Báo cáo Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối ưu hoá các điều kiện phân tích một số acid amin trong cá

Bộ y tế Viện dinh d−ỡng ===== ===== Báo cáo nghiệm thu đề tài nghiên cứu cấp Viện Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối −u hoá các điều kiện phân tích một số acid amin trong cá Cơ sở quản lý: Cấp cơ sở Chủ nhiệm đề tài: Thạc sỹ Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện: Khoa Hóa - ATVSTP 5750 05/4/2006 Hà Nội, tháng 12 - 2005 I. Đặt vấn đề Acid amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Acid amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virut. Acid amin là một phần của ezim và hệ thống hocmon. Nó tạo nên ARN (acid ribo nucleic), AND (acid deoxi nucleic) vận chuyển oxi đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ. Acid amin đ−ợc cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm dầu protein. Protein khi vào cơ thể đ−ợc chuyển hoá thành 22 acid amin, trong đó có 8 acid amin thiết yếu không đ−ợc tạo ra từ cơ thể, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyllalanine, threonine, tryptophan và valine. Sự thiếu hụt acid amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đ−ờng huyết, dị ứng [9]. Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số l−ợng chất đạm có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số l−ợng và tỷ lệ cân đối các acid amin, nghĩa là chất l−ợng của protein thức ăn. Ngoài ra đối với các n−ớc đang trên đà phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất l−ợng tốt còn ch−a đủ, thì việc phân tích các acid amin cần thiết trong thức ăn thực vật lại càng cần thiết. Nó giúp ta ph−ơng h−ớng phối hợp các thức ăn với nhau để nâng cao chất l−ợng của protein trong khẩu phần. Vì vậy xác định các acid amin trong thực phẩm là rất cần thiết. Sự cần thiết của protein với cơ thể ng−ời đã đ−ợc nghiên cứu hàng thập kỷ qua. Nhu cầu protein và acid amin cần thiết cho cơ thể đ−ợc công bố đầu tiên vào năm 1973 và liên tục đ−ợc bổ sung vào năm 1975 và sau đó là 1977 bởi FAO (Tổ chức l−ơng thực và thực phẩm thế giới), WHO (Tổ chức Y tế thế giới) và NRC (Hội đồng nghiên cứu quốc tế) [5]. Để liên tục có đ−ợc các công bố về nhu cầu protein và acid amin cho cơ thể từ lâu trên thế giới đã áp dụng nhiều ph−ơng pháp phân tích hàm l−ợng protein và acid amin trong thực phẩm nh−: sắc ký giấy, sắc ký lỏng, sắc ký khí, định l−ợng vi sinh, quy trình ngày càng hoàn thiện và đ−ợc áp dụng nhiều kỹ thuật mới. 1 II. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. Tìm các điều kiện tối −u để phân tích acid amin trong cá bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng cao áp. 2.2. áp dụng và ổn định ph−ơng pháp phân tích một số acid amin trên 5 loại cá n−ớc biển và 5 loại cá n−ớc ngọt thông dụng trên thị tr−ờng phục vụ cho khảo sát nguồn thực phẩm dầu acid amin, đặc biệt trong cá của Việt Nam. III. Ph−ơng pháp nghiên cứu 3.1. Hoá chất thuốc thử Tất cả các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại hoá chất tinh khiết phân tích. Acetonitril, natri borat, acid clohydric của hãng Merk (Đức), chất dẫn suất 6-aminoquinoline, hỗn hợp chuẩn 17 acid amin của hãng Waters (Mỹ), chất chuẩn đơn từng acid amin của hãng Prolabo (Pháp). 