố quyết định tới quá trình sinh tr−ởng phát triển cũng nh− khả năng sinh tổng hợp β-caroten của B. trispora. Thành phần môi tr−ờng bao gồm các yếu tố nh− nguồn cacbon, nguồn nitơ, các chất khoáng và vi l−ợng, chất hoạt động bề mặt …(Mantzouridou và cs 2002). ảnh h−ởng của nguồn cacbon: Cacbon là nguyên tố quan trọng chiếm tới 45-50% trọng l−ợng khô của tế bào. Các nguồn cácbon khác nhau sẽ có ảnh h−ởng khác nhau tới quá trình sinh tổng hợp β- caroten. Blakeslea trispora có khả năng sử dụng tốt các loại đ−ờng 6 cacbon (Lampila và cs 1985). Theo Rouska và Mantzouridou (2001), tiến hành thí nghiệm nuôi cấy Blakeslea trispora trên môi tr−ờng có nguồn cácbon khác nhau thì sự hình thành bào tử và sự phát triển thay đổi. Blakeslea trispora phát triển trên nguồn cácbon là glucoza, galactose, cellobioza tốt hơn là trên môi tr−ờng có nguồn cácbon là tetraloza, maltoza. ảnh h−ởng của nguồn nitơ: Nitơ chiếm tới 10-15% khối l−ợng khô của tế bào. Nguồn nitơ cung cấp cho tế bào có thể là nguồn vô cơ (các muối vô cơ nh− nitrit, nitrat, amoni …) hoặc hữu cơ (các axit amin, peptit, protein …). Trong các nguồn nitơ, B.trispora có khả năng sử dụng cao ngô, 22 Hình 1.1.5. Quá trình hình thành β-caroten từ nấm sợi B. trispora 23 dịch thuỷ phân protein, pepton, cao nấm men, bột đậu t−ơng và các loại muối vô cơ nh− NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3… (Mantzouridou và cs 2002). ảnh h−ởng của nguồn khoáng: Các chất khoáng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý của tế bào. Các nguyên tố khoáng cần thiết cho sinh tr−ởng và phát triển tế bào là P và S, một l−ợng nhỏ Fe, Mn, Ca, Mg. Các nguồn khoáng đ−ợc cung cấp d−ới dạng các muối vô cơ nh− KH2PO4, MgSO4 hay các tạp chất có trong các thành phần khác của môi tr−ờng (Mantzouridou và cs 2002). ảnh h−ởng của các chất hoạt động bề mặt: Hình thái sợi nấm của Blakeslea trispora đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp β-caroten. Sau khi nuôi cấy bào tử Blakeslea trispora có thể quan sát đ−ợc quá trình biến thể của hệ sợi nấm trên kính hiển vi. Bổ sung thêm một số chất hoạt động bề mặt vào môi tr−ờng nuôi cấy có khả năng làm tăng l−ợng sinh khối nấm sợi và sự tổng hợp chất màu. ảnh h−ởng của các tiền chất: Một số các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi bổ sung vào môi tr−ờng nuôi cấy Bl trispora một số tiền chất có cấu trúc vòng β hoặc có tác dụng kích thích sự tổng hợp chất màu carotenoit nh− kerosene, β-ionone, isoniazit sự giảm phân sẽ xẩy ra trong đa số hoặc trong một số ít bào tử tiếp hợp và chúng sẽ nảy mầm tạo nang bào tử (bào tử túi) hoặc tạo các sợi nấm (Mantzouridou và cs 2002). Bào tử túi đ−ợc tách ra nh− tế bào độc lập và có chức năng nh− bào tử phân tán và các không bào hình trụ đ−ợc hình thành. Các không bào là vị trí l−u giữ quan trọng khi tổng hợp β-caroten. ảnh h−ởng của dầu thực vật: Trong các loại dầu tự nhiên nh− dầu ôliu, dầu hạt bông, dầu đậu t−ơng, dầu vừng... mà trong thành phần của chúng có chứa axít linoleic bổ sung vào môi tr−ờng nuôi cấy nấm sợi Blakeslea trispora sẽ làm tăng sự tổng hợp chất màu. Tuy nhiên, nếu chỉ bổ sung dầu tự nhiên không cũng không làm tăng sự tổng hợp chất màu mà cần phải kết hợp cả chất chống ôxy hoá thì sự tổng hợp chất màu đạt cao nhất. Điều đó có thể đ−ợc giải thích là dầu tự nhiên có tác dụng chống sự ôxy hoá của axít linoleic trong quá trình lên men. Hoặc trong thành phần của dầu tự nhiên có một vài thành phần có tác dụng thúc đẩy quá trình tổng hợp chất màu (Rouska và Mantzouridou, 2001). ảnh h−ởng của axít trisporic (AT) và cấu trúc của nó tới sự tạo thành carotenoit: Lampila và cộng sự (1985) đã thu đ−ợc 3 chất có khả năng kích thích gen tạo carotenoit ở Blakeslea trispora. Các nhà khoa học này đã nghiên cứu cấu trúc hoá học của từng chất này và thấy rằng thành phần quan trọng nhất (80%) là trisporic axít C. Cùng lúc, Sebeck và Jager cũng thu nhận và xác định 4 yếu tố kích thích sự sản sinh caroten là các axít trisporic từ dịch lên men chủng Blakeslea trispora có giới tính cái (-). Trisporic axit 24 C là axit béo không no có nhiều nối đôi (C18 – keto axít). Các tác giả này đã nghiên cứu các chủng Blakeslea trispora đột biến sản sinh một l−ợng β-caroten không cao và đã kết luận rằng sự làm suy yếu gen tạo carotenoit là do sự ức chế tạo trisporic axít (AT). Trisporic axit B: R = - C – CH3, trisporic axit C: R = - CHOCH3. AT đ−ợc bổ sung vào dịch nuôi cấy các chủng đực cái riêng biệt sau khi lên men. Kết quả cho thấy AT kích thích chủng Blakeslea trispora có giới tính cái (-) sản sinh caroten nhiều hơn. Điều đó có thể dự đoán rằng AT có thể đã có tác động kích thích tích cực đến hệ thống enzim (Lampila và cs 1985). ảnh h−ởng của pH ban đầu: Hàm l−ợng β-caroten nếu pH dịch lên men kiềm, dải hoạt động pH của các chủng Blakeslea trispora rất rộng có thể phát triển từ pH axit yếu tới pH kiềm mạnh. Nh− vậy có thể nói rằng pH tối −u cho tổng hợp β-caroten phụ thuộc vào một vài thông số lên men nh− cơ chất, giống VSV, hệ thống lên men và tổng quát là các điều kiện mà ở đó tiến hành mẻ lên men (Rouska và Mantzouridou 2001). ảnh h−ởng của nhiệt độ nuôi cấy: Nấm mốc là vi sinh vật −a ấm, nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh tr−ởng và phát triển từ 25-350C. