Báo cáo Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh vật đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái

Bé n«gn nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n ViÖn thæ nh−ìng n«ng hãa B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi cÊp nhµ n−íc nghiªn cøu s¶n xuÊt thö nghiÖm ph©n bãn vi sinh vËt ®a chñng, ph©n bãn chøc n¨ng phôc vô ch¨m sãc c©y trång cho mét sè vïng sinh th¸i M· sè KC 04.DA01 Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGs, ts. ph¹m v¨n to¶n ThS. L−¬ng H÷u Thµnh 6760 24/3/2008 hµ néi - 2007 D1-1-§GMOI B¶n tù ®¸nh gi¸ VÒ t×nh h×nh thùc hiÖn vµ nh÷ng ®ãng gãp míi Cña ®Ò tµi KHCN cÊp nhµ n−íc (KÌm theo quyÕt ®Þnh sè 13/2004/Q§-BKHCN ngµy 25/5/2004 cña Bé tr−ëng Bé Khoa häc vµ c«ng nghÖ ) 1. Tªn Dù ¸n: Nghiªn cøa s¶n xuÊt thö nghiÖm ph©n bãn vi sinh vËt ®a chñng, ph©n bãn chøc n¨ng phôc vô ch¨m sãc c©y trång cho mét sè vïng sinh th¸i M· sè: KC.04.DA11 2. Thuéc ch−¬ng tr×nh: Nghiªn cøu khoa häc vµ ph¸t triÓn c«ng nghÖ sinh häc 3. Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS.TS Ph¹m V¨n To¶n ThS. L−¬ng H÷u Thµnh 4. C¬ quan chñ tr×: ViÖn Thæ nh−ìng N«ng ho¸ 5. Thêi gian thùc hiÖn: 6/2005- 6/2007 6. Tæng kinh phÝ thùc hiÖn ®Ò tµi: 6.400,000 triÖu ®ång Trong ®ã, kinh phÝ tõ NSNN: 1.959,985 triÖu ®ång 7. T×nh h×nh thùc hiÖn Dù ¸n so víi hîp ®ång 7.1. VÒ møc ®é hoµn thµnh khèi l−îng c«ng viÖc So víi hîp ®ång ®· ký kÕt gi÷a Bé KHCN, Ban chñ nhiÖm ch−¬ng tr×nh KC.04. vµ c¬ quan chñ tr× Dù ¸n, Dù ¸n ®· hoµn thµnh tèt tÊt c¶ c¸c néi dung chÝnh sau: - Hoµn thiÖn quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt chÕ phÈm vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng chÊt l−îng cao trªn thiÕt bÞ lªn men ch×m ë qui m« c«ng nghiÖp. - Hoµn thiÖn qui tr×nh s¶n xuÊt ph©n h÷u c¬ vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng. - S¶n xuÊt thö nghiÖm 8.000 tÊn ph©n h÷u c¬ vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng. - X©y dùng 6 m« h×nh tr×nh diÔn hiÖu qu¶ cña ph©n bãn vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng. Tổng hợp kết quả thực hiện dự án KC04.DA11 Số lượng TT Tên sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng chủ yếu Theo hợp đồng Thực hiện Mức độ thức hiện so với hợp đồng 1 Chủng vi sinh vật đa hoạt tính (cố định nitơ, phân giải lân, đối kháng vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn 10 11 Vượt 2 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi 1 1 Đạt sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm ở quy mô công nghiệp tạo sản phẩm có mật độ vi sinh vật đa hoạt tính đạt 109 CFU/g chế phẩm 3 Quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng được áp dụng tại cơ sở sản xuất 1 1 Đạt Phân hữu cơ vi sinh vật chức năng (tấn) 8000 8100 Vượt - Mật độ vi sinh vật chức năng (cfu/g) 106 106 - Tăng năng suất cây trồng (%) so với ĐC 15 15 4 - Giảm tỷ lệ bệnh vùng rễ (%) 60 60 5 Mô hình trình diễn sử dụng phân vi sinh vật chức năng qui mô 1-5 ha/mô hình 6 9 Vượt 6 Cơ sở sản xuất sử dụng công nghệ của dự án 1-2 5 Vượt 7 Đào tạo ĐH, SĐH - 8 Vượt 8 Công trình khoa học công bố - 4 Vượt Công nghệ chuyển giao cho địa phương 3 9 Đào tạo cán bộ và công nhân kỹ thuật sản xuất phân hữu cơ VSV chức năng 26 Vượt 10 Tập huấn nông dân kỹ thuật sử dụng phân hữu cơ VSV chức năng 1000 Vượt 7.2. VÒ tiÕn ®é thùc hiÖn: Dù ¸n ®· thùc hiÖn ®óng tiÕn ®é ®Ò ra. 8. VÒ nh÷ng ®ãng gãp míi cña Dù ¸n: VÒ gi¶i ph¸p khoa häc – c«ng nghÖ: Dù ¸n ®· nghiªn cøu hoµn thiÖn c«ng nghÖ s¶n xuÊt chÕ phÈm vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng chÊt l−îng cao vµ s¶n phÈm ph©n bãn h÷u c¬ vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng tõ c¸c tæ hîp vi sinh vËt tõ nhiÒu chñng vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh sinh häc kh¸c nhau qui m« c«ng nghiÖp. S¶n phÈm ph©n bãn h÷u c¬ vi sinh vËt ®a chñng, chøc n¨ng võa cã ý nghÜa nh− mét lo¹i ph©n bãn lµm t¨ng n¨ng suÊt c©y trång, ®ång thêi còng cã kh¶ n¨ng h¹n chÕ mét sè bÖnh vïng rÔ c©y trång c¹n do vi khuÈn/ vi nÊm g©y nªn. S¶n phÈm cña Dù ¸n cã ý nghÜa quan träng trong s¶n xuÊt bÒn v÷ng n«ng phÈm an toµn. Chñ nhiÖm Dù ¸n PGS.TS. Ph¹m V¨n To¶n ThS. L−¬ng H÷u Thµnh 1 PHẦN I: MỞ ĐẦU Dự án SXTN: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh đa chủng, đa chức năng ứng dụng cho cây trồng qui mô công nghiệp; mã số KC.04.DA11 thuộc chương trình “Nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học KC.04” được đặt ra với mục đích: Hoàn thiện công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao ở qui mô công nghiệp cho một số cây trồng trên vùng sinh thái và tổ chức chuyển giao công nghệ, ứng dụng vào sản xuất nhằm tạo mô hình sản xuất và sử dụng hỗn hợp vi sinh vật nhiều chức năng như một loại phân bón có tác dụng nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, tiết kiệm phân hoá học, đồng thời có khả năng hạn chế một số bệnh vùng rễ cây trồng do nấm và vi khuẩn gây nên, góp phần phát triển nông phẩm an toàn. Dự án được thực hiện trong 2 năm (24 tháng) từ tháng 5 năm 2005 đến tháng 6 năm 2007 với tổng số kinh phí là 6.400 triệu đồng, trong đó, từ ngân sách sự nghiệp khoa học: 2.200 triệu đồng (năm 2006 không thực hiện vì không có kinh phí). Dưới đây là một số thông tin chung về dự án: 1. Tên dự án: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm phân bón vi sinh đa chủng, đa chức năng ứng dụng cho cây trồng qui mô công nghiệp. 2. Thuộc chương trình KHCN cấp nhà nước: Nghiên cứu khoa học và phát triển Công nghệ sinh học 3. Mã số: KC.04.DA11 4. Cấp quản lý: cấp Nhà nước 5. Thời gian thực hiện: 24 tháng từ tháng 5/2005 đến 6/2007 6. Kinh phí thực hiện: Tổng số: 6.400,000 triệu đồng Trong đó, từ ngân sách sự nghiệp khoa học: 2.200,000 triệu đồng 7. Thu hồi: Kinh phí thu hồi: 1.320.000.000 (60% kinh phí hỗ trợ từ ngân sách) Thời gian thu hồi sau thời gian thực hiện (tháng): 18tháng và 24 tháng. 8. Tổ chức đăng ký chủ trì thực hiện dự án: Tên tổ chức: Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Địa chỉ: Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội Điện thoại: 7522125, Fax. 8389924 9. Chủ nhiệm dự án: Thời gian 5/2005-10/2006 Thời gian 11/2006-6/2007 Họ tên : Phạm Văn Toản Học hàm, học vị : PGS.TS Chức vụ: Trưởng bộ môn Vi sinh vật E.Mail: pvtoan@hn.vnn.vn ĐT: CQ: 8615557, NR: 8645607 Họ tên: Lương Hữu Thành Học vị: ThS E.Mail: huuthanhvasi@yahoo.com ĐT: 7522125, Fax. 8389924 2 10. Cơ quan phối hợp chính: - Liên hiệp khoa học & sản xuất CNSH-MT, Viện KH&CN Việt Nam - Trung tâm CNSH, Viện Hoá học công nghiệp - Trung tâm Nghiên cứu & Thực nghiệm đậu đỗ, Trung tâm Chuyển giao & Khuyến nông, Trung tâm cây có củ, Viện KHKTNNVN (nay là Viện cây lương thực và cây thực phẩm - Viện Bảo vệ thực vật - Công ty TNHH Hữu cơ, Đông Hoà, Dĩ An, Bình Dương, - Công ty sinh hoá hữu cơ Polyfa, Buôn Mê Thuột, Đắc Lắc - Công ty Thiên Sinh, chi nhánh phía Bắc; Gia Lâm, Hà Nội - Trung tâm ứng dụng Khoa học và Công nghệ, Sở KH&CN tỉnh Đăklăk - Công ty Cổ phần đầu tư khai thác mỏ 11. Danh sách cá nhân chính tham gia dự án. TT Họ tên Học hàm, học vị Đơn vị công tác 1 Phạm Văn Toản PGS.TS Bộ môn VSV, Viện TNNH 2 Lương Hữu Thành ThS Bộ môn VSV, Viện TNNH 3 Nguyễn Thu Hà ThS Bộ môn VSV, Viện TNNH 4 Vũ Thuý Nga CN Bộ môn VSV, Viện TNNH 5 Cao Thanh Tâm CN Bộ môn VSV, Viện TNNH 6 Đào Văn Thông ThS Bộ môn VSV, Viện TNNH 7 Phạm Bích Hiên ThS Viện Khoa học nông nghiệp VN 8 Phạm Việt Cường TS Liên hiệp KH&SX CNSH-MT Viện KH&CN VN 9 Nguyễn Phú Tuân TS Viện BVTV 12. Xuất xứ dự án: Xuất xứ của Dự án là kết quả “Sản xuất và sử dụng phân bón vi sinh vật (VSV) chức năng cho một số cây trồng “thuộc đề tài khoa học cấp Nhà Nước KC.04.04 (2001-2004) : “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (Viện KHKTNNVN) chủ trì đã được Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn công nhận, đưa vào áp dụng trong sản xuất (Quyết định 2421/QĐ/BNN-KHCN ngày 17/8/2004 và kết quả nghiên cứu triển khai của đề tài KHCN.02.06B giai đoạn 1999-2000: Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm phân bón VSV hỗn hợp phục vụ phát triển nông, lâm nghiệp bền vững do Viện KHKTNNVN chủ trì đã được nghiệm thu ngày 20/3/2001 đạt mức xuất sắc. Dự án cũng được xây dựng trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu triển khai các đề tài khoa học cấp Nhà nước do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (KHKTNNVN) chủ trì giai đoạn 1991 -1998 đó là: 3 - Đề tài KH cấp Nhà nước KHCN.02.06A (1996-1998): Nghiên cứu áp dụng các giải pháp công nghệ mới nhằm mở rộng việc sản xuất và ứng dụng phân bón VSV cố định nitơ, phân giải lân trong nông lâm nghiệp do Viện KHKTNNVN chủ trì, đã được nghiệm thu ngày 20/4/1999 đạt mức xuất sắc. - Đề tài KH cấp Nhà nước KC.08.01 (1991-1995): Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng phân VSV cố định nitơ nhằm nâng cao năng suất lúa và cây trồng cạn do Viện KHKTNNVN chủ trì, được nghiệm thu ngày 10/01/1996 đạt mức xuất sắc - Đề án lưu giữ nguồn gen VSV nông nghiệp thuộc chương trình hàng năm của Bộ Khoa học & Công nghệ về công tác thu thập, tuyển chọn và lưu giữ nguồn gen cây trồng, vật nuôi và VSV do Viện KHKTNNVN chủ trì. Hiện nay quĩ gen VSV nông nghiệp đang bảo quản lưu giữ trên 600 chủng VSV sử dụng cho công tác nghiên cứu triển khai phân bón VSV, thuốc bảo vệ thực vật sinh học, chế phẩm VSV cải tạo môi trường, và chuyển đổi sinh học và được bổ sung hàng năm thêm hàng trăm chủng, giống VSV mới từ nhiều nguồn khác nhau. Đây là nguồn nguyên liệu quan trọng cho việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm VSV sử dụng trong sản xuất nông nghiệp. 