3.2. Hệ thống sắc ký lỏng Hệ thống sắc ký lỏng đ−ợc sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là hệ thống acid amin với các detector PAD 2996, huỳnh quang 2475 và bộ bơm mẫu tự động của hãng Water (Mỹ). Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water. Thành phần pha động gồm đệm borat, acetonitril, n−ớc cất tinh khiết chạy theo gradie. Tốc độ dòng là 1ml/phút và nhiệt độ cột là 35oC. Các acid amin đ−ợc định l−ợng bằng detector huỳnh quang với b−ớc sóng kích thích 340nm và b−ớc sóng phát xạ 450nm. 3.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn Chuẩn hỗn hợp (17 acid amin) đ−ợc pha từ dung dịch có chứa 2,5 mmol/àl cho tất cả các amino acid và 1,25 mmol/àl đối với cystine trong HCl 20 mmol để đ−ợc dung dịch chuẩn làm việc có chứa 100pmol/àl đối với 17 acid amin và 50 pmol/àl đối với cystein. Dung dịch chuẩn làm việc đ−ợc bảo quản trong lọ màu sẫm bảo quản bằng tủ lạnh âm sâu -200C dùng đ−ợc trong vòng 1 tháng. Các chuẩn đơn đ−ợc hoà tan trong n−ớc và bảo quản trong môi tr−ờng acid với các điều kiện t−ơng tự nh− chuẩn hỗn hợp. 3.4. Chuẩn bị mẫu cá 2 Mẫu nghiên cứu gồm 10 loại cá đại diện cho 50 mẫu cá: 5 loại cá n−ớc ngọt (trắm, trôi, cá quả, rofi, chép); 5 loại cá n−ớc mặn (thu, nục, cá chim trắng, cá hồng, cá cam). Mẫu đ−ợc lấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại 5 chợ lớn tại Hà Nội, mỗi mẫu mua ít nhất 3 con, đ−a về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá hai giờ. ở phòng thí nghiệm mẫu đ−ợc phân loại, lọc lấy phần ăn đ−ợc (loại bỏ phủ tạng, vẩy, vây, x−ơng), sau đó mẫu đ−ợc xay nhiễn, làm đồng nhất và tiến hành thuỷ phân ngay trong ngày lấy mẫu, phần mẫu l−u cho vào hộp sạch bảo quản trong tủ lạnh âm sâu -20oC. 3.5. Thuỷ phân mẫu Theo một số tác giả [3, 4, 7] ph−ơng pháp chủ yếu dùng để thuỷ phân tách các acid min ra khỏi thực phẩm là thuỷ phân trong môi tr−ờng acid clohydric có nồng độ cao. Quy trình thuỷ phân và phân tích mẫu nh− sau: Loại không khí bằng nitơ, hàn kín ống Tạo dẫn suất Xác định bằng sắc ký lỏng pha ng−ợc, Detector huỳnh quang và PDA Định mức bằng HCl 20 mmol Để nguội, đuổi HCl d− trong môi tr−ờng chân không ủ ở nhiệt độ thích hợp 125oC Cho vào ống nghiệm thành dày + HCL 15% Cân chính xác 1g mẫu đã xử lý 3 IV. Kết quả và bàn luận 4.1. Khảo sát các điều kiện phân tích 4.1.1. Khảo sát các loại dẫn suất acid amin Để xác định đ−ợc một số acid amin trong thực phẩm dựa trên những điều kiện thí nghiệm sẵn có của phòng thí nghiệm Viện Dinh d−ỡng, chúng tôi đã tiến hành dẫn suất các acid amin chuẩn bằng OPA (ortho-phtalaldehyt) [hình 1] và dẫn suất bằng AMQ (6-aminoquinolin) [hình 2], qua khảo sát chúng tôi thấy dẫn suất bằng OPA chỉ tách đ−ợc 15 acid amin, còn dẫn suất bằng AMQ tách đ−ợc 17 acid amin và NH3 với độ ổn định cao, nên trong nghiên cứu chúng tôi chỉ tiến hành dẫn suất bằng AMQ. Hình 1: Tách 15 acid amin bằng dẫn suất OPA Hình 2: Tách 17 acid amin bằng dẫn suất AMQ 4.1.2. Khảo sát các điều kiện trên sắc ký lỏng Để