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp làm chậm quá trình sinh tr−ởng của bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten thấp, thời gian lên men rất dài, không hiệu quả kinh tế. Nếu nhiệt độ tăng cao, bào tử phát triển kém, nhỏ, hệ sợi chuyển sang mầu trắng trong môi tr−ờng PDA, còn trong môi tr−ờng lên men hệ sợi dài mảnh, xuất hiện nhiều bào tử hơn là hệ sợi, hiệu suất sinh tổng hợp β-caroten thấp (Lampila và cs 1985). ảnh h−ởng của ánh sáng: ánh sáng cũng góp phần vào việc sinh sản sinh lý của một số nấm mốc. Nuôi cấy Blakeslea trispora với điều kiện chiếu sáng tạo bào tử tốt hơn và tạo nhiều màu vàng hơn là nuôi cấy trong bóng tối, nh−ng độ chênh lệch nhau không nhiều. Không có sự ảnh h−ởng chắc chắn của sự cảm ứng ánh sáng với các gen tạo carotenoit. Trong một số sinh vật, ánh sáng định l−ợng làm tăng khả năng tổng hợp carotenoit, trong khi ở các loài khác nó gây ra quá trình tạo gen tổng hợp carotenoit. Sự nhậy cảm ánh sáng đ−ợc hoạt hoá bằng một cơ quan nhận cảm ánh sáng mà nó hấp thụ năng l−ợng ánh sáng. Nói chung, gen tạo caroten cảm nhận ánh sáng trong các sinh vật là rất khác nhau với các b−ớc sóng và độ dài của sự chiếu sáng. Một số các carotenoit đ−ợc tạo ra khi sự chiếu sáng gần tới mức bão hoà (Lampila và cs 1985). ảnh h−ởng của oxy: Ôxy là điều cần thiết cho sự phát triển và sản sinh β-caroten khi nuôi cấy Blakeslea trispora, C. cucurbitarum và Nearospora. Vai trò của oxy trong sự cảm ứng ánh sáng đã đ−ợc coi nh− một chất nhận điện tử (giữ các thành phần oxy hoá khử nh− flavin hay sắc tố 25 tế bào – cytochrome trong giai đoạn oxy hoá riêng biệt) hay nh− một phân tử tham gia thẳng vào phản ứng của cơ quan thụ cảm ánh sáng (Lampila và cs 1985). Hàm l−ợng ôxy hoà tan cao cũng làm cho vi sinh vật bị ảnh h−ởng, có thể dẫn đến sự phá huỷ protein, DNA và lipids. Các kết quả trên cho thấy không thể sử dụng các thành phần môi tr−ờng thích hợp khi nuôi cấy trên máy lắc để lên men trên các thiết bị lên men mà cần phải có sự nghiên cứu, thay đổi cho phù hợp hơn. Độ bền của β-caroten. Độ bền của β-caroten trong quá trình lên men khác với nó trong quá trình sấy khô. Một số tác giả đã nghiên cứu các yếu tố tự kích thích, tự điều chỉnh bên trong của vi sinh vật, các yếu tố tự điều chỉnh này đ−ợc tạo ra trong quá trình lên men, từ các thành phần môi tr−ờng hoặc từ các chất tạo ra trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Các yếu tố tự điều chỉnh này đã đ−ợc xác định có bản chất hoá học nh− các eters với một nhóm alcohol. Blakeslea trispora đã đ−ợc xác định là một trong những vi sinh vật có khả năng tạo đ−ợc các chất tự điều chỉnh. β-caroten đ−ợc giữ lại trong hệ sợi, và nếu quá trình lên men quá kéo dài thì hiệu suất thu nhận chất màu cũng bị giảm đi. 1.1.6. Vi nang và các ph−ơng pháp tạo vi nang. β-caroten là hợp chất đ−ợc con ng−ời tổng hợp đầu tiên và cho tới nay vẫn còn là một loại chất màu đ−ợc sử dụng nhiều nhất. Nh−ng việc sử dụng chất màu này trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc vẫn tồn tại 2 vấn đề ch−a giải quyết đ−ợc đó là khả năng tan trong n−ớc và độ ổn định của sản phẩm khi bảo quản rất kém. Công nghệ vi nang hoá là một công nghệ đang đ−ợc đánh giá là đặc biệt −u việt và đang đ−ợc các nhà sản xuất trong và ngoài n−ớc quan tâm sử dụng. 1.1.6.1. Giới thiệu về công nghệ vi nang hoá và vi nang. Có thể định nghĩa vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định. Hiện nay không có một tiêu chuẩn nào quy định về kích th−ớc vi nang. Tuy nhiên, nhiều tài liệu th−ờng phân loại nh− sau: 1000 àm gọi là macrocapsule. Các vi nang hiện co trên thị tr−ơng có kích th−ớc nằm trong khoảng từ 3 àm tới 800 àm và chứa 10-90% vật liệu lõi (Lamprecht và cs 2000). Quá trình tạo vi nang là quá trình bao gói một hay một hỗn hợp chất nào đấy gọi là chất nhân (lõi) trong một màng bao liên tục (vỏ) th−ờng là một polyme hay kết hợp hai polyme (trong ph−ơng pháp đông tụ phức hợp). Vi nang có thể có nhiều cấu trúc khác nhau. Một số loại có hình cầu (th−ờng là vi nang tạo thành theo ph−ơng pháp tách pha đông tụ) với nhân liên tục bao quanh bởi một lớp màng liên tục. Một số khác có hình dạng bất kỳ chứa nhiều hạt nhân bên trong. 