13. Nội dung chính của Dự án. 13.1. Xây dựng, thử nghiệm và hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc qui mô công nghiệp. - Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV vật đa chủng, chức năng đậm đặc từ tổ hợp các VSV cố định đạm, phân giải lân, sinh tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn bằng phương pháp nuôi cấy chìm ở qui mô công nghiệp (công suất 1500 lít/mẻ). - Sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc. - Đánh giá chất lượng chế phẩm VSV đa chủng, chức năng, đậm đặc Nghiên cứu xây dựng qui trình bảo quản, sử dụng chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc. 13.2. Sản xuất thử nghiệm và phát triển phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất trên trên cơ sở chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc và cơ chất hữu cơ đã xử lý. - Phối hợp với các đơn vị liên doanh, liên kết xây dựng qui trình xử lý cơ chất hữu cơ làm chất mang cho phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng. - Đào tạo, tập huấn cán bộ kỹ thuật tại đơn vị liên doanh, liên kết, phối hợp sản xuất thử nghiệm và đánh giá chất lượng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên cơ sở chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc và cơ chất hữu cơ đa xử lý. - Nghiên cứu đánh giá khả năng sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng đối với cây trồng tại một số vùng sinh thái. 4 - Phối hợp sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng và ứng dụng sản phẩm trên diện tích 2000 ha/năm tương đương với 8.000 tấn phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trong 2 năm. - Tổ chức khuyến cáo và mở rộng qui mô sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng cho các đối tượng cây trồng thông qua các mô hình trình diễn tại các vùng sinh thái khác nhau. 13.3. Đào tạo bồi dưỡng đội ngũ cán bộ, công nhân kỹ thuật. - Đào tạo nâng cao trình độ cho 2 cán bộ khoa học về qui trình công nghệ sản xuất phân vi sinh vật đa chủng, chức năng qui mô công nghiệp làm hạt nhân cho việc triển khai công nghệ tại cơ quan chủ trì dự án và đơn vị phối hợp, liên doanh, liên kết dự án - Đào tạo nâng cao tay nghề cho 5 công nhân kỹ thuật tham gia nghiên cứu triển khai sản xuất phân VSV đa chủng, chức năng tại cơ quan chủ trì dự án, đơn vị phối hợp và liên doanh, liên kết của dự án về kỹ thuật sản xuất, kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm tạo ra, đồng thời tổ chức các hoạt động nhằm mở rộng thông tin khoa học về sản phẩm phân VSV đa chủng, chức năng cho đội ngũ cán bộ kỹ thuật tại cơ sở sản xuất và địa phương. - Tập huấn nông dân về kỹ thuật sử dụng, hỗ trợ thử nghiệm và xây dựng mô hình trình diễn hiệu quả phân VSV đa chủng, chức năng tại cơ sở sản xuất và sử dụng sản phẩm 14. Sản phẩm của Dự án. Sản phẩm của dự án theo hợp đồng số 02/2005/HĐ-DASXTN/KC.04- DA11 và hợp đồng số: 11/2006/HĐ-DA ký kết giữa Bộ Khoa học và Công nghệ và Cơ quan chủ trì và chủ nhiệm dự án như bao gồm: STT Tên sản phẩm Số lượng Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật Ghi chú 1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm ở quy mô công nghiệp 01 10 chủng VSV đa hoạt tính, Chế phẩm có mật độ VSV đa hoạt tính ≥ 109 CFU/g 2 Quy trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng 01 Qui trình được áp dụng tại 1-2 cơ sở sản xuất 3 Phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng 8.000 tấn - Sử dụng cho một số đối tượng cây trồng. - Mật độ VSV: 106 CFU/g 4 Mô hình trình diễn hiệu quả của phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng ở mộ số vùng sinh thái 6 mô hình Qui mô 1-5 ha/mô hình 5 PHẦN 2: KẾT QUẢ HOẠT ĐỘNG DỰ ÁN I. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC. Hiệu quả của VSV trong việc làm tăng khả năng sinh trưởng phát triển cây trồng, tiết kiệm phân bón hoá học cũng như tăng năng suất, chất lượng nông sản đã được khẳng định trong nhiều công trình nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới (5, 7, 13, 14, 20, 21, 25, 30). Các sản phẩm vi sinh như phân bón VSV cố định nitơ, phân giải photphat khó tan, chế phẩm VSV kích thích sinh trưởng thực vật, chế phẩm VSV phòng trừ bệnh cây trồng đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp bền vững. VSV tác động đến cây trồng trực tiếp hoặc gián tiếp. Sự tác động trực tiếp của VSV đến cây trồng thể hiện qua sự tổng hợp, khoáng hoá hoặc chuyển hoá các chất dinh dưỡng xảy ra trong quá trình chuyển hoá vật chất của VSV như quá trình cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp auxin, giberellin, etylen, .v.v. Những vi khuẩn này có khả năng giúp cây trồng tăng khả năng huy động và dễ dàng sử dụng các nguồn dinh dưỡng từ môi trường. Tác động gián tiếp đến sinh trưởng của cây trồng xảy ra khi các chủng VSV có khả năng làm giảm bớt hoặc ngăn chặn các ảnh hưởng có hại từ môi trường hoặc từ các VSV bất lợi đối với thực vật, trong đó VSV có thể cạnh tranh dinh dưỡng với VSV bất lợi hoặc sinh tổng hợp các chất có tác dụng trung hoà, phân huỷ, chuyển hoá các tác nhân có hại hoặc tiêu diệt, ức chế các VSV bất lợi. Mỗi loại VSV trong tự nhiên có thể có 1 hoặc cả 2 tác động nêu trên đối với cây trồng (1, 2, 3, 9, 10, 11, 16, 23, 26, 29, 32, 35). Kết quả nghiên cứu từ các nước Mỹ, Canada, Nga, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật.... cho thấy sử dụng chế phẩm VSV có thể cung cấp cho đất và cây trồng từ 30 - 60 kg N/ha/năm hoặc thay thế 1/2 - 1/3 lượng lân vô cơ bằng quặng photphat. Dịch nuôi cấy các VSV sinh tổng hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật như Azotobacter, Azospirilum, Rhizobium…có thể cung cấp 10-20 µgIAA/ml hoặc 20 µg GA3/ml do đó làm tăng khả năng nảy mầm, ra rễ của hạt giống, tăng khả năng phân chia mô tế bào, kích thích hoặc kìm hãm sự nở hoa, tăng khả năng sinh trưởng và năng suất củ quả và tăng tính chống chịu hạn. Một số chất kháng sinh như Agrocin 84, Agrocin 434, Phenazines, Pyoluteorin…được sinh ra bởi Agrobacterium, Pseudomonas và Bacillus…có khả năng hạn chế bệnh tua mực ở cây quế, bệnh trụi ngọn ở cam chanh, bệnh héo xanh vi khuẩn, bệnh thối rễ do nấm ở cây họ cà và cây đậu đỗ. Tuy nhiên do hệ VSV rất đa dạng và mỗi VSV trong đất đều chịu nhiều tác động qua lại của các VSV khác cũng như điều kiện môi trường nên hiệu quả của các sản phẩm vi sinh trong các điều kiện khác nhau không giống nhau. Một số nghiên cứu gần đây ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đức, Nhật, Mỹ, Anh, Úc... cho thấy sản phẩm tổng hợp bao gồm tập hợp các nhóm VSV cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật, đối kháng VSV gây bệnh vùng 6 rễ cây trồng như E2001, Phytobacter, superlife, .v.v. có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng nhóm riêng rẽ. Các sản phẩm phân VSV trên thế giới được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men ở qui mô công nghiệp, trong đó môi trường dinh dưỡng chuẩn không được sử dụng vì giá thành quá cao mà được thay thế bằng môi trường tổng hợp từ các nguồn liệu sẵn có như tinh bột ngô, sắn, rỉ mật, nước chiết ngô, nước chiết men, nước chiết đậu tương, amoniac, .v.v. Thành phần môi trường được nghiên cứu, lựa chọn đảm bảo phù hợp với từng đối tượng VSV (1, 4, 6, 13). Trong khuôn khổ các đề tài, dự án nghiên cứu & triển khai các đơn vị khoa học trong cả nước đã tiến hành các nghiên cứu về VSV có ích ( cố định nitơ, phân giải photphat khó tan, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật…), trên cơ sở đó nghiên cứu sản xuất thành công một số loại phân bón VSV. Các sản phẩm phân bón VSV đơn chủng (Nitragin, Rhizoda, Azogin, Rhizolu, Phosphobacterin...) hay đa chủng ( phân hỗn hợp từ VSV cố định nitơ và phân giải lân: Biomix, Humix…) đã thể hiện được tác dụng nâng cao hiệu quả sử dụng phân khoáng, tăng cường trao đổi chất trong cây và qua đó nâng cao năng suất, chất lượng nông sản và tăng thu nhập cho người nông dân. Kết quả nghiên cứu triển khai các đề tài, dự án về phân bón VSV đơn chủng và đa chủng được hiện trong các công trình đã công bố (20, 21) Bên cạnh các VSV có lợi các VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng tồn tại trong đất đã gây nhiều thiệt hại cho sản xuất nông, lâm nghiệp. Năng suất cây trồng ở nhiều nơi đã bị giảm từ 20-100%. Nhiều nghiên cứu ở Việt Nam đã chỉ ra Pseudomonas solanacearum là tác nhân chính gây bệnh chết ẻo ở cà chua, dưa, lạc và Aspergillus niger, Macropholina phaseomina, Sclerotium rolfsii và Fusarium là tác nhân gây bệnh lở cổ rễ và bệnh thối rễ ở cà phê, tiêu và điều (8, 12, 15). Ngoài các kỹ thuật canh tác đến nay chưa có biện pháp phòng trừ nào có hiệu quả. Các công trình nghiên cứu gần đây của Viện Bảo vệ Thực vật, Viện KHKTNNVN, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện CNSH, Viện Khoa học Lâm nghiệp.v.v. đã chứng minh một số VSV có khả năng ức chế và tiêu diệt nhiều vi sinh vật gây bệnh. Kết quả này đã tạo ra cơ sở ban đầu cho giải pháp phòng trừ sinh học các nguồn bệnh nguy hiểm này (21). Sản xuất và ứng dụng hỗn hợp VSV cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật và VSV đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ như một loại phân bón chức năng sử dụng trong sản xuất nông lâm nghiệp là kết quả nghiên cứu của Viện KHKTNNVN phối hợp cùng Viện CNSH – Viện KH&CN Việt Nam và Viện KH lâm nghiệp. Kết quả nghiên cứu đã chứng minh phân VSV đa chủng, chức năng có tác dụng tiết kiệm