thực hiện một trong những nhiệm vụ quan trọng nhất của đề tài là tách và xác định đ−ợc acid amin, kỹ thuật đ−ợc lựa chọn là HPLC. Kỹ thuật 4 này đang là những kỹ thuật đ−ợc phát triển nhất hiện nay trên thế giới có hiệu quả tách cao, độ chính xác cao cũng nh− có thể tự động hoá đ−ợc trong tr−ờng hợp phân tích hàng loạt. Trong kỹ thuật HPLC ba vấn đề lớn cần tối −u hoá là: • Chọn cột tách: sử dụng cột pha ng−ợc. Cột sắc ký sử dụng là Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5àm) và cột Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5àm) của hãng Water. Qua kết quả chạy thử mẫu chuẩn cho thấy pic chạy ra với cột Symmetry Shield RP18 không tách đ−ợc các acid amin nên chúng tôi chọn cột Symmetry acid amin RP18 để tiến hành phân tích mẫu. • Nghiên cứu tối −u hoá pha động. Sau khi đã tham khảo các tài liệu và chạy thử, pha động chúng tôi lựa chọn là đệm borat, acetonitril, n−ớc với tỉ lệ chạy theo bảng gradien nh− sau: Bảng 1: Tỷ lệ thành phần pha động Thời gian (Phút) Tốc độ dòng (ml/phút) % Borat % Acetonitril % H2O Nền 1,0 100 0 0 0,5 1,0 99 1 0 18,0 1,0 95 5 0 19,0 1,0 91 9 0 29,5 1,0 83 17 0 33,0 1,0 0 60 40 36,0 1,0 100 0 0 65,0 1,0 0 60 40 100,0 1,0 0 60 40 • Detector: Sử dụng detector PDA và huỳnh quang là hai loại detector phổ biến, có độ nhạy cao. Qua khảo sát độ phát hiện của các acid amin bằng detecto huỳnh quang nhạy hơn nhiều so với detector PAD, nên chúng tôi chọn sử dụng detector PAD để định tính (kiểm tra lại từng dạng phổ của từng pic acid amin đơn lẻ) còn để định l−ợng chúng tôi sử dụng detector huỳnh quang với b−ớc sóng kích thích 340nm và b−ớc sóng phát xạ 450nm. 4.1.3. Các điều kiện thuỷ phân mẫu Để thuỷ phân các sản phẩm chứa acid amin có nhiều ph−ơng pháp, tuỳ theo đặc tính của từng mẫu thử, tuỳ theo mục đích định tính hay định l−ợng. 5 + Thuỷ phân bằng acid + Thuỷ phân bằng kiềm + Thuỷ phân bằng acid mạnh có mặt chất trao đổi ion + Thuỷ phân bằng men. Trong đề tài nghiên cứu này, của chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp thuỷ phân bằng acid. Trong quá trình thuỷ phân, yếu tố ảnh h−ởng nhiều nhất đến kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thuỷ phân và thời gian thuỷ phân. * Khảo sát nhiệt độ ảnh h−ởng đến quá trình thuỷ phân: + Chuẩn bị dung dịch để khảo sát: Chuẩn bị một hỗn hợp chuẩn các acid amin (gồm 17 loại acid amin) bao gồm bảy dung dịch chuẩn có cùng nồng độ; với nền là một loại cá: 7 mẫu cá không thêm chuẩn và 7 mẫu cá thêm chuẩn. + Tiến hành khảo sát: Để khảo sát nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân acid amin chúng tôi khảo sát trên một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn acid amin và mẫu cá đ−ợc thêm chuẩn nh− nhau, môi tr−ờng HCl 6N, nh−ng nhiệt độ thuỷ phân khác nhau (110, 115, 120, 125, 130, 135, 140oC) sau mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau mẫu đ−ợc đem đo. Theo khảo sát của chúng tôi, nhiệt độ có ảnh h−ởng rõ rệt đến quá trình thuỷ phân mẫu. Không chỉ ảnh h−ởng đến hiệu suất thu hồi (Kết quả khảo sát yếu tố này đ−ợc trình bầy ở bảng 2). Với điều kiện nhiệt độ ch−a đủ để phá vỡ các chuỗi peptit thì chúng ta còn không thể tách đ−ợc riêng biệt từng acid amin (ví dụ hình 3). Hình 3: ảnh h−ởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin 6 Bảng 2: ảnh h−ởng của nhiệt độ đến hiệu suất thuỷ phân của acid amin (Lysine) trong cá Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7 Nhiệt độ (oC) 110 115 120 125 130 135 140 Hàm l−ợng biết tr−ớc (àg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 Hàm l−ợng tính đ−ợc (àg/ml) 4,0946 4,532 5,3170 5,3008 5,2799 5,2997 5,3093 Hiệu suất 76,58 84,76 99,45 99,14 98,75 99,12 99,32 Kết quả bảng 2 cho thấy nhiệt độ từ 120OC hiệu suất phản ứng đã đạt đ−ợc là cao nhất. Nên chúng tôi chọn 125OC để làm nhiệt độ thuỷ phân mẫu. * Khảo sát thời gian ảnh h−ởng đến quá trình thuỷ phân: Để khảo sát ảnh h−ởng của thời gian đến khả năng thuỷ phân acid amin, chúng tôi khảo sát trên một dãy chuẩn acid amin và mẫu cá đ−ợc thêm chuẩn nh− nhau, môi tr−ờng HCl 6N, nhiệt độ thuỷ phân nh− nhau 125oC, nh−ng thời gian thuỷ phân khác nhau (16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 giờ). Kết quả khảo sát chỉ ra ở bảng 3. Bảng 3: ảnh h−ởng của thời gian thuỷ phân đến hiệu suất thuỷ phân của acid amin (Lysine) trong cá. 7 Các điều kiện 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (giờ) 16 18 20 22 24 26 28 Hàm l−ợng biết tr−ớc (àg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 Hàm l−ợng tính đ−ợc (àg/ml) 5,859 4,365 4,685 5,312 5,3083 5,3152 5,2938 Hiệu suất 109,58 81,64 87,63 99,35 99,28 99,41 99,01 Kết quả bảng 3 cho thấy thời gian thuỷ phân 22 giờ trở lên hiệu suất phản ứng thu đ−ợc là tốt nhất. Chúng tôi đã chọn 24 giờ để tiến hành thuỷ phân mẫu. Khi thời gian thuỷ phân ch−a đủ, các acid amin trong mẫu cũng không tách đ−ợc ra khỏi nhau (ví dụ hình 4). Hình 4: ảnh h−ởng của nhiệt độ thuỷ phân đến tách các acid amin 4.2. Đánh giá ph−ơng pháp 4.2.1. Xác định khoảng tuyến tính Để tiến hành xác định khoảng tuyến tính của ph−ơng pháp phân tích, chúng tôi pha một dãy chuẩn có nồng độ từ 0,1 đến 100(àg/ml) cho 17 acid amin, từ 0,05 đến 50(àg/ml) đối cystine và tiến hành đo cho tất cả các acid amin. Kết quả cho thấy đồ thị tuyến tính trong khoảng 0,5 đến 100 (àg/ml) cho 17 acid amin, còn 0,1 đến 50(àg/ml) đối cystine với hệ số t−ơng quan đạt đ−ợc từ 0,997 đến 0,9998 cho tất cả các acid amin. 4.2.2. Độ lặp lại của ph−ơng pháp 8 Để khảo sát độ lặp lại của ph−ơng pháp, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm trên 2 loại cá. Mỗi loại cá tiến hành phân tích trên 6 mẫu. 1 )( 1 2 2 − − = ∑ = n mtbmi S n i Độ lệch chuẩn đ−ợc tính theo công thức sau: Độ lệch chuẩn t−ơng đối đ−ợc tính theo công thức sau: RSD = s*100/XTB 9 Bảng 4: Kết quả về độ lặp lại hàm l−ợng trong mẫu cá quả Các thông số 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD Các acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 0,721 0,693 0,724 0,695 0,737 0,742 6 0,719 0,021 2,878 Serine 0,795 0,774 0,786 0,772 0,783 0,799 6 0,785 0,011 1,387 Glutamic acid 1,234 1,425 1,243 1,229 1,354 1,343 6 1,305 0,081 6,219 Glycine 1,860 1,778 1,693 1,689 1,723 1,892 6 1,772 0,087 