26 Vi nang có những −u điểm nh−: - Các chất thể lỏng, nhớt có thể chuyển sang trạng thái rắn giống nh− bột: ví dụ nh− dầu cá, dầu vaselin, các VTM tan trong dầu nh− VTM A, D, E v.v… ở dạng tồn tại này, các chất kỵ n−ớc có thể phân tán tốt hơn trong chất mang thân n−ớc. - Có thể che dấu các mùi khó chịu và tính kích ứng của một số đ−ợc chất khi dùng theo đ−ờng uống nh− phenylbutazon, tetracylin v.v… - Hạn chế sự bay hơi của một số chất dễ bay hơi, thăng hoa nh− tinh dầu, long não, methylsalicylat v.v… - Tăng khả năng ổn định, bền vững về mặt vật lý, hoá tính của một số chất nhờ hạn chế các quá trình không mong muốn nh− oxy hoá khử, thuỷ phân, t−ơng tác giữa các chất nh− VTM C, VTM A v.v… - Có thể kiểm soát đ−ợc khả năng sử dụng của các chất. Chẳng hạn nh− có thể làm tăng hay giảm tốc độ giải phóng của d−ợc chất, thiết lập các điều kiện để kéo dài thời gian tác dụng. Tạo vi nang bao gồm toàn bộ những kỹ thuật cho phép tạo ra các phần tử nhỏ bé riêng biệt có cấu tạo gồm một vật liệu vỏ có chứa vật liệu cần bao (th−ờng là chất hoạt động). Các phần tử nhỏ hay vi nang có kích th−ớc 1àm đến 1mm và có 5 đến 90% w/w là vật liệu cần bao. Những chất cần bao gói rất đa dạng: d−ợc phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm, hóa chất bảo vệ thực vật, tinh dầu thơm, vi sinh vật, tế bào, chất xúc tác phản ứng... Vật liệu vỏ th−ờng là các polyme nguồn gốc tự nhiên hay tổng hợp hoặc là các lipit. Các phần tử nhỏ này th−ờng có 2 dạng hình thái chủ yếu: - Dạng vi nang (microcapsule) trong đó mỗi phần tử có chứa chất hoạt động dạng lỏng (ít nhiều có độ nhớt) hay rắn ở trung tâm, bao quanh là một vỏ dạng rắn làm bằng vật liệu vỏ. - Dạng vi cầu trong đó mỗi phần tử đ−ợc tạo nên bởi một mạng l−ới liên tục của các đại phân tử hay lipit tạo thành một khối, trong đó có sự phân bố đồng đều của chất hoạt động ở dạng các phân tử hoặc dạng phần tử rắn hay tồn tại ở dạng giọt nhỏ. Trong công nghiệp, ng−ời ta tạo vi nang nhằm mục đích: bảo vệ, tạo sự t−ơng quan và tăng độ bền vững của chất hoạt động trong khi phối trộn nhằm tạo ra dạng đồng nhất, tạo vi nang còn nhằm che dấu mùi vị, thay đổi và kiểm soát cách thức giải phóng chất hoạt động nhằm mục đích kéo dài thời gian tác dụng. Trong ngành thực phẩm và trong lĩnh vực thực phẩm chức năng, việc tạo vi nang có tác dụng che dấu vị đắng (của vitamin B); thậm chí lớp vỏ bao còn có thể đ−ợc bổ sung thêm h−ơng liệu để tăng hiệu quả. Tạo vi nang còn giúp ngăn ngừa những t−ơng tác giữa các thành phần trong thực phẩm cũng nh− bảo vệ các chất hoạt động (chất cần bao nang) khỏi những tác động của 27 quá trình oxy hóa (bảo vệ các chất thơm), của độ ẩm (tạo vi nang cho muối, đ−ờng...), của ánh sáng, môi tr−ờng axit hay kiềm, quá trình bay hơi (với các chất dễ bay hơi nh− tinh dầu). Tạo vi nang cho các enzym hay các probiotic là nhằm kiểm soát và làm chậm quá trình giải phóng chúng. Quá trình tạo vi nang cũng tạo điều kiện cho thao tác sản xuất vì nó cho phép tạo ra sản phẩm lỏng d−ới dạng bột dễ sử dụng. Có nhiều cách để giải phóng chất đ−ợc bao: dùng nhiệt (làm nóng chảy lớp vỏ bao), dùng enzym (chất bao sẽ đ−ợc giải phóng nhờ hoạt động của enzym lipaza của tuyến tụy), dùng ph−ơng pháp cơ học (phá vỡ lớp vỏ bao trong khi nhai). Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, việc tạo vi nang cho các chất hoạt động −a n−ớc hay kị n−ớc (vitamin, tinh dầu, chất hydrat hóa) không chỉ có tác dụng bảo vệ mà còn giúp các chất trên đ−ợc giải phóng từ từ và giúp chúng tác động đến đúng mục tiêu. Trong ngành sản xuất thức ăn gia súc, tạo vi nang đ−ợc dùng để tạo các hỗn hợp thức ăn dạng bột hay để che dấu mùi vị sản phẩm, để gia súc chấp nhận loại thức ăn đó. Đối với ngành in thì các vi nang có khả năng bám dễ dàng lên giấy, bìa carton hay plastic nhờ các kỹ thuật in offset khô hay ẩm, mực thơm... Kỹ thuật này đ−ợc dùng chủ yếu trong quảng cáo, nhất là với những phần tử có mùi thơm. H−ơng thơm sẽ đ−ợc giải phóng khi vi nang bị phá vỡ bằng cơ học hay bằng cách thấm dần qua vỏ. Nh− đã biết, thành phần của vi nang gồm hai phần: phấn lõi và phần vỏ. Phần lõi rất phong phú, có thể ở dạng rắn, lỏng, hỗn hợp, nhũ t−ơng v.v… Phần vỏ vi nang chiếm từ 1- 70% khối l−ợng quyết định tính chất của vi nang Phần vỏ đ−ợc lựa chọn phải đáp ứng các yêu cầu sau đây: - Phải phù hợp với mục đích, mục tiêu đặt ra khi đ−a chất cần bao vào vi nang nh−: bền, ổn định, giảm đ−ợc sự bốc hơi, cải thiện h−ơng vị, kiểm soát tốc độ giải phóng chất hoạt động... - Phải phù hợp với ph−ơng pháp cũng nh− với máy móc thiết bị dùng trong quá trình tạo vi nang. - Đảm bảo một số tính chất cơ lý phù hợp: độ bền, độ cứng, độ dẻo, khả năng thấm và độ ổn định. - Phải tạo đ−ợc lớp màng liên tục, đồng nhất bao quanh lõi. - Phải t−ơng hợp với chất hoạt động cần bao nang. 1.1.6.2. Các ph−ơng pháp tạo vi nang. Có rất nhiều ph−ơng pháp đ−a ra để tạo vi nang và có khoảng hơn 200 ph−ơng pháp đã đ−ợc giới thiệu trong các tài liệu (Gouin, 2004). Các ph−ơng pháp này có sự khác biệt nhau về nhiều mặt nh− khả năng hòa tan của polyme tạo vỏ, kích th−ớc vi nang, độ dày vỏ và tính thấm của màng bao, các tính chất vật lý v.v... Tuy nhiên ng−ời ta phân ra 3 nhóm ph−ơng pháp chính: - Ph−ơng pháp hóa lý: tách pha đông tụ, bốc hơi dung môi, tĩnh điện, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn.... 28 - Ph−ơng pháp hóa học: polyme hóa liên bề mặt, tạo mạng l−ới hay polyme hóa nhũ t−ơng. - Ph−ơng pháp cơ học: sấy phun, sấy tầng sôi, nghiền, ly tâm.... Ph−ơng pháp tách pha đông tụ: Trong ph−ơng pháp này, màng polyme dùng làm vỏ bao gói các hạt nhũ t−ơng đ−ợc tạo ra bằng cách tạo kết tủa từ dung dịch keo của chính polyme đó sau khi đã bị làm mất ổn định nhờ các biến đổi vật lý hay hóa học trong môi tr−ờng: thay đổi thành phần (thêm vào chất điện ly, polyme khác không t−ơng đồng với polyme thứ nhất, polyme trái dấu), thay đổi pH, nhiệt độ. Ban đầu, kết tủa xảy ra trong lòng dung dịch keo d−ới dạng các hạt nhỏ gọi là hạt keo- coacervat cỡ 1nm đến 0,5àm, thành phần các hạt này rất giàu polyme và rất nhớt. Sau đó các hạt keo dần kết dính lại với nhau hoặc đ−ợc hấp thụ lên bề mặt nhũ t−ơng cần bao gói. Để tránh hiện t−ợng các hạt keo dính lại với nhau đồng thời để tăng c−ờng hiệu quả bao nang, ng−ời ta thêm vào từ tr−ớc đó một chất bảo vệ độ bền keo của dung dịch. Các hạt keo đ−ợc hấp phụ lên bề mặt nhũ t−ơng sẽ dính kết với nhau để tạo thành một màng liên tục. Công đoạn cuối cùng là làm rắn vỏ bao theo một số cách khác nhau: làm lạnh, đesolvat hóa (tách dung môi) sâu hơn, hoặc chiếu xạ. Vi nang thu đ−ợc th−ờng có kích th−ớc d−ới 1,25 mm, có lớp vỏ dày 1-50 àm có tính đàn hồi, và có hàm l−ợng chất cần bao chiếm trên 60% (Gouin, 2004, Remunan và Bodmeier, 1996). Đông tụ đơn giản thu đ−ợc bằng cách thêm vào hệ một chất hoà tan trong n−ớc (etanol) hay một chất điện ly. Thực chất là quá trình loại n−ớc của chất keo thân n−ớc dẫn tới làm giảm độ tan của các chất keo. Ví dụ điển hình nhất là thêm Na2SO4 vào hệ O/W trong gelatin. Hệ có thể đ−ợc ổn định bằng cách hạ pH, hạ nhiệt độ hoặc thêm các tác nhân crosslinking. Đông tụ phức hợp xảy ra khi trung hoà lẫn nhau của hai polyme trái dấu. Đông tụ phức hợp có thể đ−ợc sử dụng cho các chất lỏng không tan trong n−ớc, cho phép tạo ra nang có kích th−ớc từ 20-800àm chứa 80-90%. Hầu hết vi nang tạo theo ph−ơng pháp này có phần lõi liên tục tuy nhiên lớp vỏ không đồng nhất về bề dày. Vi nang sau sấy th−ờng nhạy cảm với độ ẩm. Điều này th−ờng đ−ợc hạn chế bằng cách xử lý với ure hoặc formaldehyde trong môi tr−ờng axit. Tách pha cũng có thể đ−ợc thực hiện khi thêm vào hệ một polyme khác không t−ơng đồng với polyme thứ nhất. Trong ph−ơng pháp đông tụ phức hợp, hai polyme trái dấu sẽ kết hợp với nhau tạo thành các hạt trung hoà điện tích và cả 2 polyme này cùng tạo thành lớp vỏ của vi nang. Ng−ợc lại trong hệ polyme - polyme không t−ơng thích thì hai polyme khác nhau về hoá tính cùng đ−ợc hoà tan trong một dung môi chung. Hai polyme này không tan lẫn trong dung dịch, chúng đẩy nhau và tạo thành hai pha lỏng riêng biệt. Một pha giàu polyme là vật liệu làm vỏ. Pha kia giàu polyme còn lại (gọi là polyme không 29 t−ơng thích). Polyme không t−ơng thích đ−ợc đ−a vào hệ nhằm mục đích tạo ra hai pha và không có mặt trong thành phần vỏ của vi nang nh−ng chúng có thể còn sót lại nh− một tạp chất. Loại ph−ơng pháp tạo vi nang này th−ờng không sử dụng tới phản ứng hoá học. Ph−ơng pháp này bao gồm những b−ớc sau: Giai đoạn 1: tạo nhũ t−ơng của vật liệu cần bao trong dung dịch keo. Giai đoạn 2: hình thành các hạt keo nhờ các biến đổi lý hóa. Giai đoạn 3: tách polyme để hình thành lớp màng bao liên tục. Giai đoạn 4: làm rắn lớp vỏ bao. Vật liệu vỏ có thể là: gelatin, Gelatin + gôm arabic, Natri cazeinat, Gelatin và lecithin, Albumin và lipit, Gelatin + acacia, Gelatin + CMC, Gelatin + natri alginat. Ph−ơng pháp bốc hơi dung môi: Ph−ơng pháp này dựa trên sự bay hơi pha nội tại của một nhũ t−ơng bởi khuấy trộn. Ph−ơng pháp này cho phép tạo ra loại vi nang có kích th−ớc từ vài micron đến vài trăm micron. Ph−ơng pháp này dựa trên sự bay hơi nội tại của một pha trong nhũ t−ơng trong khi khuấy trộn. Trong giai đoạn đầu tiên, polyme dùng làm vỏ bao đ−ợc hòa tan trong dung môi dễ bay hơi. Chất cần bao sẽ đ−ợc bổ xung sau đó d−ới dạng phân tán hay tan lẫn để tạo thành một hỗn hợp huyền phù, nhũ t−ơng hay một dung dịch. Trong giai đoạn hai, pha hữu cơ sẽ đ−ợc nhũ hóa bằng cách khuấy trộn pha liên tục - pha này không phải dung môi của polyme tạo vỏ nh−ng có thể đi vào pha hữu cơ, nó th−ờng chứa chất hoạt động bề mặt. Khi nhũ t−ơng hình thành ổn định, vẫn phải tiếp tục khuấy trộn và dung môi sau khi khuếch tán vào pha liên tục sẽ bay hơi dần. Các phần tử nhỏ sẽ dần hình thành trong quá trình này. Khi quá trình bốc hơi kết thúc hoàn toàn, những phần tử nằm lơ lửng trong pha liên tục sẽ đ−ợc thu hồi bằng cách lọc hay ly tâm [Benita, 1996]. Trong giai đoạn bay hơi cần đ−ợc l−u ý kỹ để hạn chế tối đa sự kết tinh của chất cần bao khi làm rắn màng polyme. Bảng 1.1.1. Các sản phẩm vi nang đ−ợc sản xuất bằng ph−ơng pháp tách pha đông tụ [Higuera và cs, 2004] N0 Vật liệu bao Vật liệu nhân