phân khoáng, giảm thiểu thuốc bảo vệ thực vật hoá học và góp phần tích cực cho việc xây dựng nền nông nghiệp bền vững. Sản phẩm đã được nghiên cứu đánh giá trong phòng thí nghiệm, thử nghiệm ảnh hưởng trên một số đối tượng cây trồng ở qui mô chậu vại, nhà lưới, vườn ươm và khảo nghiệm đồng ruộng cả 7 diện hẹp và diện rộng. Kết quả thử, khảo nghiệm cho thấy phân VSV đa chủng, chức năng có khả năng gia tăng sinh khối và năng suất cây trồng. Sự tăng năng suất được xác nhận ngay cả khi giảm 10-30% lượng dinh dưỡng khoáng N,P. Số liệu tổng kết kết quả khảo nghiệm đồng ruộng diện rộng và mô hình trình diễn tại một số địa phương cho thấy phân VSV đa chủng chức năng có khả năng gia tăng sinh khối và năng suất cây trồng. Sự tăng năng suất được xác nhận ngay cả khi giảm một phần dinh dưỡng khoáng (N,P). Kết quả khảo nghiệm cũng xác định phân vi sinh vật đa chủng không những đem lại lợi ích về mặt cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng mà còn có tác dụng tích cực trong việc hạn chế bệnh vùng rễ ở các cây trồng thử nghiệm. Kết quả nghiên cứu cơ chế tác dụng, qui trình công nghệ sản xuất qui mô phòng thí nghiệm và hiệu lực của loại phân mới này đã được công bố trên nhiều tạp chí khoa học trong và ngoài nước, đặc biệt trong Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc tổ chức tại Hà Nội tháng 12 năm 2003. phân bón VSV đa chủng chức năng, sản phẩm của Viện KHKTNNVN kết hợp cùng Viện CNSH và Viện KHLN đã được Hội đồng Khoa học chuyên ngành Đất, Phân bón và Hệ thống nông nghiệp, Bộ Nông nghiệp & PTNT kiến nghị công nhận tiến bộ kỹ thuật và áp dụng rộng trong sản xuất (21). Với khuôn khổ một đề tài nghiên cứu khoa học trong thời gian qua các cán bộ khoa học của đề tài mới tập trung nghiên cứu nhằm chứng minh khả năng sử dụng hỗn hợp VSV đa chức năng làm phân bón và tổ chức xây dựng, triển khai qui trình công nghệ sản xuất ở qui mô nhỏ. Trong thời gian qua, mặc dù có hiệu quả và được người sử dụng tín nhiệm, song phân bón VSV đa chủng, chức năng chỉ mới được sử dụng ở phạm vi hết sức khiêm tốn. Nguyên nhân chính của hạn chế này là do chưa có qui trình sản xuất ở qui mô công nghiệp. Nhằm đáp ứng nhu cầu của thực tế sản xuất và nhanh chóng đưa tiến bộ khoa học vào sản xuất, việc nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất phân VSV đa chủng, chức năng ở qui mô công nghiệp tạo sản phẩm mới và phát triển trên diện rộng là hết sức cần thiết. Mục tiêu của dự án là hoàn thiện công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao ở qui mô công nghiệp cho một số cây trồng trên vùng sinh thái và tổ chức chuyển giao công nghệ, ứng dụng vào sản xuất nhằm tạo mô hình sản xuất và sử dụng hỗn hợp vi sinh vật nhiều chức năng như một loại phân bón có tác dụng nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, tiết kiệm phân hoá học, đồng thời có khả năng hạn chế một số bệnh vùng rễ cây trồng do nấm và vi khuẩn gây nên, góp phần phát triển nông phẩm an toàn. II. LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đã được nghiên cứu và thử nghiệm sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot trong khuôn khổ của đề tài KC.04.04. Sản phẩm đã được thử nghiệm trên cây trồng cho hiệu quả tốt. Từ chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đề tài đã phối 8 hợp với một số công ty để sản xuất thử nghiệm phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng. Sản phẩm phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng được khảo nghiệm trên một số cây trồng ở miền Bắc, miền Nam, Tây nguyên và được người sử dụng đánh giá cao. Do mục tiêu của đề tài nghiên cứu là xây dựng công nghệ sản xuất phân VSV đa chủng chức năng ở qui mô pilot và thử nghiệm áp dụng tại một số cơ sở sản xuất, nên sản phẩm phân VSV đa chủng chức năng chỉ được ứng dụng trong khuôn khổ của đề tài trên diện tích khiêm tốn. Kết quả thử, khảo nghiệm đồng ruộng đã cho thấy phân bón VSV đa chủng, chức năng có hiệu quả tốt trong trồng trọt, mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội cho người sử dụng và môi trường sinh thái. Thực tế sản xuất nông, lâm nghiệp đang rất cần sản phẩm phân bón VSV đa chủng chức năng. Nhằm hoàn thiện qui trình công nghệ tạo sản phẩm chất lượng cao ở qui mô lớn phục vụ công tác đưa nhanh tiến bộ kỹ thuật vào sản xuất đáp ứng nhu cầu của của người sử dụng, dự án cần thiết phải triển khai các nghiên cứu thử nghiệm và hoàn thiện để xác định được tính ổn định của qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng chất lượng cao ở qui mô công nghiệp; đồng thời phối hợp với các cơ sở sản xuất phân bón hữu cơ, hữu cơ sinh học ở các vùng sinh thái nghiên cứu hoàn thiện qui trình xử lý phân gia cầm, than bùn và các nguồn hữu cơ khác thành chất mang cho sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng. Trên cơ sở đó dự án tổ chức sản xuất thử nghiệm và phát triển phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất. Nhằm khuyến cáo phân bón VSV đa chủng, chức năng cho sản xuất dự án cũng đặt ra nội dung thử, khảo nghiệm phân VSV đa chủng, chức năng và xây dựng mô hình trình diễn trên diện rộng đối với một số cây trồng tại các vùng sinh thái. Để dự án được thực hiện thành công và có thể chuyển giao cho sản xuất, dự án xác định việc đào tạo, bồi dưỡng cán bộ là nội dung quan trọng tiếp theo của dự án. Để giải quyết các nội dung nghiên cứu đáp ứng mục tiêu xác định nêu trên dự án đã sử dụng kỹ thuật và phương pháp nghiên cứu sau (chi tiết các phương pháp nghiên cứu được tập hợp trong phụ lục 1): - Nghiên cứu đặc điểm chung và điều kiện sinh trưởng phát triển của VSV theo các phương pháp nghiên cứu VSV thông dụng. - Phương pháp phân tích các chỉ tiêu lý hoá học của mẫu đất, phân bón theo 10TCN 378-99; 369-99; 370-99; 377-99; 373-99; 371-99; 375-99; 303-97; 361-99; 306-97; 307-97; 308-97; 302-97; 366-99. - Phương pháp xác định hoạt tính cố định nitơ, phân giải lân VSV và chất lượng phân bón VSV theo TCVN 6166-2002; 6167-1996; 7185-2002; 10TCN 299-97; 298-97. - Đánh giá khả năng đối kháng vi khuẩn/ nấm bệnh vùng rễ cây trồng theo phương pháp khuyếch tán hoạt chất ức chế vi sinh vật trong môi trường thạch (27). 9 - Xác định tên VSV bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự gen 16S ARN ribosom và so sánh theo chương trình phần mềm Fasta. Tên VSV được xác định với xác xuất tương đồng cao nhất (17). - Xác định độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật theo hướng dẫn về phân loại cấp độ an toàn sinh học của cộng đồng Châu Âu số 90/679/EWG (31). - Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng diện hẹp và diện rộng theo 10TCN 216-95 (216-2003): Qui phạm khảo nghiệm đồng ruộng hiệu lực của phân bón đối với cây trồng và “Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng”. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với 3 lần lặp lại. Số liệu nghiên cứu được xử lý theo chương trình thống kê và xử lý số liệu IRRISTAT III. NHỮNG NỘI DUNG Đà THỰC HIỆN. Ngay sau khi Dự án được phê duyêt cơ quan chủ trì dự án đã tổ chức hội thảo kế hoạch triển khai dự án với sự tham gia của các cán bộ khoa học chủ chốt về các lĩnh vực có liên quan. Nội dung nghiên cứu của dự án được thống nhất và phân công cụ thể cho các đơn vị và triển khai chi tiết trong các năm như sau: Năm 2005: - Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV vật đa chủng, chức năng đậm đặc từ tổ hợp các VSV cố định đạm, phân giải lân, sinh tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn bằng phương pháp nuôi cấy chìm ở qui mô công nghiệp (công suất 1500 lít/mẻ). - Sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc. - Đánh giá chất lượng chế phẩm VSV đa chủng, chức năng, đậm đặc Nghiên cứu xây dựng qui trình bảo quản, sử dụng chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc. - Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình xử lý cơ chất hữu cơ làm chất mang cho phân bón hữu cơ VSV đa chủng, chức năng. - Nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện qui trình sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên cơ sở chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc và cơ chất hữu cơ đã xử lý. - Sản xuất thử nghiệm, đầu đánh giá khả năng sử dụng và bước đầu phát triển phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất. Năm 2006 và 2007 - Tiếp tục hoàn thiện qui trình sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng và phối hợp sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng ở qui mô công nghiệp. - Tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng đối với cây trồng tại một số vùng sinh thái. 10 - Tổ chức khuyến cáo và mở rộng qui mô sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng cho các đối tượng cây trồng thông qua các mô hình trình diễn tại các vùng sinh thái khác nhau. Nội dung và các đơn vị chính thực hiện dự án cụ thể như sau: Đơn vị thực hiện Nội dung thực hiện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam/ Viện Thổ nhưỡng Nông hoá và các đơn vị trực thuộc. - Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc sử dụng cho cây trồng nông nghiệp và hồ tiêu. - Hoàn thiện công nghệ xử lý cơ chất hữu cơ và sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng sử dụng cho cây trồng nông nghiệp. - Phối hợp sản xuất, đánh giá khả năng sử dụng và khuyến cáo ứng dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên diện rộng. Viện CNSH, Viện KH&CN Việt Nam. - Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm VSV đa chủng, chức năng đậm đặc, cơ chất hữu cơ và phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng sử dụng cho cây công nghiệp. - Phối hợp sản xuất và khuyến cáo đưa vào sử dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng. Các công ty: TNHH Hữu cơ Bình Dương, Polyfa, Thiên Sinh, Cổ phần đầu tư khai thác mỏ, TT Ứng dụng KHCN Đắc Lắc - Phối hợp sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên cơ sở chế phẩm đậm đặc và cơ chất đã xử lý. - Phối hợp khuyến cáo và tổ chức phát triển hữu cơ VSV đa chủng, chức năng vào sản xuất. - Tiếp nhận chuyển giao công nghệ sản xuất phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng. Các Sở nông nghiệp, Chi cục BVTV các tỉnh, Viện BVTV Phối hợp đánh giá khả năng sử dụng và khuyến cáo ứng dụng phân hữu cơ VSV đa chủng, chức năng trên diện rộng. IV. KẾT QUẢ THỰC HIỆN. 1. Kết quả khoa học công nghệ. 1.1 Hoàn thiện qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng trên thiết bị lên men chìm qui mô công nghiệp. 