4,892 Histidine 0,656 0,697 0,621 0,637 0,656 0,672 6 0,657 0,027 4,042 NH3 0,865 0,835 0,856 0,821 0,862 0,821 6 0,843 0,020 2,398 Arginine 1,870 1,875 1,912 1,923 1,869 1,924 6 1,896 0,027 1,418 Threonine 0,873 0,829 0,859 0,875 0,864 0,862 6 0,860 0,017 1,928 Alanine 0,628 0,597 0,625 0,598 0,635 0,673 6 0,626 0,028 4,473 Proline 0,734 0,742 0,753 0,768 0,759 0,762 6 0,753 0,013 1,705 Cysteine 0,239 0,251 0,245 0,249 0,251 0,246 6 0,247 0,005 1,855 Tyrosine 0,939 0,927 0,896 0,917 0,879 0,953 6 0,919 0,027 2,982 Valine 0,453 0,397 0,512 0,437 0,456 0,473 6 0,455 0,038 8,384 Methionine 0,672 0,712 0,689 0,702 0,705 0,691 6 0,695 0,014 2,053 Lysine 0,298 0,321 0,297 0,352 0,319 0,327 6 0,319 0,020 6,375 Isoleucine 0,421 0,398 0,425 0,396 0,431 0,433 6 0,417 0,016 3,913 Leucine 0,842 0,839 0,843 0,851 0,799 0,798 6 0,829 0,024 2,860 Phenylalanine 1,256 1,227 1,123 1,214 1,125 1,121 6 1,178 0,061 5,216 Bảng 5: Kết quả độ lặp lại thời gian l−u trong mẫu cá quả Các thông số 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD Các acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 13,819 13,691 13,634 13,747 13,661 13,652 6 13,70 0,070 0,510 Serine 15,336 15,144 15,109 15,262 15,12 15,123 6 15,18 0,094 0,621 Glutamic acid 16,177 16,356 15,931 16,111 15,935 15,942 6 16,07 0,173 1,078 Glycine 17,470 17,219 17,199 17,395 17,194 17,221 6 17,28 0,121 0,700 Histidine 18,119 17,837 17,800 18,020 18,294 17,821 6 17,98 0,199 1,107 NH3 19,821 19,571 19,521 19,709 19,533 19,553 6 19,62 0,120 0,613 Arginine 21,184 21,09 21,08 21,153 21,085 21,092 6 21,11 0,044 0,209 Threonine 21,395 21,312 21,314 21,387 21,308 21,311 6 21,34 0,041 0,194 Alanine 22,022 21,932 21,923 21,982 21,928 21,931 6 21,95 0,040 0,182 Proline 23,346 23,253 23,229 23,275 23,250 23,263 6 23,27 0,041 0,175 Cysteine 26,467 26,634 26,600 26,467 26,647 26,652 6 26,58 0,088 0,330 Tyrosine 26,743 27,117 27,087 26,632 27,132 27,133 6 26,97 0,225 0,836 Valine 27,916 27,891 27,783 27,816 27,816 27,822 6 27,84 0,051 0,184 Methionine 28,466 28,351 28,333 28,366 28,368 28,372 6 28,38 0,046 0,164 Lysine 31,124 30,999 30,991 31,024 31,018 31,023 6 31,03 0,048 0,155 Isoleucine 31,951 31,82 31,818 31,854 31,842 31,845 6 31,86 0,049 0,154 Leucine 32,561 32,416 32,414 32,454 32,439 32,450 6 32,45 0,054 0,168 Phenylalanine 34,026 33,845 33,836 33,886 33,872 33,891 6 33,89 0,069 0,203 10 Bảng 6: Kết quả độ lặp lại hàm l−ợng đối với mẫu cá thu Các thông số 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD Các acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 0,926 0,918 0,897 0,889 0,918 0,931 6 0,913 0,017 1,816 Serine 0,865 0,859 0,837 0,871 0,902 0,856 6 0,865 0,021 2,483 Glutamic acid 1,652 1,598 1,701 1,689 1,634 1,657 6 1,655 0,037 2,257 Glycine 1,298 1,386 1,357 1,403 1,387 1,279 6 1,352 0,051 3,809 Histidine 1,125 0,987 1,131 0,989 0,984 1,024 6 1,040 0,070 6,704 NH3 0,122 0,109 0,123 0,115 0,128 0,132 6 0,122 0,008 6,920 Arginine 1,787 1,902 1,783 1,856 1,798 1,905 6 1,839 0,057 3,090 Threonine 1,105 1,231 1,304 1,098 1,159 1,236 6 1,189 0,082 6,878 Alanine 