ứng dụng 1 Gelatin Tinh dầu hoa h−ơng thảo CNTP, CN d−ợc 2 Gelatin+ gôm arabic Tím tinh thể Giấy copy 3 Gelatin+ gôm arabic Tinh dầu: gừng, tỏi, mùi, chanh, cam, bạc hà CNTP, Mỹ phẩm 4 Na caseinat VTM, dầu cam CN d−ợc 5 Gelatin + leucitin VTM E CN đồ uống và n−ớc quả 6 Albumin + lipid Dầu ngô Thức ăn gia súc 7 Gelatin + acacia D−ợc chất CN d−ợc 8 Gelatin + CMC Tinh dầu chanh Mỹ phẩm 9 Gelatin + Na alginat VTM C trong dầu cá CN d−ợc 30 Quá trình tạo vi nang bằng bốc hơi dung môi có thể tóm tắt nh− sau: Với hệ nhũ t−ơng O/W thì dung môi không hoà tan của polyme hay đ−ợc dùng nhất là n−ớc. Trong hệ thống này, polyme đ−ợc hoà tan vào dung môi hữu cơ bay hơi nh− methylen chloride hay chloroform. Nhân đ−ợc hoà tan hay phân bố vào cùng môi tr−ờng đó và sau đó toàn bộ hỗn hợp đ−ợc nhũ hoá trong dung dịch n−ớc chứa chất hoạt động bề mặt. Kỹ thuật này đặc biệt thich hợp để tạo vi nang của các chất −a béo và đã đ−ợc sử dụng rộng rãi để sản xuất vi nang của nhiều d−ợc chất nh− steroidal hormon, anti- imflammatories, cytostatics và neuroleptics. Các tính chất hoá lý của vật liệu làm lõi nh− hệ số phân bố, mức độ ion hoá, tính chất bề mặt đóng vai trò quan trọng trong việc nó có phân bố đ−ợc hay không vào hệ nhũ t−ơng ban đầu. Trong ph−ơng pháp bốc hơi dung môi, dung môi hữu cơ của pha phân tán của hệ nhũ t−ơng đ−ợc tách theo hai b−ớc: - Khuếch tán dung môi trong pha phân tán (tách chiết dung môi). - Loại bỏ dung môi tạo bề mặt phân pha giữa pha phân tán và pha khí (bay hơi dung môi). Về lý thuyết, nếu sử dụng pha liên tục có khả năng tách chiết lập tức dung môi của pha phân tán thì b−ớc tiến hành bốc hơi dung môi trở nên không cần thiết nữa. Về thực tiễn, điều này có thể đạt đ−ợc nhờ sử dụng một l−ợng loán thể tích pha liên tục so với pha phân tán hoặc nhờ lựa chọn pha phân tán chứa cosolvant có ái lực lớn đối với pha liên tục. Cũng có thể sử dụng pha liên tục với 2 dung môi mà 1 trong 2 dung môi đó là dung môi tách chiết của pha phân tán. Cũng có thể sử dụng ph−ơng pháp lai tạo giữa bốc hơi dung môi và tách chiết dung môi. Việc bay hơi xảy ra tr−ớc nh−ng không triệt để. Theo cách này, các vi cầu tạo ra đ−ợc chuyển vào pha liên tục nhiều hơn (th−ờng chứa nhiều n−ớc) và tại đó l−ợng dung môi còn lại sẽ đ−ợc tách chiết nốt. Ph−ơng pháp này đ−ợc Benita (1996) phát triển nhằm tránh sự hình thành các tinh thể của vật liệu làm nhân trong quá trình bay hơi dung môi, làm giảm hiệu quả tạo vi nang. Việc tạo vi nang sử dụng chất lỏng siêu tới hạn có thể đ−ợc thực hiện bằng cách tạo kết tủa nh− trên hay cũng có thể thực hiện dựa trên việc đ−a hệ dung dịch A trong chất lỏng siêu tới hạn đến trạng thái quá bão hoà bằng cách hạ nhiệt độ và xảy ra hiện t−ợng kết tinh A. Cũng có thể tạo vi nang bằng cách tạo hỗn hợp giữa chất tan và chất lỏng siêu tới hạn sau đó phun hỗn hợp vào môt tr−ờng có áp suất thấp. D−ới điều kiện này, các phân tử chất tan sẽ kết hợp với nhau tạo thành các thực thể cơ nanomet. Sau đó hệ cần đ−ợc cấp nhiệt để dung môi bay hơi. Việc cấp nhiệt cho hệ này đòi hỏi ít năng l−ợng hơn rất nhiều so với hệ sử dụng dung môi thông th−ờng. Ví dụ nh− đối với n−ớc cần cấp nhiệt tới 2000C còn đối với CO2 lỏng chỉ cần cấp nhiệt tới 55 0C. 31 Ph−ơng pháp nhũ hoá - sấy phun: Ph−ơng pháp này đã đ−ợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm từ những năm 30 để bảo vệ chất thơm khỏi bị oxy hóa và để chuyển lipit sang dạng rắn (Gouin, 2004). Ph−ơng pháp này bao gồm hai giai đoạn: - Chất cần bao đ−ợc hòa vào một dung dịch hữu cơ hay n−ớc có nồng độ polyme cao (40- 60%). - Hỗn hợp đ−ợc phun thành hạt nhỏ qua vòi phun bằng một dòng n−ớc nóng (150- 2000C). Dung môi của polyme sẽ bay hơi và giúp làm rắn màng polyme xung quanh chất cần bao. Khi phun vào dòng khí nóng, các hạt sẽ đ−ợc tách n−ớc nhanh chóng tạo thành các nang khô và đ−ợc thu ở đáy buồng sấy. Nang thu đ−ợc th−ờng có kích th−ớc từ 10 - 300àm và có xu h−ớng không đồng nhất về hình dạng, có thể kết tụ với nhau, một nang có thể có nhiều nhân (Benita, 1996, Gouin, 2004). Với ph−ơng pháp này, nói chung chất cần bao là những chất kỵ n−ớc nh− các chất thơm, h−ơng, vị hay các vitamin tan trong dầu. Nhân đ−ợc phân tán vào dung dịch vỏ tới hạt có kích th−ớc 1 - 3àm. Vật liệu vỏ th−ờng có chứa các polyme nh− gôm arabic hay tinh bột biến tính là những chất không tạo ra dung dịch quá nhớt ngay cả ở nồng độ cao nên rất thuận lợi cho quá trình sấy phun. Hỗn hợp của vật liệu vỏ với tinh bột thuỷ phân (maltodextrin) hay gelatin thuỷ phân cũng đã đ−ợc sử dụng. Ph−ơng pháp này dung môi −a dùng nhất là n−ớc. Các dung môi hữu cơ ít đ−ợc sử dụng do tính độc và dễ cháy nổ của chúng. Cần chú ý hai điểm khi lựa chọn vật liệu vỏ cho ph−ơng pháp này là khả năng tạo nhũ t−ơng với vật liệu cần bao gói và độ bền của nó ở nhiệt độ cao, th−ờng l−u ý đặc biệt với các protein vì nó có khả năng bị biến tính do nhiệt làm cho lớp vỏ thu đ−ợc không