1.1.1.Tuyển chọn, xác định bộ giống vi sinh vật đa hoạt tính. Từ bộ giống VSV thuộc đề tài KC04-04 và Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp, dự án đã tiến hành tuyển chọn và đánh giá hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật. Trên cơ sở lý lịch khoa học về hoạt tính sinh học của một số chủng vi sinh vật đã biết về hoạt tính cố định nitơ, phân giải photphat khó tan, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật và đối kháng vi khuẩn, nấm gây bệnh vùng rễ, kết quả cụ thể như sau: 11 a). Azotobacter Theo lý lịch khoa học, 3 chủng Azotobacter, ký hiệu là 108, 70 và 106 là những chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ tự do. Để sử dụng các chủng vi sinh vật này làm nguyên liệu sản xuất phân bón vi sinh vật đa chủng, chức năng, dự án tiến hành tuyển chọn ra những chủng có hoạt tính sinh học cố định nitơ mạnh. Kết quả kiểm tra hoạt tính cố định nitơ của các chủng Azotobacter được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Khả năng cố định nitơ của các chủng Azotobacter. STT Ký hiệu chủng Cố định nitơ (µmol Etylen/ml/ngày) 1 70 4345,6 2 106 3207,2 3 108 4281,6 Số liệu bảng 1 cho thấy, các chủng Azotobacter đều có khả năng cố định nitơ, với hoạt tính hình thành etylen đạt từ 2207,2 đến 4345,6 µmol/ml/ngày, trong đó chủng 70 có khả năng cố định nitơ cao nhất, đạt 4345,6 µmol/ml/ngày. Các chủng vi sinh vật sử dụng để sản xuất phân vi sinh vật chức năng đặc biệt có ý nghĩa sử dụng nếu các chủng này có tính chất đa hoạt tính sinh học. Vì vậy, dự án đã đánh giá các hoạt tính sinh học khác của chủng Azotobacter. Kết quả đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng Azotobacter được trình bày trong bảng 2 cho thấy, các chủng Azotobacter sử dụng trong nghiên cứu đều có khả năng sinh IAA thô, hàm lượng đạt từ 3-430 µg/ml, hàm lượng IAA đạt cao nhất sau 5 ngày nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung DL- triptophan 1%. Chủng 70 có khả năng sinh IAA thô cao nhất, đạt 430 µg/ml sau 5 ngày nuôi cấy. Trong khu hệ sinh thái tồn tại rất nhiều mối quan hệ giữa các quần thể sinh vật, quan hệ giữa VSV – VSV, VSV – Cây trồng, VSV - Động vật đất...Lợi dụng mối quan hệ cạnh tranh giữa các quần thể vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo chế phẩm phân bón vi sinh vật chức năng có khả năng hạn chế vi khuẩn gây bệnh vùng rễ thực vật. Kết quả đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh thực vật của các chủng Azotobacter được trình bày trong bảng 3. Kết quả bảng 3 cho thấy cả ba chủng Azotobacter sử dụng trong nghiên cứu đều có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh thực vật. Chủng 70 có khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh cho lạc, chủng 108 có khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh cho lạc và cà chua, chủng 106 có khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh cho lạc, cà chua và khoai tây. 12 Bảng 2. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng Azotobacter. Hàm lượng IAA thô (µg/ml) Ký hiệu chủng 1 ngày 2 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 70 85 288 320 430 335 106 3 7 23 32 28 108 25 35 35 39 27 Bảng 3. Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh của các chủng Azotobacter. Khả năng ức chế vi khuẩn héo xanh (vòng ức chế D-d cm) Ký hiệu chủng Cà chua Khoai tây Lạc 70 - - 0,6 106 1,6 1,4 0,3 108 1,6 - 1,6 Ghi chú: (-): Không có hoạt tính Sinh tổng hợp polyshacarit là một trong các tính chất đặc trưng của Azotobacter. Sử dụng đặc tính này để cải thiện độ phì của đất trồng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh polyshacarit của các chủng Azotobacter được thể hiện trong bảng 4. Bảng 4. Hàm lượng polyshacarit của các chủng Azotobacter. Ký hiệu chủng Lượng polyshacarit (g khô/l) 70 360 106 489 108 353 Kết quả bảng 4 cho thấy 3 chủng Azotobacter nghiên cứu đều có khả năng sinh polyshacarit, lượng polyshacarit tạo thành đạt từ 353 đến 489 g khô/lít. Khả năng sinh polyshacarit của các chủng Azotobacter có ý nghĩa trong sản xuất phân bón sinh học. Các chủng sinh polyshacarit có tác dụng tốt cho sinh thái đất và cây trồng nhờ khả năng giữ ẩm cho đất, tăng chất dinh dưỡng cho cây trồng v.v… Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải lân và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn cho thấy các chủng Azotobacter có biểu hiện, song mức độ không cao. b). Rhizobium 13 Rhizobium là vi khuẩn gram (-), hiếu khí, sống cộng sinh với cây họ đậu. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển chúng có khả năng cố định nitơ và cung cấp nitơ cho cây chủ. Kết quả nghiên cứu khả năng hình thành nốt sần và cố định nitơ của các chủng Rhizobium sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện trong bảng 5. Bảng 5. Khả năng cố định nitơ và hình thành nốt sần của các chủng Rhizobium. Số lượng nốt sần/cây STT Ký hiệu chủng Tổng số Rễ chính Rễ phụ Khả năng cố định nitơ (nmol C2H4/cây/ngày) 1 RA.04 33,5 13,0 20,5 621,5 2 RA.18 40,0 11,0 29,0 748,0 3 RA.42.2 222,5 115,0 107,5 5135,5 Kết quả bảng 5 cho thấy, 3 chủng Rhizobium sử dụng trong nghiên cứu đều có khả năng hình thành nốt sần và cố định nitơ, trong đó, chủng RA.42.2 có khả năng hình thành 222,5 nốt sần/cây và cố định được 5135,5 nmol C2H4/cây/ngày. Để có thể tạo nốt sần và cố định nitơ phân tử cung cấp cho đất và cây trồng, đòi hỏi các vi sinh vật cố định nitơ phải có khả năng cạnh tranh cao đối với các vi sinh vật có sẵn trong đất. Khả năng cạnh tranh của các vi sinh vật trong đất được đánh giá thông qua tính kháng kháng sinh. Kết quả nghiên cứu đánh giá mức độ kháng kháng sinh của các chủng Rhizobium được thể hiện trong bảng 6. Bảng 6. Khả năng kháng kháng sinh của chủng Rhizobium. Loại kháng sinh STT Ký hiệu chủng Streptomycin Spectinomycin Tetracilin 1 RA.04 - - - 2 RA.18 - + (30 ppm) - 3 RA.42.2 - + (30 ppm) - Ghi chú: (-): Không mọc trên môi trường bổ sung kháng sinh, (+): Mọc trên môi trường bổ sung kháng sinh Kết quả bảng 6 cho thấy, 3 chủng Rhizobium sử dụng trong nghiên cứu đều không mọc được trên môi trường có bổ sung streptomycin, tetracilin. Chủng RA.18 và RA.42.2 có khả năng phát triển trên môi trường chứa spectinomycin (30 ppm). Kết quả đánh giá hoạt tính sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trưởng 14 thực vật (IAA), phân giải lân và đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn cho thấy các chủng Rhizobium không thể hiện rõ nét. c). Bacillus Khả năng chuyển hoá Ca3PO4 của các chủng Bacillus trên môi trường đặc được tổng hợp trong bảng 7 cho thấy cả 9 chủng vi sinh vật đều có khả năng chuyển hoá Ca3PO4 thành dạng hoà tan, trong đó chủng B.14 có đường kính vòng phân giải phosphat khó tan lớn nhất (21,5mm), chủng B.08, B.18, B.10, B.24 có đường kính vòng phân giải phosphat khó tan từ 14,5-15,5mm và chủng B.17 có khả năng phân giải phosphat nhỏ nhất (đường kính vòng phân giải = 4,0mm). Thời gian hình thành vòng phân giải đối với 8/9 chủng Bacillus là 3 ngày, riêng chủng B14 có khả năng hình thành vòng phân giải photphat ngay sau 1 ngày nuôi cấy. Bảng 7. Khả năng phân giải Ca3(PO4)2 của các chủng Bacillus trên môi trường đặc. TT Chủng vi khuẩn Đường kính (d) vòng phân giải photphat khó tan (mm) trên môi trường đặc sau 5 ngàynuôi cấy 1 B04 11,5 2 B08 14,6 3 B10 14,5 4 B14 21,5 5 B16 11,5 6 B17 4,0 7 B18 14,6 8 B24 15,5 9 B34 11,5 Kết quả xác định định lượng hoạt tính phân giải lân của các chủng vi sinh vật nghiên cứu cũng đồng nhất với kết quả đánh giá định tính khả năng chuyển hoá lân khó tan của các chủng Bacillus nghiên cứu. Số liệu bảng 8 cho thấy mức độ hoà tan lân của các chủng Bacillus đạt 1-20µg/ml sau 10 ngày nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy 2 chủng B17 và B34 có hàm lượng lân tan thấp nhất, khoảng 1µg/ml, chủng B14, và B18 có hàm lượng hoà tan lân tương 15- 20µg/ml. Khả năng chuyển hoá lân từ các nguồn phốt phát khác nhau của chủng Bacillus sử dụng trong nghiên cứu cho thấy các nguồn photphat khác nhau có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển của Bacillus cũng như mức độ hoà tan lân của chúng. Ca3(PO4)2 là nguồn photpho được Bacillus sử dụng tốt nhất. Cả hai loại quặng apatit và photphorit đều không có ảnh hưởng tốt đến sinh trưởng, phát triển của Bacillus. Trong môi trường nuôi cấy có bổ sung hai loại quặng apatit và photphorit mật độ Bacillus chỉ đạt 107-108CFU/ml.Sự sinh 15 trưởng, phát triển của chủng B14, B18 trong môi trường nuôi cấy chứa các nguồn photpho khác nhau được minh hoạ trong các biểu đồ 1 và 2. Bảng 8. Khả năng hoà tan lân của các chủng Bacillus trong môi trường nuôi cấy lỏng sau thời gian nuôi cấy 10 ngày. STT Chủng vi khuẩn Chỉ số OD Hàm lượng lân tan (µg/l) 1 B04 0,063 6 2 B08 0,050 5 3 B10 0,064 6 4 B14 0,203 20 5 B16 0,064 6 6 B17 0,009 1 7 B18 0,156 15 8 B24 0,068 6 9 B34 0,013 1 Biểu đồ 1: Khả năngphát triển của B14 trong môi trường bổ sung nguồn các phosphate khác nhau. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 ngµy 4 ngµy 6 ngµy 8 ngµy 10 ngµy Thêi gian nu«i cÊy (ngµy) m Ët ® é tÕ b µo ( C FU /m l) Ca3PO4 ApatÝt Supel©n Photphorit 16 Biểu đồ 2. Khả năng phát triển của B18 trong môi trường bổ sung nguồn các phosphate khác nhau 0 2 4 6 8 10 2 ngµy 4 ngµy 6 ngµy 8 ngµy 10 ngµy Thêi gian nu«i cÊy (ngµy) M Ët ® é tÕ b µo ( C F U /m l) Ca3PO4 ApatÝt Supel©n Photphorit Để xác định khả năng bền vững của hoạt chất sinh học phân giải hợp chất photpho, dự án tiến hành đánh giá mức độ hoạt tính của vi khuẩn trong điều kiện ly tâm và xử lý nhiệt độ, trong đó vi khuẩn được nuôi trên môi trường có bổ sung Ca3(PO4)2 trong 3 ngày sau đó tiến hành ly tâm hoặc xử lý nhiệt độ và đo vòng phân giải lân trên môi trường đặc. Kết quả nghiên cứư cho thấy các chủng vi khuẩn phân giải lân trong quá trình nuôi cấy đều làm giảm pH của môi trường, trong đó chủng B.14 trong điều kiện ly tâm có xử lý nhiệt độ 800C trong 10 phút thì hoạt tính phân giải lân không thể hiện nữa, các chủng còn lại không thay đổi hoạt tính phân giải lân khi xử lý ở độ nhiệt độ 800C trong 10 phút. Như vậy chủng B.14 có khả năng đã sản sinh ra 1 loại men phosphataza phân giải hợp chất Ca3(PO4)2. Men này dễ bị phân huỷ trong điều kiện nhiệt độ cao. Điều này cũng phù hợp với đặc điểm hình thái học của chủng vi khuẩn có khả năng sinh men phosphataza, chúng có khả năng phát triển trên môi trường thạch muối-khoai tây. Trên môi trường này có thể nhận ra khá dễ dàng các khuẩn lạc vi khuẩn phân giải hợp chất photpho: đó là khuẩn lạc lớn nhày và xung quanh có vòng trong suốt. Để xác định hoạt tính sinh tổng hợp IAA, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung DL-triptophan 1%. Kết quả xác định hàm lượng IAA sau thời gian nuôi cấy từ 2-6 ngày được trình bày trong bảng 9 cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có khả năng sinh IAA với hàm lượng đạt từ 35-352 µg/ml môi trường, trong đó hàm lượng IAA đạt cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy các chủng vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng có bổ sung DL- triptophan 1%. Chủng B14 có khả năng sinh IAA cao nhất (đạt 352 µg/ml), chủng B.24,B10 cho hàm lượng IAA thấp nhất (82µg/ml và 87µg/ml) 17 sau 4 ngày nuôi cấy. Chủng B08 và B18 có khả năng sinh IAA tương ứng đạt 186 và 263µg/ml sau 4 ngày nuôi cấy. Bảng 9: Khả năng sinh IAA của các chủng Bacillus. Hàm lượng IAA (µg/ml) sau thời gian nuôi cấy TT Chủng vi khuẩn 2 ngày 4 ngày 6 ngày 1 B04 106 87 36 2 B08 72 186 112 3 B10 106 87 36 4 B14 343 352 149 5 B16 80 133 69 6 B17 120 238 228 7 B18 228 263 125 8 B24 80 82 35 9 B34 97 90 49 Để xác định khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn, dự án đã tiến hành nuôi cấy các Bacillus trên môi trường vô đạm (MT Asby) và nhận thấy mật độ chủng vi khuẩn đều thấp hơn so với môi trường chuẩn (MT Kinh). Trên môi trường Asby, các vi khuẩn nghiên cứu không phát triển thành các khuẩn lạc điển hình. Để khẳng định chắc chắn khả năng cố định nitơ của các vi kluẩn phân giải lân, chuyên đề đã tiến hành đo hoạt tính khả axetylen của chúng trên máy sắc ký khí. Kết quả phân tích không phát hiện thấy hoạt tính khử axety len của tất cả các chủng vi khuẩn nghiên cứu, điều đó cho thấy các chủng Bacillus nghiên cứu không có khả năng cố định nitơ Kết quả xác định khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng được trình bày trong bảng 10 cho thấy các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu ngoài hoạt tính chính là phân giải hợp chất phosphat khó tan chúng đều có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh héo xanh thực vật. Số liệu nghiên cứu cũng cho thấy ngoài chủng B24 chỉ có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cho cây lạc, các chủng khác đều có khả năng ức chế từ 2 đến 3 loại vi sinh vật gây bệnh trên cà chua và cây lạc. Từ kết quả nghiên cứu nêu trên dự án đã xác định hầu hết các chủng vi khuẩn phân giải lân sử dụng trong nghiên cứu đều thuộc loại đa hoạt tính sinh học với mức độ biểu hiện khác nhau. Chúng không những phân giải lân mà còn có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật, hạn chế vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn. Đây là những ưu điểm của bộ giống vi khuẩn Bacillus phân giải lân sử dụng trong sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng. 18 Bảng 10: Khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh héo xanh thực vật của chủng Bacillus. Đường kính (D-d) ức chế VSV gây bệnh (mm) STT Kí hiệu chủng VK gây bệnh héo xanh cà chua VK gây bệnh héo xanh cây lạc Vi khuẩn gây bệnh héo cây dưa hấu 1 B04 8,2 8,0 8,5 2 B08 4,0 4,0 5,0 3 B10 16,2 15,0 16,0 4 B14 8,2 11,0 8,5 5 B16 30 15,7 5,5 6 B17 2,8 1,4 - 7 B18 17,0 18,0 15,5 8 B24 - 5,0 - 9 B34 3,5 10,0 7,5 d). Các vi sinh vật khác đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây công nghiệp Hoạt tính kháng nấm được xác định trong điều kiện in vitro trên môi trường thạch Waksman. Chủng nấm kiểm định và chủng vi khuẩn nghiên cứu được cấy hai vạch song song trên cùng một đĩa. Bảng 11. Khả năng ức chế F. oxysporum của một số vi sinh vật đối kháng Tên chủng Đường kính vòng đối kháng nấm (D-d cm) H2 2 H3 10 H15 20 H16 19 H13 18 H6 18 TH10 21 H10 17 DC29 22 CC5.10 18 VCM 1158 19 19 Kết quả bảng 11 cho thấy chủng nấm gây bệnh và vi khuẩn đều phát triển tốt trên môi trường WA. Vùng ức chế được xác định sau 3-5 ngày nuôi ở 300C. Sự ức chế được phân biệt rõ bằng sự phát triển hạn chế hoặc hoàn toàn không có hệ sợi nấm trong vùng ức chế gần đường phát triển của vi khuẩn. Các chủng vi sinh vật có mức độ đối kháng Fusarium oxysporum khác nhau, trong đó 9 chủng ký hiệu H15, H16, H13, H6, H10, TH10, DC29, CC5.10, VCM 1158 có hoạt tính ức chế F. oxysporum lớn hơn 17 mm. Kết quả nghiên cứu xác định khả năng đối kháng với cả F.oxysporum và Ralstonia solanacearum cho thấy 4 chủng TH10, DC29, CC5.10 và VCM 1158 có hoạt tính cao trong ức chế cả 2 loại vi sinh vật gây bệnh này (bảng 12) Bảng 12. Khả năng ức chế F. oxysporum và R. solanacearum của một số vi sinh vật đối kháng . Đường kính vòng đối kháng (mm) Kí hiệu chủng R. solanacearum F. oxysporum TH10 12 21 DC29 18 22 CC5.10 15 18 VCM 1158 14 19 1.1.2 Định tên và xác định an toàn sinh học của các vi sinh vật đa hoạt tính. Trên cơ sở kết quả đánh giá hoạt tính sinh học các chủng vi sinh vật được lựa chọn và kết hợp với kết quả nghiên cứu của đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón VSV đa chủng, phân bón chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng cho một số vùng sinh thái” mã số KC 04.04, dự án đã tiến hành xác định tên các chủng vi sinh vật chưa được xác định tên bằng kỹ thuật 16S ARN riboxom, kết quả xác định được tập hợp trong bảng 13. Độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật sử dụng trong đời sống có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học “Vi khuẩn” được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong đó chỉ các vi khuẩn ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất ở điều kiện bình thường. - Cấp độ 1 (Risiko gruppe 1) là các vi khuẩn không có thể gây bất cứ một nguy hiểm nào đối với người và động vật - Cấp độ 2 (Risiko gruppe 2) bao gồm các vi khuẩn có thể gây bệnh đối với người, động vật ở mức độ thấp, không có khả năng lan truyền và có thể phòng, chống và loại trừ dễ dàng trong điều kiện bình thường. 20 - Cấp độ 3 (Risiko gruppe 3) là các vi khuẩn có nguy cơ gây bệnh nặng đối với người, động vật và có khả năng lan truyền rộng, song vẫn có thể phòng chống và loại trừ được. - Cấp độ 4 (Risiko gruppe 4) là các vi khuẩn có thể gây bệnh nặng đối với người, động vật, có nguy cơ lớn về mức độ lan truyền rộng và không thể phòng, chống hoặc loại trừ. Kết quả xác định mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh lựa chọn được tập hợp trong bảng 13. Từ kết quả đánh giá độ an toàn, dự án đã xác định 10 chủng vi sinh vật kí hiệu 70,108, RA18, Ra42.2. B10, B18, B17, B16, DC29, B04 được xếp loại mức độ an toàn cấp 1 và cấp 2 có thể ứng dụng sản xuất trong điều kiện bình thường. Chủng TH10 có hoạt tính sinh học cao, tuy nhiên do mức độ an toàn sinh học được xếp ở cấp độ 3 (nhóm vi sinh vật hạn chế sử dụng), do vậy dự án không sử dụng cho sản xuất phân bón VSV đa chủng, chức năng. Bảng 13. Kết quả xác định tên và mức độ an toàn của các vi sinh vật đa hoạt tính. STT Ký hiệu chủng Tên xác định Mức độ an toàn 1 70 Azotobacter beijerinckii Cấp độ 1 2 108 Azotobacter beijerinckii Cấp độ 1 3 RA18 Bradyrhizobium japonicum Cấp độ 1 4 RA42.2 Bradyrhizobium japonicum Cấp độ 1 5 B10 Bacillus polyfermenticus. Cấp độ 1 6 B14 Bacillus subtilis Cấp độ 1 7 B18 Bacillus subtilis Cấp độ 1 8 B17 Bacillus polyfermenticus. Cấp độ 1 9 B16 Bacillus subtilis Cấp độ 1 10 DC29 Pseudomonas chlororaphis Cấp độ 2 11 TH10 Burkholderia cepacia Cấp độ 3 1.1.3 Nghiên cứu khả năng tổ hợp các vi sinh vật đa hoạt tính. Trên cơ sở tính sinh học, nguồn gốc phân lập và ảnh hưởng đối với cây trồng đã được đánh giá trong khuôn khổ đề tài KC.04.04, dự án đã xác định 21 các tổ hợp vi sinh vật sử dụng