0,762 0,756 0,802 0,812 0,789 0,745 6 0,778 0,027 3,489 Proline 0,598 0,612 0,631 0,597 0,689 0,587 6 0,619 0,038 6,063 Cysteine 2,639 2,574 2,702 2,564 2,316 2,655 6 2,575 0,137 5,320 Tyrosine 0,112 0,131 0,135 0,132 0,121 0,121 6 0,125 0,009 7,004 Valine 0,658 0,678 0,598 0,654 0,702 0,579 6 0,645 0,047 7,324 Methionine 0,823 0,798 0,857 0,779 0,802 0,812 6 0,812 0,027 3,273 Lysine 0,546 0,498 0,578 0,581 0,605 0,535 6 0,557 0,038 6,908 Isoleucine 0,623 0,587 0,621 0,606 0,613 0,600 6 0,608 0,014 2,239 Leucine 1,116 1,206 1,215 1,033 1,234 1,158 6 1,160 0,076 6,528 Phenylalanine 1,322 1,302 1,401 1,189 1,298 1,325 6 1,306 0,068 5,239 Bảng 7: Kết quả độ lặp lại thời gian l−u đối với mẫu cá thu Các thông số 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD Các acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 13,717 13,626 13,793 13,76 13,768 13,692 6 13,73 0,061 0,445 Serine 15,184 15,089 15,275 15,212 15,241 15,345 6 15,22 0,087 0,569 Glutamic acid 16,012 15,902 16,116 16,074 16,076 15,937 6 16,02 0,085 0,531 Glycine 17,280 17,171 17,385 17,324 17,346 17,202 6 17,28 0,288 1,796 Histidine 17,904 17,79 18,026 17,954 17,979 17,820 6 17,91 0,732 4,448 NH3 19,622 19,52 19,73 19,682 19,688 19,554 6 19,63 0,622 3,446 Arginine 21,113 21,066 21,156 21,135 21,149 21,087 6 21,12 0,102 0,515 Threonine 21,336 21,288 21,379 21,348 21,368 21,311 6 21,34 0,263 1,344 Alanine 21,955 21,907 22,001 21,975 21,988 21,933 6 21,96 0,549 2,732 Proline 23,277 23,225 23,327 23,299 23,306 23,258 6 23,28 1,289 6,058 Cysteine 26,671 26,608 26,467 26,435 26,705 26,651 6 26,59 0,090 0,386 Tyrosine 27,156 27,094 26,735 26,706 27,191 27,134 6 27,00 0,374 1,598 Valine 27,849 27,78 27,914 27,883 27,882 27,821 6 27,85 0,243 0,943 Methionine 28,398 28,331 28,466 28,433 28,431 28,371 6 28,41 1,321 5,085 Lysine 31,05 30,98 31,129 31,633 31,089 31,021 6 31,15 0,362 1,175 Isoleucine 31,873 31,805 31,954 31,931 31,913 31,845 6 31,89 0,259 0,876 Leucine 32,475 32,401 32,563 32,500 32,519 32,445 6 32,48 0,481 1,615 Phenylalanine 33,920 33,828 34,025 33,650 33,970 33,842 6 33,87 0,847 0,257 11 4.2.3. Xác định độ thu hồi của ph−ơng pháp Dựa vào việc thêm mẫu chuẩn vào mẫu thực, cùng với việc tiến hành làm mẫu thực không có mẫu chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi nh− sau. M2 Độ thu hồi = ----------- x 100% M1 M1: acid amin (àg) biết tr−ớc (thêm vào). M2: acid amin (àg) xác định đ−ợc. Dựa vào đ−ờng chuẩn làm song song với mẫu thực chúng tôi thu đ−ợc kết quả của mẫu thêm chuẩn và đem so với giá trị cho vào, mỗi nồng độ làm 3 mẫu và lấy kết quả trung bình. Ta có kết quả ở bảng 8. Bảng 8: Độ thu hồi của Lysine trong mẫu cá quả Mẫu số 1 2 3 4 5 6 7 M1 ((àg) 0,2035 0,407 0,168 0,337 1,687 2,361 3,036 M2 (àg) 0,2084 0,4121 0,1695 0,3396 1,6953 2,3752 3,0574 Độ thu hồi (%) 97,63 98,76 99,12 99,23 99,51 99,4 99,3 Qua kết quả trên với hàm l−ợng Lysinee < 0,407mg/ml chúng tôi thu đ−ợc hiệu suất thu hồi thấp. Do đó có thể kết luận, ph−ơng pháp này cho phép xác định hàm l−ợng Lysinee từ 0,5(àg) trở lên. Nên khi tiến hành phân tích nên lấy l−ợng