đ−ợc nh− mong muốn. Ph−ơng pháp tạo vi nang này bằng sấy phun có rất nhiều −u điểm. Đây là một công nghệ đã đ−ợc xác lập, tin cậy, thiết bị có sẵn và có năng suất lớn. Nhiều nguyên liệu dùng để làm vỏ bao rất quen thuộc với công nghiệp thực phẩm. Thêm vào đó những nguyên vật liệu này lại tan trong n−ớc và không cần sử dụng các tác nhân (hiệu ứng cross- linking). Nhờ đó các vi nang có thể hòa tan vào n−ớc và giải phóng chất đ−ợc bao mà không hề để lại các mảnh vỏ nang. Đây chính là một −u điểm v−ợt trội của ph−ơng pháp sấy phun so với ph−ơng pháp bốc hơi dung môi có sử dụng tác nhân cross- linking (Benita, 1996, Gouin, 2004). Tuy nhiên ph−ơng pháp sấy phun cũng có nh−ợc điểm của nó. Vì n−ớc là dung môi đ−ợc −a dùng nhất nên số l−ợng vật liệu vỏ đ−ợc chọn rất hạn chế do nó phải tan trong n−ớc và có nhiều chất khi tan trong n−ớc tạo thành dung dịch có độ nhớt cao không thể phun đ−ợc. Một hạn chế khác của ph−ơng pháp là tỷ lệ nhân/vi nang thấp (20-30%). Một vấn đề khác là chất cần bao nang vẫn nằm tự do trên bề mặt vi nang do n−ớc bốc hơi rất 32 nhanh trong buồng sấy. Nh−ợc điểm này sẽ càng rõ nếu tỉ lệ chất nhân/vật liệu vỏ tăng. Đó là điều không mong muốn vì các chất thơm dễ bị oxy hoá và dễ mất mùi, vị. Ngoài ra cần l−u ý rằng các chất có điểm sôi thấp hay ít tan trong n−ớc có thể bị bay hơi trong quá trình sấy. Mặc dù có một số nh−ợc điểm nh− vậy nh−ng sấy phun vẫn đ−ợc coi là ph−ơng pháp thông dụng nhất để tạo vi nang cho chất thơm (Benita, 1996). Bảng 1.1.2. Các nguyên vật liệu đ−ợc sử dụng làm chất bao trong công nghệ vi nang hoá Tên chất hữu cơ Tên nguyên vật liệu Carbonhydrates Tinh bột, maltodextrins, xiro ngô, dextran, cyclodextris, đ−ờng kính. Celluloces Carboxyl methylcellulose (CMC), methylcellulose, ethylcellulose, nitrocellulose, acetylcellulose, cellulose acetate-phthalate, cellulose acetate-butylate-phthalate. Gums Gum acacia, agar, sodium alginate, carrageenan, xanthan gum. Lipids Wax, paraffin, beeswax, tristearic acid, diglycerides, monoglycerides, oils, fats, hardened oils. Proteins Gluten, casein, gelatin, albumin, hemoglobin 1.2. giớI thiệu về chất hoạt động bề mặt sinh học glycolipit mannosylerythritol lipit (MELs ). 1.2.1. Phân loại chất bề mặt sinh học có nguồn gốc vi sinh. Chất hoạt động bề mặt là chất có khả năng làm giảm sức căng bề mặt giữa các pha lỏng/lỏng, lỏng/rắn và lỏng/khí do vậy chúng cho phép các cấu phần của các pha hoà trộn và phân phối đồng đều trong nhau. Không giống các chất bề mặt sản xuất bằng con đ−ờng hoá học đ−ợc phân loại theo các nhóm phân cực, các chất bề mặt sinh học đ−ợc phân loại theo thành phần hoá học và nguồn gốc vi sinh. Cấu trúc của các chất bề mặt sinh học bao gồm phần −a n−ớc đ−ợc cấu tạo từ axit amin hoặc peptit mang điện cation học anion, đ−ờng đơn, đôi hoặc polysaccharit và phần kỵ n−ớc đ−ợc cấu tạo từ axit béo bão hoà hoặc không bão hoà. Do vậy các lớp chính của chất bề mặt sinh học là glycolipit, lipopeptit, và lipoprotein, phospholipit và axit béo, lipit trung tính và photpholipit, các chất bề mặt polyme và chất bề mặt dạng hạt. Mặc dầu có nhiều báo cáo nói về sự sinh tổng hợp chất bề mặt bởi vi sinh vật phân giải các hydrocacbon, nh−ng cũng có những nguồn tài liệu nói đến sự sinh tổng hợp chất 33 bề mặt từ các chất hoà tan đ−ợc trong n−ớc nh− đ−ờng glucoza, sucroza, glycerol, hoặc ethanol (Cooper và Goldenberg, 1987; Guerra- Santos và cs, 1986; Hommel và cs, 1994; Palejwala và Desai, 1989; Passeri, 1992). Những −u thế của các chất bề mặt sinh học so với các chất bề mặt tổng hợp hoá học là xuất phát từ tự nhiên, chịu sự phân huỷ sinh học, có tính năng hoạt động tốt hơn ở dải pH và nhiệt độ rộng, đa dạng và không có tính độc. Do vậy chất hoạt động bề mặt sinh học có nhiều ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau. 1.2.1.1. Glycolipit. Đa số những chất hoạt động bề mặt đ−ợc biết đến là glycolipit. Glycolipit đ−ợc vi sinh vật thuộc tất cả các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc sinh tổng hợp. Các vi sinh vật này có khả năng chuyển hoá cacbonhydrat, n-alkan (C10- C20), chất béo (C10- C22) thành glycolipit, những nguồn cacbon này có thể sử dụng riêng lẻ hoặc dùng kết hợp với nhau. Những glycolipit đ−ợc biết đến nhiều nhất là rhamnozalipit, trehalozalipit và sophozalipit (Bảng 1..2.1. và Hình 1.2.1.). Rhamnozalipit: Ramnozalipit là glucolipit đ−ợc nghiên cứu nhiều nhất. Khi có một hoặc hai phân tử của rhamnoza liên kết với một hoặc hai phân tử axit β-hydroxyldecanoic. Sản xuất rhamnoza chứa glucolipit từ Pseudomonas.sp đ−ợc Javis và Joshnon mô tả đầu tiên (Javis và Joshnson, 1949). Từ đó có các dạng của ramnozalipit: +Ramnozalipit1:L-Ramnoza-L-Ramnoza-β-hydroxydecanoic-β-hydroxydecanoic. +Rhamnozalipit2: L-rhamnosyl-β-hydroxydecanoic-β-hydroxydecanoic + Ramnozalipit 3: β-hydroxydecanoic-β-rhamnoza + Ramnozalipit 4: β-hydroxydecanoic-L-Rhamnoza-L-Rhamnoza Bảng1.21. a. Nguồn