cho sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng đối với các loại cây trồng khác nhau (bảng 14) Bảng 14. Tổ hợp vi sinh vật sử dụng cho các loại cây trồng. Đối tượng cây trồng sử dụng Tên vi sinh vật Ký hiệu Hoạt tính sinh học chính Azotobacter beijerinckii 108 CĐNT Bacillus subtilis B10 PGL Bacillus polyfermenticus B16 ĐK VKHX Cây nông nghiệp ngắn ngày Bacillus subtilis B18 PGL Bradyrhizobium japonicum RA18, RA42.2 CĐNT Bacillus polyfermenticus B17 ĐK VKHX Cây họ đậu Bacillus subtilis B18 PGL Azotobacter beijerinckii 70 CĐNT Bacillus subtilis B14 PGL Bacillus polyfermenticus B17 ĐK VKHX Hồ tiêu Bacillus polyfermenticus B10 PGL Azotobacter beijerinckii 108 CĐNT Bacillus subtilis B18 PGL Pseudomonas chlororaphis DC29 ĐK nấm bệnh Cà phê và cây công nghiệp dài ngày khác Bacillus subtilis B14 PGL CĐNT: Cố định nitơ, PGL: phân giải lân; ĐKVKHX: Đối kháng vi khuẩn héo xanh Kết quả đánh giá giá mật độ, hoạt tính sinh học theo thời gian bảo quản của các vi sinh vật đa hoạt tính trong các tổ hợp được trình bày trong bảng 15 và 16. Kết quả tập hợp tại bảng 15 cho thấy, mật độ các chủng vi sinh vật lựa chọn trong điều kiện hỗn hợp và riêng lẻ không có sự sai khác về mật độ. Mật độ được duy trì trong suốt thời gian là 6 tháng bảo quản và đạt >107CFU/g. 22 Bảng 15. Khả năng tồn tại của các vi sinh vật trong điều kiện tổ hợp Mật độ vi sinh vật (CFU/g) sau thời gian bảo quản Chủng vi sinh vật Ký hiệu chủng Công thức nhiễm 0 giờ 10 ngày 6 tháng Bradyrhizobium japonicum RA18 Đơn chủng Hỗn hợp 4,18 x 108 4,21 x 108 5,02 x 108 3,25 x 108 4,30 x 107 3,35 x 107 Bradyrhizobium japonicum RA42.2 Đơn chủng Hỗn hợp 4,15 x 108 3,98 x 108 6,10 x 108 5,34 x 108 5,29 x 107 4,21 x 107 Azotobacter beijerinckii 108 Đơn chủng Hỗn hợp 6,31 x 106 6,45 x 106 4,13 x 107 4,04 x 108 5,67 x 107 5,50 x 107 Azotobacter beijerinckii 70 Đơn chủng Hỗn hợp 7,12 x 106 7,85 x 106 6,85 x 107 6,87 x 108 3,14 x 107 4,00 x 107 Bacillus subtilis B16 Đơn chủng Hỗn hợp 6,55 x 108 6,37 x 108 4,45 x 108 5,74 x 108 6,73 x 107 1,95 x 108 Bacillus subtilis B18 Đơn chủng Hỗn hợp 2,35 x 108 2,30 x 108 4,76 x 108 5,67 x 108 5,10 x 107 4,40 x 107 Bacillus polyfermenticus B17 Đơn chủng Hỗn hợp 7,35 x 108 6,67 x 108 5,57 x 108 4,87 x 108 2,10 x 107 3,40 x 107 Bacillus subtilis B14 Đơn chủng Hỗn hợp 4,46 x 108 3,74 x 108 2,52 x 108 4,22 x 108 2,80 x 108 4,56 x 107 Bacillus polyfermenticus B10 Đơn chủng Hỗn hợp 4,96 x 108 2,92 x 108 4,74 x 108 4,02 x 108 3,68 x 108 6,24 x 107 Pseudomonas chlororaphis DC29 Đơn chủng Hỗn hợp 3,85 x 108 2,90 x 108 3,63 x 108 3,42 x 108 1,50 x 108 5,75 x 107 Kết quả đánhgiá hoạt tính sinh học trong bảng 16 cho thấy, hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật lựa chọn không có sự sai khác ở điều kiện riêng lẻ và hỗn hợp chủng tại thời điểm 0h, 10 ngày và 60 ngày, các chủng vi sinh vẫn giữ được hoạt tính sinh học ban đầu. 23 Bảng 16. Hoạt tính của các vi sinh vật trong điều kiện tổ hợp Hoạt tính của các vi sinh vật (CFU/g) sau thời gian bảo quản Chủng vi sinh vật Ký hiệu chủng Công thức nhiễm 0 giờ 10 ngày 6 tháng Bradyrhizobium japonicum RA18 Đơn chủng Hỗn hợp + + + + Bradyrhizobium japonicum RA42.2 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Azotobacter beijerinckii 108 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Azotobacter beijerinckii 70 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Bacillus subtilis B16 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Bacillus subtilis B18 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Bacillus polyfermenticus B17 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Bacillus subtilis B14 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Bacillus polyfermenticus B10 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Pseudomonas chlororaphis DC29 Đơn chủng Hỗn hợp + + + Ghi chú: (-): không có hoạt tính; (+): Có hoạt tính 1.4.1.Qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật chức năng. 1.1.4.1. Môi trường nhân sinh khối cho Azotobacter. Các loại vi sinh vật khác nhau sử dụng các nguồn Cacbon vô cơ và cacbon hữu cơ không giống nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến mật độ Azotobacter trong quá trình sinh trưởng phát triển được tập hợp trong bảng 17 cho thấy trong môi trường sử dụng rỉ mật Azotobacter sinh trưởng phát triển tốt hơn so sử dụng đường glucoza. Rỉ đường là hỗn hợp các hợp chất đường, nitrogen, các vitamin và các hợp chất vô cơ, trong đó đường có khả năng lên men chiếm trên 50%. Trong rỉ đường ngoài ra còn có nhiều vitamin đặc biệt là biotin và một số vi lượng cần thiết 24 cho sinh trưởng, phát triển của Azotobacter. Kết quả cho thấy có thể sử dụng rỉ mật như một nguồn dinh dưỡng cacbon trong nhân sinh khối Azotobacter. Bảng 17. Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường chứa các nguồn cacbon khác nhau. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi AT* SX1* 0 giờ 5,20 x 106 5,20 x 106 1 ngày 8,50 x 106 1,60 x 107 2 ngày 8,87 x 107 2,90 x 108 3 ngày 2,35 x 108 2,85 x 108 4 ngày 2,16 x 108 2,30 x 108 * Môi trường AT: sử dụng đường glucoza; Môi trường SX1: sử dụng rỉ mật Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sinh trưởng phát triển của chủng Azotobacter trình bày trong bảng 18 cho thấy mặc dầu Azotobacter là loại vi sinh vật cố định nitơ tự do có thể tự tổng hợp nitơ cho nhu cầu của cơ thể từ không khí, song sự phát triển của Azotobacter sẽ mạnh hơn nếu môi trường được bổ sung nitơ. Sau 2 ngày nuôi cấy mật độ Azotobacter đạt 2,55 x 108 CFU/ml môi trường. Bảng 18. Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường chứa các nguồn nitơ khác nhau. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi AT SX2 0 giờ 5,20 x 106 4,00 x 106 1 ngày 8,50 x 106 1,60 x 107 2 ngày 8,87 x 107 2,55 x 108 3 ngày 2,35 x 108 2,35 x 108 4 ngày 2,16 x 108 2,10 x 108 * Môi trường AT: Vô đạm; Môi trường SX2: Bổ sung nước chiết đậu Bột men bia là một sản phẩm phụ trong công nghệ sản xuất bia, nó chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị đối với vi sinh vật, đặc biệt là protein và vitamin. Trong công nghệ lên men, bột men bia được sử dụng như một loại nguyên liệu thay thế để giảm giá thành. Để xác định khả năng sử dụng bột men bia trong sản xuất sinh khối Azotobacter bằng phương pháp lên men chìm, dự án đã tiến hành nghiên cứu khả năng nhân sinh khối chủng Azotobacter trong môi trường có bổ sung bột men bia. 25 Bảng 19. Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường có bổ sung bột men bia. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi AT SX2 SX3* 0 giờ 4,00 x 106 4,00 x 106 4,00 x 106 1 ngày 8,50 x 106 1,60 x 107 3,60 x 107 2 ngày 8,87 x 107 2,55 x 108 3,55 x 108 3 ngày 2,35 x 108 2,35 x 108 2,85 x 108 4 ngày 2,16 x 108 2,10 x 108 2,15 x 108 * Môi trường có chứa bột men bia Bảng số liệu 19 cho thấy bột men bia với liều lượng bằng 1/10 so với đậu trắng đã có tác dụng đến sinh trưởng, phát triển của Azotobacter tốt hơn so với đậu trắng và cao hơn hẳn so với môi trường không bổ sung nguồn nitơ, mật độ tế bào đạt 3,55 x 108 CFU/ml sau 2 ngày nuôi cấy. Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên đề tài đã tổng hợp các thành phần môi trường nhân sinh khối cho Azotobacter và đánh giá khả năng sử dụng môi trường này cho sản xuất sinh khối Azotobacter bằng phương pháp lên men chìm. Kết quả nghiên cứu được tập hợp trong bảng 20 cho thấy trong môi trường có bổ sung rỉ mật và bột men bia Azotobacter phát triển tốt. Mật độ Azotobacter sau 2 ngày nuôi cấy đạt 5,30 x 108 CFU/ml môi trường. Kết quả đánh giá hoạt tính của các chủng Azotobacter nuôi cấy trong các môi trường khác nhau được tập hợp trong bảng 21 cho thấy, Azotobacter trong các môi trường khác nhau vẫn được duy trì hoạt tính sinh học ban đầu (cố định nitơ, kích thích sinh trưởng, sinh polyshacarit, ức chế VKHX). Mức độ hoạt tính sinh học của các chủng Azotobacter trong các môi trường khác nhau vẫn được giữ nguyên hoặc giảm không đáng kể so với nuôi cấy trong môi trường gốc. Bảng 20. Khả năng phát triển của Azotobacter trong môi trường có bổ sung bột men bia và rỉ mật. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi AT SX4* 0 giờ 5,20 x 106 4,37 x 106 1 ngày 8,50 x 106 3,65 x 108 2 ngày 8,87 x 107 5,30 x 108 3 ngày 2,35 x 108 3,21 x 108 4 ngày 2,16 x 108 1,10 x 108 * Môi trường có chứa bột men bia và rỉ mật 26 Bảng 21. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hoạt tính của các chủng Azotobacter. Hoạt tính sinh học Môi trường nuôi cấy Cố định Nitơ (nmol Etylen /ml/ngày) Sinh IAA (µg IAA/ml) Sinh Polyshaca rit (g/l) ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc (vòng vô khuẩn D-d) AT 4281,6 390 353 0,6 SX1 4345,6 430 360 0,6 SX2 4342,0 430 362 0,6 SX3 4325,6 425 355 0,5 SX4 4330,4 428 354 0,6 Từ kết nghiên cứu về môi trường nuôi cấy nêu trên dự án xác định môi trường SX4 phù hợp cho nhân sinh khối Azotobacter. Trong môi trường SX4 Azotobacter đạt mật độ cao nhất sau 2 ngày nuôi. Các hoạt tính sinh học của Azotobacter (cố định nitơ, phân giải lân, sinh tổng hợp IAA và đối kháng vi khuẩn héo xanh) trong môi trường SX4 hầu như không thay đổi so với môi trường vô đạm. 1.1.4.2. Môi trường nhân sinh khối cho Rhizobium. Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của Rhizobium trong môi trường có bổ sung các nguồn đường khác nhau được thể hiện trong bảng 22. Bảng 22. Khả năng phát triển của Bradyrhizobium trong môi trường có chứa các nguồn đường khác nhau. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi YMB SX5 0 giờ 2,58 x 106 2,22 x 106 1 ngày 7,20 x 106 7,23 x 106 2 ngày 2,50 x 107 3,30 x 107 3 ngày 5,20 x 108 1,97 x 108 4 ngày 3,90 x 108 2,55 x 108 5 ngày 5,00 x 108 4,20 x 108 6 ngày 6,92 x 108 6,87 x 108 7 ngày 1,16 x 109 1,16 x 109 8 ngày 1,10 x 109 1,14 x 109 27 SX5: Môi trường chứa Glucosa thay thế cho Manitol Kết quả nghiên cứu cho thấy khi thay thế maniton bằng đường glucoza chủng Rhizobium vẫn sinh trưởng phát triển bình thường. Mật độ chủng Rhizobium trong môi trường mới tại một số thời điểm kiểm tra tuy có thấp hơn so với môi trường YMB, song đến ngày thứ 7 mật độ chủng Rhizobium ở cả hai môi trường là tương đương nhau, đạt1,16 x 109 CFU/ml môi trường. Như vậy có thể sử dụng glucoza thay thế cho maniton, một loại đường hiếm và đắt tiền. Kết quả đánh giá khả năng thay thế cao nấm men bằng bột men bia đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Rhizobium được trình bày trong bảng 23 đã xác định trong môi trường có bổ sung bột men bia mật độ chủng Rhizobium hầu như không có sự sai khác so với môi trường YMB. Bảng 23. Khả năng phát triển của Rhizobium trong môi trường có chứa các nguồn nitơ khác nhau. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi YMB SX6 0 giờ 2,58 x 106 2,12 x 106 1 ngày 7,20 x 106 7,36 x 106 2 ngày 2,50 x 107 2,65 x 107 3 ngày 5,20 x 108 5,17 x 108 4 ngày 3,90 x 108 3,85 x 108 5 ngày 5,00 x 108 5,02 x 108 6 ngày 6,92 x 108 6,97 x 108 7 ngày 1,16 x 109 1,14 x 109 8 ngày 1,10 x 109 1,08 x 109 Từ các kết quả nghiên cứu trên dự án đã tiến hành thí nghiệm với môi trường sản xuất 7, trong đó cao nấm men được thay thế bằng bột men bia và đường maniton được thay thế bằng đường glucoza. Kết quả theo dõi sự sinh trưởng phát triển của Bradyrhizobium trong môi trường SX7 được tập hợp trong bảng 24. Số liệu tập hợp trong bảng 24 cho thấy mật độ chủng Rhizobium đạt cao nhất sau 6 ngày lên nhân sinh khối trong hệ thống lên men chìm có sục khí ở điều kiện nhiệt độ phòng. Trong môi trường SX7 chủng Rhizobium phát triển tốt không thua kém môi trường YMB và đạt mật độ cao nhất sau 6 ngày nuôi cấy (4,07 x 109CFU/ml môi trường). Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên đề tài rút ra kết luận có thể thay thế môi trường nhân sinh khối chủng Rhizobium YMB bằng môi trường SX7, trong đó đường maniton và cao nấm men được thay thế bằng đường glucoza và bột men bia với nồng độ tương đương. 28 Bảng 24. Khả năng phát triển của Bradyrhizobium trong môi trường YMB và môi trường SX 7. Mật độ tế bào (CFU/ml) trong môi trường Thời gian nuôi YMB SX7 0 giờ 5,80 x 106 2,22 x 106 1 ngày 2,18 x 107 1,23 x 107 2 ngày 4,37 x 107 5,30 x 107 3 ngày 1,75 x 108 1,97 x 108 4 ngày 3,12 x 108 3,55 x 108 5 ngày 4,66 x 108 6,20 x 108 6 ngày 3,95 x 109 4,07 x 109 7 ngày 1,09 x 109 1,16 x 109 8 ngày 1,05 x 109 1,10 x 109 Kết quả đánh giá hoạt tính của các chủng Rhizobium được thể hiện trong bảng 25 cho thấy chủng Rhizobium trong các môi trường khác nhau vẫn được duy trì hoạt tính sinh học ban đầu (cố định nitơ). Hoạt tính sinh học của các chủng Rhizobium trong các môi trường khác nhau không có sự sai khác so với nuôi cấy trong môi trường gốc (YMB). Bảng 25. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng cố định nitơ của các chủng Rhizobium. Môi trường nhân sinh khối Khả năng cố định nitơ (nmol C2H4/cây/ngày) YMB 748,0 SX5 738,0 SX6 745,0 SX7 747,0 Từ các kết quả nêu trên dự án rút ra kết luận có thể sử dụng môi trường SX7 cho sản xuất sinh khối Rhizobium trong hệ thống lên men chìm. Với môi trường SX7 mật độ Rhizobium đạt cao, ổn định sau 6 ngày nuôi cấy. Trong 29 môi trường SX7 Rhizobium vẫn giữ được hoạt tính cố định nitơ tương tự trong môi trường YMB 1.1.4.3 Môi trường lên men cho Bacillus phân giải lân. Chủng Bacillus đại diện cho nhóm Bacillus có hoạt tính phân giải hợp chất phosphat khó tan sử dung trong nghiên cứu có kí hiệu B18. Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng B18 trong 3 môi trường sản xuất kí hiệu SX1.1, SX1.2, SX 2 và môi trường nước chiết đậu được trình bày trong bảng 26. Bảng 26. Khả năng sinh trưởng của chủng B18 trên các loại môi trường. Thời gian nuôi cấy Môi trường đậu SX Môi trường SX1.1 Môi trường SX1.2 Môi trường SX2 0h 1,25x106 1,25x106 1,25x106 1,25x106 12h 3,6x108 5,7x109 3,2x109 3,6x109 24h 7,6x109 1,0x1010 5,2x109 8,8x109 36h 1,3x1010 2,06x1010 6,7x109 5,9x109 48 h 5,8x109 1,76x1010 1,17x1010 9,9x109 Khi nhân sinh khối chủng B18 trên các môi trường sản xuất SX1.1, SX1.2, SX 2 cho thấy sau 12h mật độ tế bào cao hơn so với môi trường nước chiết đậu sản xuất. Sau 48 giờ nuôi cấy, mật độ vi khuẩn B18 trong môi trường SX1.1 và SX1.2 đạt mật độ cao hơn so với môi trường SX2 và môi trường nước chiết đậu sản xuất. Như vậy trong quá trình sản xuất chế phẩm vi sinh có thể sử dụng môi trường SX1.1 và môi trường SX1.2 làm môi trường nhân sinh khối cho chủng vi khuẩn phân giải lân B18. Tiến hành xác định hoạt tính phân giải lân và hoạt tính ức chế vi khuẩn và nấm gây bệnh của chủng B18, kết quả thu được không sai khác nhiều trong các điều kiện môi trường sản xuất khác nhau. Kết quả kiểm tra hoạt tính chủng B18 được trình bày trong bảng 27. Bảng 27. Hoạt tính sinh học của chủng B18. Đường kính vòng đối kháng (mm) Môi trường nuôi cấy Đường kính vòng phân giải Ca3(PO4)2 VKHX lạc VKHX cà chua SX1.1 14,8 14,0 13,0 SX1.2 15,0 14,5 14,3 Như vậy các môi trường sản xuất SX1.1; SX1.2 không ảnh hưởng có ý nghĩa đến hoạt tính phân giải lân cũng như hoạt tính ức chế với sinh vật gây 30 bệnh của chủng B18. Thành phần chính môi trường nhân sinh khối vi sinh vật phân giải lân sử dụng trong sản xuất được trình bày trong bảng 28, bảng tổng hợp cho thấy các nguyên liệu sử dụng trong lên men sinh khối vi sinh vật phân giải lân đều có giá thành thấp và sẵn ở Việt Nam. Bảng 28. Thành phần chính môi trường nhân sinh khối vi sinh vật phân giải lân. TT Yếu tố dinh dưỡng Môi trường SX1.1 Môi trường SX1.2 Môi trường SX2 1 Nguồn C Rỉ đường Rỉ đường Saccharosa, glucosa 2 Nguồn N Bột nấm men Bột nấm men Bột nấm men, NH4 3 Khoáng CaCO3 CaCO3 MgSO4, CaCO3 1.1.4.4 Môi trường lên men cho Bacillus đối kháng. Kết quả kiểm tra mật độ tế bào vi sinh vật trên các môi trường lên men vi khuẩn đối kháng vi khuẩn gây bệnh héo xanh được tổng hợp trong bảng 29 cho thấy chủng B16, B17 đều có khả năng sinh trưởng và phát triển rất tốt trên cả 4 loại môi trường thử nghiệm, mật độ tế bào đạt cao tại thời điểm 48 giờ và sau đó tương đối ổn định. Tại thời điểm 48 giờ mật độ cả 2 chủng đều đạt >4x109 CFU/ml. Kết quả này cho thấy các môi trường trên đều phù hợp với quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng B16 và B17. Bảng 29. Phát triển của vi khuẩn đối kháng trong các môi trường khác nhau. Mật độ tế bào (CFU/ml) Kí hiệu chủng Môi trường 0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ SX 1 5,66x104 7,48x107 7,66x108 4,68x109 4,80x109 4,20x109 King B 7,64x104 6,64x107 7,62x108 4,74x109 4,66x109 4,52x109 Nước chiết đậu 6,48x104 5,68x107 6,46x108 5,06x109 5,18x109 4,86x109 B16 SX 2 6,82x104 7,44x107 8,28x108 4,76x109 4,82x109 4,62x109 SX 1 3,84x104 3,76x107 5,86x108 4,34x109 3,48x109 3,52x109 King B 4,26x104 4,84x107 6,76x108 3,32x109 3,56x109 3,44x109 Nước chiết đậu 3,78x104 3,96x107 5,64x108 3,26x109 3,38x109 3,42x109 B17 SX 2 3,26x104 3,80x107 5,28x108 3,44x109 3,52x109 3,64x109 Trong sản xuất công nghiêp việc sử dụng nguyên liệu sẵn có với giá thành thấp có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm chi phí sản xuất. Sau khi 31 đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên 4 loại môi trường, dự án đã lựa chọn môi trường sản xuất SX2 có giá thành rẻ, mật độ tế bào vi sinh vật đạt cao và ổn định. Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh cũng được tiến hành song song với quá trình nhân sinh khối 2 chủng B16 và B17 trên môi trường SX2, kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học được thể hiện trong bảng 30 và 31. Bảng 30. Hoạt tính sinh học của chủng B16 sau lên men trên môi trường SX2. Hoạt tính sinh học Thời gian lên men (giờ) Mật độ tế bào (CFU/g) Đối kháng vi khuẩn héo xanh cà chua (D-d, mm) Sinh tổng hợp IAA (µg/ml) Phân giải Ca3(PO4)2 (D-d, mm) Khả năng cố định nitơ (nmol Etylen/ml/ngày) 0 2,56x105 6 98 11,5 177,3 12 7,24x106 10 103 11,5 189,0 24 5,16x108 21 112 11,5 198,5 36 3,50x109 30 133 11,5 234,2 48 7,35x109 31 132 11,5 229,3 60 7,56x109 31 130 11,5 228,7 Bảng 31. Hoạt tính sinh học của chủng B17 sau lên men trên môi trường SX2. Hoạt tính sinh học Thời gian lên men (giờ) Mật độ tế bào (CFU/g) Đối kháng vi khuẩn héo xanh cà chua (D-d, mm) Sinh tổng hợp IAA (µg/ml) Phân giải Ca3(PO4)2 (D-d, mm) Khả năng cố định nitơ (nmol Etylen/ml/ngày) 0 2,34x105 6 162 4 114,3 12 5,20x106 11 188 4 132,6 24 4,26x108 22 206 4 150,7 36 6,76x109 28 238 4 196,5 48 8,32x109 27 227 4 197,3 60 8,44x109 27 227 4 196,2 Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của chủng B16 và B17 trên môi trường SX2 cho thấy, hoạt tính sinh học của chúng không thay đổi so với môi trường chuẩn. Như vậy đối với nhóm Bacillus đối kháng vi sinh vật gây bệnh héo xanh thực vật, việc sử dụng môi trường SX2 không những đảm bảo về mặt chất lượng mà còn có hiệu quả kinh tế cao do sử dụng nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có. 32 1.1.4.5 Môi trường lên men cho Pseudomonas chlororaphis đối kháng. Chủng Pseudomonas chlororaphis được hoạt hoá, nhân giống cấp 1 trong bình tam giác 100ml (môi trường