mẫu sao cho hàm l−ợng acid amin lớn hơn 0,5(àg) để có sai số thấp. 4.3. Kết quả phân tích 18 acid amin trên các loại cá Bảng 9 và bảng 10 thể hiện hàm l−ợng trung bình các acid amin trong mẫu cá n−ớc ngọt và cá n−ớc mặn n=5. Hình 5: Sắc đồ các acid amin trong mẫu cá quả 12 Bảng 9: Kết quả phân tích acid amin trong cá n−ớc ngọt (g/100g) TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá trôi Cá trắm Cá quả Cá rofi Cá chép 1 Aspartic acid ASP 0,00 0,28 0,72 1,05 0,75 2 Serine Ser 0,00 0,34 0,79 1,00 0,57 3 Glutamic acid Glu 0,38 0,52 1,30 1,85 1,30 4 Glycine Gly 0,00 0,58 1,77 1,83 1,07 5 Histidine His 0,24 0,36 0,66 0,86 0,52 6 NH3 NH3 0,07 0,04 0,84 0,12 0,10 7 Arginine Arg 1,31 0,83 1,90 2,09 1,20 8 Threonine Thr 0,70 0,43 0,86 1,12 0,66 9 Alanine Ala 0,26 0,25 0,63 0,84 0.59 10 Proline Pro 1,03 0,23 0,75 0,75 0,51 11 Cysteine Cys 1,69 0,00 0,25 2,50 1,40 12 Tyrosine Tyr 0,08 0,46 0,92 0,11 0,05 13 Valine Val 0,30 0,22 0,45 0,68 0,46 14 Methionine Met 0,44 0,29 0,70 0,83 0,50 15 Lysine Lys 0,11 0,16 0,32 0,58 0,52 16 Isoleucine lle 0,25 0,20 0,42 0,62 0,40 17 Leucine Leu 0,49 0,39 0,83 1,27 0,81 18 Phenylalanine Phe 0,84 0,52 1,18 1,42 0,77 Tổng 8,20 6,12 14,61 19,52 12,18 Kết quả tại Bảng 9 cho thấy, trong thành phần của cá có đủ các acid amin cần thiết cho cơ thể. Trong 5 loại cá n−ớc ngọt cá Rôfi cho thấy có tổng hàm l−ợng các acid amin cao nhất 19,52 g%, thấp nhất là cá trắm 6,12 g%. Trong cá trôi acid aspartic, Serine, Glycine, hàm l−ợng quá nhỏ không xác định đ−ợc. Hình 6: Sắc đồ các acid amin trong mẫu cá thu 13 Bảng 10: Kết quả phân tích acid amin trong cá n−ớc mặn (g/100g) TT Tên đầy đủ Viết tắt Cá thu Cá nục Cá chim trắng Cá hồng Cá cam 1 Aspartic acid ASP 0,91 1,00 0,77 0,97 0,81 2 Serine Ser 0,87 0,94 0,75 0,82 0,76 3 Glutamic acid Glu 1,66 1,71 1,40 1,67 1,35 4 Glycine Gly 1,35 1,40 1,40 1,08 1,36 5 Histidine His 1,04 2,18 0,65 0,05 1,05 6 NH3 NH3 0,12 0,13 0,09 0,12 0,11 7 Arginine Arg 1,84 1,99 1,72 1,62 1,63 8 Threonine Thr 1,19 1,14 0,88 0,89 0,90 9 Alanine Ala 0,78 0,78 0,65 0,68 0,68 10 Proline Pro 0,62 0,63 0,57 0,53 0,60 11 Cysteine Cys 2,58 3,03 0,17 2,22 2,19 12 Tyrosine Tyr 0,13 0,12 0,87 0,09 0,11 13 Valine Val 0,64 0,76 0,51 0,60 0,57 14 Methionine Met 0,81 0,92 0,62 0,70 0,72 15 Lysine Lys 0,56 0,54 0,44 0,60 0,46 16 Isoleucine Lle 0,61 0,66 0,46 0,54 0,50 17 Leucine Leu 1,16 1,27 0,94 1,10 0,99 18 Phenylalanine Phe 1,31 1,52 1,04 1,10 1,11 Tổng 18,20 20,74 13,94 15,40 15,89 Kết quả tại Bảng 10 cho thấy, hàm l−ợng tổng các acid amin trong cá 14 n−ớc mặn nằm trong khoảng 13-21g%, không có loại acid amin nào không xác định thấy. Trong 5 loại cá n−ớc mặn đ−ợc nghiên cứu, cá nục cho hàm l−ợng amino acid cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu 18,20 g%, thấp nhất là cá chim trắng 13,94 g%. So sánh bảng 2 với bảng 1 cho thấy hàm l−ợng amino acid trong cá n−ớc mặn cao hơn trong cá n−ớc ngọt. 15 V. Kết luận 5.1. Kết quả nghiên cứu đã lựa chọn đ−ợc các điều kiện phân tích phù hợp để định l−ợng các acid amin trong cá nh− sau: • Quy trình thuỷ phân sử dụng ph−ơng pháp thuỷ phân