vi sinh vật và đặc tính của các vi sinh vật quan trọng Glucolipit Vi sinh vật Sức căng bề mặt (mN/m) Sức căng mặt phân cắt (mN/m) Rhamnozalipit Pseudomonas eruginosa 29 0,25 Pseudomonas.sp 25-30 1 R.erythropolis 32-36 14-17 N.erythropolis 30 3,5 Trehalozalipit Mycrobacterium.sp 38 1,5 T.bombicola 33 1,8 Sophozalipit T.apicola 30 0,9 T.petrophilum 34 Trehalozalipit: Disacarit trehaloza đ−ợc liên kết bởi C6 và C6’ tới axit mycolic sinh chuyển hoá bằng những chủng Mycobacterium, Nocardia và Corynebacterium. Trehaloza dimycolate đ−ợc sản xuất từ Rhodococcus đ−ợc nghiên cứu rộng rãi, R.erythropolis còn tổng hợp ra lipit, trehaloza, anionic. Trehalozalipit từ R.erythropolis và Athrobacter sp. làm giảm sức căng bề mặt và mặt phân cắt trong dịch nuôi cấy sinh vật từ 25 - 40 và từ 1-5mN/m. Sophozalipit: Sophozalipit đ−ợc sản xuất chủ yếu từ các chủng nấm men: Torulopsis bombicola, T.petrophilum và T.apicola. Sophozalipit gồm cacbonhydrat và liên kết với chuỗi hydroxyaxit béo. Chất hoạt động bề mặt sinh học này là sự pha trộn của ít nhất 6-9 sophoza −a n−ớc khác nhau. Chủng C.bogoriensis sản xuất ra glucolipit trong đó sophoza liên kết với docosanoic axit diacetate. Sophozalipt đ−ợc sản xuất từ T.petrophilum trên cơ chất không hoà tan với n−ớc nh− alkan hay dầu thực vật. Hiện nay, Công ty Kao Chermicalcoopertion ở Hàn Quốc đang sử dụng Sophoroselipit làm chất tạo ẩm cho hãng mỹ phẩm tên hiệu Sofina. Glucolipit có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của n−ớc từ 72m/v/m tới giá trị trong khoảng từ 25-45m/v/m. Bảng1.2.1.b. ảnh h−ởng của Glycolipit thô đối với sức căng bề mặt của n−ớc Glucolipit Sức căng bề mặt tối thiểu (mN/m) Lactonic sophozalipit 35 Dodecyl sophoza 30 MELs 28 Trehalozalipit 26 Rhamnozalipit 25 Nhũ t−ơng 44 35 Hình 1.2.1. Cấu trúc một số glycolipit a- rhamnozalipit , b- của Trehalozalipi, c-Sophozalipit, d- Mannosylerithritol lipit O R2O R3O R4OCH2 OR1 H O OH OH OH R1, R2 = Fatty acids MEL A: R3, R4 = Acetyl MEL AB: R3= H, R4= Acetyl MEL B: R3= Acetyl, R4=H MEL D: structure not elucidated a b c d 36 1.2.1.2 Lipopeptit và lipoprotein. Một số l−ợng lớn lipopeptit dạng mạch vòng bao gồm cả các kháng sinh decapeptit (gramicidin) và kháng sinh lipopeptit (polymyxin) đ−ợc sản xuất bởi Bacillus brevis và B. polymyxa (Suzuki và cs, 1965) có hoạt tính bề mặt. Lipit có chứa ornithine từ P. rubescens và Thiobacillus thioxidans, hoặc cerilipin – lipit có chứa ornithine- và taurine- từ Gluconobacter cerinus IFO 3267, lipit có chứa lysine từ Agrobacterium tumefaciens IFO 3058 có thể hiện hoạt tính bề mặt rât mạnh. Aminolipit từ Serratia marcescens NS 38 có tên là serratamolide có khả năng làm tăng tính −a n−ớc của tế bào bằng cách ngăn chặn những vị trí kỵ n−ớc trên thành tế bào. Lipopeptit surfactin mạch vòng từ B.subtilis ATCC 21332 là một trong những chất hoạt động bề mặt mạnh nhất. Nó có thể làm giảm sức căng bề mặt từ 72 đến 27.9 mN/m tại nồng độ 0.005%. Chất bề mặt BL-86 từ chủng B. licheniformis 86 có khả năng giảm sức căng bề mặt xuồng 27mN/m, ngoài ra còn có khả năng làm vỡ tế bào hồng cầu của động vật có vú tạo spheroplast, đặc tính này đ−ợc sử dụng để phát hiện việc sinh ra surfactin qua sự hemolysis trên môi tr−ờng blood agar 1.2.1. 3. Axit béo, photpholipit và lipit trung tính . Một số vi khuẩn và nấm men sản xuất ra một l−ợng lớn axit béo và photpholipit bề mặt khi nuôi trên môi tr−ờng có n-alkanes (Cirigliano và Carman, 1984; Cooper và cs, 1978). Chủng vi khuẩn Acinetobacter sp. HO1-N sinh phophatidylethanolamine, tạo thành hạt nhũ t−ơng rất rõ trong hệ dịch alkane trong n−ớc. Một số chủng Aspergillus spp., Thiobacillus thiooxidans, Arthobacter AK-19, P. aeroginosa 44T1 có khả tạo ra 40- 80% (w/w) lipit loại này khi nuôi trên môi tr−ờng có hexandexan hoặc dầu o-liu t−ơng ứng. Phophatidylethanolamine của chủng Rhodococcus erythropolis có khả năng làm giảm sức căng giữa pha của hệ n−ớc và hexandecan đến d−ới 1mN/m và CMC có giá trị là 30mg/L (Kretschmer và cs, 1982). 1.2.1.4. Chất bề mặt sinh học polymer. Những điển hình về chất bề mặt sinh học polymer là emulsan, liposan, mannoprotein và phức chất polysaccharide – protein. Chủng Acinetobacter calcoaceticus RAG-1 sinh ra chất nhũ t−ơng hoá sinh học emulsan có cấu tạo polysaccharide dị hình đa anion, trong đó axit béo đ−ợc gắn trên sống mạch polysaccharide dị hình bởi mối liên kết o- ester ( Rosenberg và cs, 1988). Emulsan là chất gây nhũ t−ơng hữu hiệu hydrocarbon trong n−ớc tại nồng độ 0.001-0.01%. Đây là một trong chất ổn định nhũ t−ơng mạnh nhất đ−ợc biết đến hiện nay, thậm chí nay cả khi tỷ lệ n−ớc- dầu là 1:4. Các polymer chất bề mặt sinh học khác đ−ợc biết là biospersan đ−ợc sản xuât bởi A. calcoaceticus A2, alasan- một loại polysaccharide dị hình có tính anion có chứa alanin đ−ợc sinh ra bởi A. radioresistens KA-53. Lyposan là chất nhũ t−ơng hoá tan trong n−ớc sinh ra bởi Candida lipolytica (Cirigliano và Carman, 1984) có thành phần 17% protein và 83% cacbonhydrat (polysaccharide dị hình cấu tạo từ glucoza, galatoza, galactosamine và axit galacturonic). 