trong môi tr−ờng acid. • Chạy gradien với hỗn hợp dung môi là đệm borat:acetonitril:n−ớc. • Tốc độ dòng: 1ml/phút; nhiệt độ buồng cột 35OC. • Detector huỳnh quang với b−ớc sóng kích thích 340nm và b−ớc sóng phát xạ 450nm. 5.2. Hàm l−ợng các acid amin trong cá Qua kết quả phân tích acid amin trong 10 loại cá (5 loại n−ớc ngọt, 5 loại n−ớc mặn) cho thấy: Trong cá n−ớc ngọt hàm l−ợng tổng acid amin từ 6,12- 19,52 g/100g, cá Rôfi có tổng hàm l−ợng các acid amin cao nhất (19,52 g%), thấp nhất là cá trôi 8,2 g%. Hàm l−ợng tổng các acid amin trong cá n−ớc mặn nằm trong khoảng 13- 21g%, không có loại acid amin nào không xác định thấy. Cá nục cho hàm l−ợng acid amin cao nhất 20,74 g%, sau đó là cá thu 18,20 g%, thấp nhất là cá chim trắng 13,94 g%. Nhìn chung hàm l−ợng acid amin trong cá n−ớc mặn cao hơn trong cá n−ớc ngọt. Nh− vậy ăn cá là rất tốt cho cơ thể, không chỉ là một nguồn thực phẩm cung cấp hàm l−ợng protein cao mà chất l−ợng của protit trong thịt cá là rất tốt. Đặc biệt hàm l−ợng cholesterol trong cá là không đáng kể, mỡ cá giúp ngăn ngừa đ−ợc rất nhiều bệnh tật. VI. khuyến nghị Nhằm nâng cao chất l−ợng dinh d−ỡng của cuộc sống góp phần đảm bảo sức khoẻ ng−ời tiêu dùng chúng tôi có một vài kiến nghị sau: • Tiếp tục phân tích xác định hàm l−ợng các acid amin trong các đối t−ợng thực phẩm khác để cung cấp số liệu hoàn thiện Bảng thành phần Việt Nam. • Giúp tuyên truyền các loại thực phẩm chất l−ợng cho ng−ời tiêu dùng. Khoa Hoá - ATVSTP TS. Hà Thị Anh Đào Hà nội, ngày 26 tháng 12 năm 2005 Chủ nhiệm đề tài Lê Thị Hồng Hảo 16 Tài liệu tham khảo 1. Giáo trình Sinh hoá - Đại học y Hà Nội (1990) tr. 294-303. 2. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nh− Thuận (1978) Kiểm nghiệm L−ơng thực Thực phẩm, Nhà suất bản Khoa Học và Kỹ Thuật - Hà Nội. 3. AOAC. Sixteenth edition,3rd revision, (1997). 4. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette (1998), Fully automated precolumn derivatization, on-line dialysis and high-performance liquid chromatographic analysis of acid amins in food, beverages and feedstuff, Journal of Chromatography A, 798, p. 9-17. 5. H. L. A. Tarr, (1958), Biochemistry of Fishes, Ann. Rev. Biochem., 27: 223-244 . 6. I. Molnar-Per (2000) Role of chromatography in the analysis of sugars, carboxylic acids and acid amins in food, Journal of Chromatography A, 891, p. 1-32. 7. Kang-Lyung Woo, Que-Chung Hwang, Hyung-Su Kim (1996), Determination of acid amins in the foods by reversed-phase high- performance liquid chromatography with a new precolumn derivative, butylthiocarbamyl acid amin, compare to the convention phenylthiocarbamyl derivatives and ion-exchange chromatography, Journal of Chromatography A, 740, p. 31-40. 8. R. Draisci, L. Giannetti, P. Boria, L. Lucentini, L. Palleschi, S. Cavalli (1998), Improved ion chromatography-integrated pulsed amperometric detection method for the evaluation of biogenic in food of vegetable or animal origin and in fermented foods, Journal of Chromatography A, 798, p. 109-116 9. Tyson, Don (1999), Metabolism and Analysis acid amins, Interpretation Guide.