37 Sar và Rosenberg chứng minh rằng một mình polysaccharide không có khả năng nhũ t−ơng hoá, nh−ng khi kết hợp với một số protein sinh ra trong quá trình phát triển trên ethanol thì tạo ra chất nhũ t−ơng hoá rất hiệu quả (Sar và Rosenberg, 1983). Những chất bề mặt sinh học polymer khác đ−ợc biết đến là mannoprotein từ Saccharomyces cerevisiae (Cameron và cs, 1988), phức chất mannan-protein từ Candida tropicalis (Kappeli et al., 1984), peptidoglycolipid từ P. aeroginosa P-20 (Koronelli và cs , 1983). 1.2.1.5. Chất bề mặt sinh học dạng hạt. Một số tế bào vi sinh vật khi sử dụng alkan có khả năng hình thành các túi ngoại bào dạng màng ngăn cách hydrocacbon để tạo vi huyền phù. Các túi do Acinetobacter sp. HO1-N với kích th−ớc 20-50nm đ−ợc cấu tạo từ protein, photpholipit và liposaccharide (Kappeli và Finnerty, 1979). Các túi dạng màng này chứa gấp 5 lần phopholipit và khoảng 350 lần polysaccharide so với màng tế bào của vi sinh vật cùng loại. Chất bề mặt sinh học dạng hạt này có vai trò phân giải hydrocacbon. Ngoài ra một số vi sinh vật khác nh− vi sinh vật gây bệnh có một số thành phần trên bề mặt tế bào cũng đựơc coi nh− chất bề mặt sinh học dạng hạt nh− M protein và axit lipoteichoic của nhóm streptococci A, protein A của Staphylococcus aureus, lớp A của Aeromonas salmonicida, prodigiosin của Seratia spp., hoặc gramicidin trong bào tử Bacillus brevis, diềm tua mỏng trong tr−ờng hợp của A. calcoaceticus RAG-1 (Banat và cs, 2000). 1.2.2. Quá trình sinh tổng hợp chuyển hoá tạo glycolipit. 1.2.2.1. Các cơ chế vi sinh vật sản xuất glycolipit. Cơ chế sinh tổng hợp các chất này bao gồm cả quá trình sinh tổng hợp mới và chuyển hoá từ các chất tiền tố. Một số vi sinh vật có khả năng chuyển cacbonhydrat, n-alkan từ C10-C20 và triglyxerit (các axit béo) từ C10- C22 thành glycolipit. Nguồn cacbon có thể sử dụng riêng biệt hoặc kết hợp với một loại khác. Con đ−ờng sinh tổng hợp này bao gồm sự phân giải và tổng hợp mới các loại đ−ờng, lipit hoặc theo h−ớng kết hợp lại, kéo dài hoặc biến đổi các tiền tố. Glycolipit đ−ợc tạo thành bằng hai ph−ơng pháp: tổng hợp sinh học (biosynthetic) và chuyển hoá sinh học (biotransformation). Tuy nhiên ph−ơng pháp chuyển hoá sinh học là ph−ơng pháp chính trong công nghiệp để tổng hợp glucolipit, vì cho năng suất cao hơn ph−ơng pháp tổng hợp sinh học. Quá trình tế bào vi sinh vật sản xuất ra glucolipit có thể xảy ra trong các pha sinh tr−ởng, pha bão hoà hoặc pha nghỉ của tế bào (Lang và Wagner, 1987). 1.2.2.1.1. Ph−ơng pháp tổng hợp sinh học (Biosynthetic). Trong cấu trúc của glucolipit có chứa một nửa là −a n−ớc và một nửa là kị n−ớc. Nửa kị n−ớc có thể là chuỗi hydroxy axit béo hoặc α-alkyl-β-hydroxy axit béo và một nửa −a 38 n−ớc cacbonhydrat, cacboxylic axít photphat, axit amin, chuỗi peptit hoặc alcol. Chính vì thế đặc điểm chung của việc tổng hợp này là sinh tổng hợp cho nửa −a n−ớc và nửa kị n−ớc (Hommel và cs, 1994; Syldatk và cs, 1987). Theo Syldatk và cs (1987) thì việc tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học có thể tóm tắt nh− sau: Nửa −a n−ớc và nửa là kị n−ớc đ−ợc tổng hợp bằng hai con đ−ờng độc lập: - Nửa kị n−ớc phụ thuộc vào nguồn cơ chất. - Nửa −a n−ớc phụ thuộc vào nguồn cơ chất. - Sự tổng hợp nửa −a n−ớc và nửa kị n−ớc dựa trên cơ sở phụ thuộc lẫn nhau. 1.2.2.1.2. Ph−ơng pháp chuyển hoá sinh học (Biotransformation) Ph−ơng pháp sinh chuyển hoá để sản xuất chất hoạt động bề mặt đ−ợc phát triển trong những năm gầm đây. Nguyên tắc của ph−ơng pháp này dựa trên sự gần về cấu trúc giữa các este của đ−ờng, các chất hoạt động bề mặt th−ơng mại (đã có trên thị tr−ờng) và chất hoạt động bề mặt sinh học. Ng−ời ta đã tiến hành sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học bằng cách lên men vi sinh để sản xuất riêng rẽ phần −a n−ớc và kỵ n−ớc. Sau đó tiến hành phản ứng ezim đặc hiệu để nối hai phần này lại với nhau. Thông th−ờng những phản ứng này diễn ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình th−ờng. Cách chuyển hoá đơn giản nhất là sử dụng chủng nấm men đ−ợc lựa chọn để tăng chất l−ợng dầu, để thay đổi cấu trúc thành phần axit béo (làm no hoá hoặc tạo liên kết không no). 70% vịêc sản xuất axit béo có cấu trúc nhất định đ−ợc thực hiện bởi ph−ơng pháp chuyển hoá n-alkan thành α, ω-axit dionic (bằng chủng nấm men Candida tropicalis), thành arachidonic và eicosapentanoic (bằng Mortierella elongata IS-4 và M.alpina), chuyển hoá axit oleic thành recinoleic (bằng vi khuẩn đất BMD-120). Mặc dù, liên quan đến quá trình sinh chuyển hoá chất hoạt động bề mặt sinh học nh−ng lipaza và phospholipaza quan trọng nhất vì đ−ợc thực hiện cả phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu. Nhiều tác giả đã nghiên