KingB), sau đó tiến hành lên men cấp 1 với 2 loại môi trường (King B và MT1). Sau các khoảng thời gian nuôi cấy xác định mật độ vi khuẩn. Kết quả được thể hiện trong bảng 32 cho thấy P. chlororaphis phát triển tốt ở cả 2 loại môi trường nghiên cứu. Môi trường King B là môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn Pseudomonas, vì vậy mật độ của P. chlororaphis trong môi trường này cao hơn so với môi trường MT1, song mức độ sai khác không đáng kể. Do vậy môi trường MT1 được xác định cho nhân giống P. chlororaphis Bảng 32. Mật độ P. chlororaphis trong các môi trường nhân giống. Mật độ vi khuẩn(CFU/ml) Thời gian (giờ) KingB MT1 20 1,3.107 3,5.106 25 1,2.108 3,2.107 28 3,9.109 2,4.108 30 4,5.109 3,6.108 35 7,8.109 2,9.109 40 5,6.109 1,3.109 Thành phần môi trường MT1 sử dụng hoá chất tinh khiết và đắt tiền, do vậy dự án tiến hành nghiên cứu tìm thành phần dinh dưỡng thay thế khác có giá trị rẻ hơn và dễ kiếm. Nguyên liệu thay thế và thành phần các môi trường thử nghiệm nhân giống chủng P. chlororaphis được trình bày trong bảng 33. Bảng 33. Thành phần môi trường lên men. Công thức Thành phần CT1 K2O: 1,0gr; P2O5: 0,5gr; MgSO4: 0,2gr; NaCl: 0,2gr; Rỉ đường: 10 ml; CaCl2: 0,1gr; MnSO4:0,001gr; FeSO40,001gr; Tiết động vật 1,0 ml CT2 K2O: 1,0gr; P2O5: 0,5gr; MgSO4: 0,2gr; NaCl: 0,2gr; Rỉ đường: 10ml; CaCl2: 0,1gr; MnSO4:0,001gr; FeSO40,001gr, Urea 0,5gr CT3 K2O: 1,0gr; P2O5:0,5gr; MgSO4: 0,2gr; NaCl: 0,2gr; Rỉ đường: 10ml; CaCl2: 0,1gr; MnSO4:0,001gr; FeSO4:0,001gr; Tiết động vật 2,0ml CT4 K2O: 1,0gr; P2O5: 0,5gr; MgSO4: 0,2gr; NaCl: 0,2gr; Rỉ đường: 10ml; CaCl2: 0,1gr; MnSO4:0,001gr FeSO4:0,001gr ; Urea: 1,0gr 33 Kết quả kiểm tra mật độ vi sinh vật sau 25 h đến 45 h lên men trên các thiết bị lên men được thể hiện ở bảng 34. Kết quả trên bảng 34 cho thấy môi trường CT4 thích hợp hơn cả cho sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn nghiên cứu, sau 35 giờ mật độ tế bào đạt 2,7.108 CFU/ml. Sau 40 giờ nuôi cấy, mật độ vi khuẩn trong tất cả 4 loại môi trường đều có xu hướng giảm. Dựa và kết quả đạt được, dự án đã lựa chọn môi trường CT4 làm môi trường nhân sinh khối cho chủng P. chlororaphis qui mô công nghiệp. Bảng 34. Mật độ vi sinh vật sau các khoảng thời gian lên men. Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) Thời gian (giờ) CT1 CT2 CT3 CT4 25 2,1.106 1,5.106 1,6.106 3,5.106 30 2,5.106 2,2.106 1,9.106 1,6.107 35 6,3.106 1,2.107 1,5.107 2,7.108 40 1,6.106 1,8.107 1,6.107 1,4.108 45 2,6.105 3,9.106 1,2.106 4,4.107 1.1.4.6. Sản xuất sinh khối vi sinh vật đa hoạt tính trên thiết bị lên men chìm. Trên cơ sở các thông số kỹ thuật trong lên men sinh khối các vi sinh vật đa hoạt tính đã được nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài KC.04.04, dự án đã tiến hành nghiên cứu đánh giá và xác định điều kiện tối ưu cho sản xuất sinh khối các vi sinh vật đa hoạt tính trong các nồi lên men dung tích 500lít/nồi. Kết quả nghiên cứu được tổng hợp trong bảng 35. Bảng 35. Điều kiện lên men tối ưu của các vi sinh vật đa hoạt tính trên thiết bị lên men chìm quy mô công nghiệp. Chủng vi sinh vật Thông số kỹ thật Bacillus Rhizobium Pseudomonas Azotobacter Ph 6,5-7,0 6,8 7,0 6,8-7,0 Nhiệt độ lên men (oC) 30±2 30±1 30 28-32 Thời gian lên men (giờ) 36h 120h 35h 48h Tỷ lệ giống gốc (%) 5% 5% 5% 5% Môi trường lên men SX2 SX7 CT4 SX4 0 giờ - 6 giờ 220 220 220 220 6 giờ - 12 giờ 300 300 300 300 Tốc độ cánh khuấy (vòng/phút) 12h giờ - kết thúc 350 350 350 350 Lưu lượng cấp khí (m3 khí/1m3 môi trường) 0,75 0,64 0,75 0,75 34 Kết quả nhân sinh khối vi sinh vật đa hoạt tính bằng phương pháp lên men chìm được tổng hợp trong bảng 35 cho thấy mật độ các vi sinh vật trong dịch lên men đạt 108-109 CFU/ml sau thời gian lên men 35-48 giờ đối với Bacillus, Pseudomonas và Azotobacter. Riêng chủng Rhizobium thời gian nhân sinh khối là 120 giờ. Bảng 36. Mật độ sinh khối các vi sinh vật sau lên men. STT Ký hiệu Tên vi sinh vật Mật độ (CFU/g) 1 70 Azotobacter beijerinckii 5,30 x 108 2 108 Azotobacter beijerinckii 3,21 x 108 3 RA18 Bradyrhizobium japonicum 3,6 x 109 4 RA42.2 Bradyrhizobium japonicum 4,07 x 109 5 B18 Bacillus subtilis 4,76 x 109 6 B17 Bacillus polyfermenticus. 3,44 x 109 7 B16 Bacillus subtilis 5,26 x 109 8 B10 Bacillus polyfermenticus. 4,52 x 109 9 B14 Bacillus subtilis 6,12 x 109 10 DC29 Pseudomonas chlororaphis 2,70 x 109 1.1.4.7 Xử lý nâng cao mật độ vi sinh vật trong sinh khối sau lên men. Dịch vi sinh vật sau nhân sinh khối trên thiết bị lên men chìm được đưa vào máy ly tâm liên tục (separator) để tách nước tự do. Vận tốc ly tâm ban đầu là 15000 vòng/ phút sau đó tăng từ từ để đạt vận tốc 20000 vòng/phút. Mật độ tế bào vi sinh vật sau ly tâm được xác định thông qua phương pháp nuôi cấy pha loãng, kết quả cho thấy mật độ vi sinh vật trong sinh khối vi sinh vật đã tăng 10 đến 100 lần. Kết quả nghiên cứu này đã mở ra triển vọng tạo chế phẩm vi sinh vật đa chủng chức năng đậm đặc với mật độ vi sinh vật hữu ích cao hơn hẳn chế phẩm truyền thống sản xuất trên cơ sở phối trộn sinh khối vi sinh vật sau lên men với chất mang đã xử lý. Số liệu nghiên cứu được tập hợp trong bảng 37. 35 Bảng 37. Mật độ sinh khối các vi sinh vật sau ly tâm. STT Ký hiệu Tên vi sinh vật Mật độ (CFU/g) 1 70 Azotobacter beijerinckii 6,30 x 109 2 108 Azotobacter beijerinckii 7,21 x 109 3 RA18 Bradyrhizobium japonicum 1,16 x 1010 4 RA42.2 Bradyrhizobium japonicum 2,07 x 1010 5 B10 Bacillus polyfermenticus. 6,58 x 1010 6 B18 Bacillus subtilis 8,32 x 1010 7 B17 Bacillus polyfermenticus. 6,24 x 1010 8 B16 Bacillus subtilis 8,32 x 1010 9 B14 Bacillus subtilis 8,32 x 1010 10 DC29 Pseudomonas chlororaphis 6,670 x 1010 1.1.4.8. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật chức năng đậm đặc. Từ các kết quả nghiên cứu hoàn thiện ở trên kết hợp với các kết quả nghiên cứu trong khuôn khổ đề tài KC04.04 về chất mang cho sản xuất phân vi sinh vật đa chủng chức năng (VSVĐCCN), dự án đã tiến hành sản xuất thử nghiệm chế phẩm VSVĐCCN đậm đặc. Kết quả kiểm tra chất lượng chế phẩm được tập hợp trong bảng 38 đã xác định chế phẩm có chất lượng cao hơn yêu cầu về chế phẩm phân bón vi sinh vật được qui định trong TCVN. Với qui trình đã hoàn thiện, dự án tổ chức sản xuất chế VSVĐCCN đậm đặc và phối hợp với 3 công ty sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng (HCVSVĐCCN) với số lượng khoảng 8000 tấn, trong đó chế phẩm được sử dụng với liều lượng 1kg/1tấn nguyên liệu hữu cơ. Sản phẩm phân HCVSVĐCCN được sử dụng tại nhiều địa phương trong cả nước và được người nông dân đánh giá cao. Kết quả khảo nghiệm hiệu lực của phân HCVSVĐCCN sản xuất trên nền hữu cơ đã xử lý và chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng đậm đặc được trình bày chi tiết trong mục 1.2.3. Kết quả đánh giá hiệu quả phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng đối với cây trồng. 36 Bảng 38. Mật độ các nhóm vi sinh vật chính chứa trong chế phẩm VSVĐCCN đậm đặc. Nhóm vi sinh vật Đơn vị đo Mật độ 1. Chế phẩm sử dụng cho cây bộ đậu. Vi khuẩn nốt sần. CFU/g 4,98 x 109 Vi sinh vật phân giải lân. CFU/g 5,23 x 109 Vi sinh vật đối kháng vi khuẩn héo xanh CFU/g 3,96 x 109 2.Chế phẩm sử dụng cho khoai tây, dưa. Nhóm vi sinh vật Đơn vị đo Mật độ Vi khuẩn cố định nitơ CFU/g 5,03 x 109 Vi sinh vật phân giải lân CFU/g 5,71 x 109 Vi sinh vật đối kháng vi khuẩn héo xanh CFU/g 4,21 x 109 3. Chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho cây lâu năm. Vi khuẩn cố định nitơ CFU/g 5,15 x 109 Vi sinh vật phân giải lân CFU/g 5,33 x 109 Vi sinh vật đối kháng F.Oxysporum CFU/g 3,78 x 109 1.1.4.9. Tổng hợp quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm quy mô công nghiệp. Trên cơ sở kết quả hoàn thiện công nghệ về đánh giá tuyển chọn bộ giống vi sinh vật đa hoạt tính sinh học, nghiên cứu môi trường lên men phù hợp, nghiên cứu bổ sung điều kiện lên men tối ưu trên thiết bị lên men chìm, kỹ thuật xử lý sinh khối sau lên men nhằm tạo chế phẩm VSVĐCCN (có mật độ vi sinh vật hữu ích cao) và kế thừa các kết quả đã được của đề tài KHCN cấp Nhà nước KC.04.04 giai đoạn 2001-2005, dự án đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSVĐCCN đậm đặc. Quy trình công nghệ được tóm tắt trong sơ đồ 1 và chi tiết hoá trong: Sản phẩm của Khoa học công nghệ của Dự án – Qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng đậm đặc. 37 Sơ đồ 1. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật đa chủng, chức năng chất lượng cao trên thiết bị lên men chìm quy mô công nghiệp. Chất mang Kiểm tra hoạt tính Kiểm tra hoạt tính Kiểm tra hoạt tính Nhân giống cấp I Nhân giống cấp I Nhân giống cấp I Nhân giống cấp II Nhân giống cấp II Nhân giống cấp II Xử lý sinh khối Xử lý sinh khối Xử lý sinh khối Phối trộn Xử lý chất mang Kiểm tra chất lượng Bao gói Bảo quản sử dụng Giống gốc VSV cố định nitơ Giống gốc VSV phân giải lân Giống gốc VSV ĐK vi sinh vật gây bệnh 38 1.2. Qui trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng 1.2.1. Xử lý nguyên liệu hữu cơ làm cơ chất cho phân HCVSVĐCCN Men ủ vi sinh vật là kết quả nghiên cứu của đề tài khoa học cấp Nhà nước KC.04.04 đã được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị công nhận là tiến bộ kỹ thuật và khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất. Với mục đích sử dụng có hiệu quả chế phẩm trong chế biến nguyên liệu hữu cơ làm cơ chất cho sản xuất phân HCVSVĐCCN, dự án đã tiến hành nghiên cứu, đánh giá các yếu ảnh hưởng đến quá trình ủ để từ đó xây dựng qui trình xử lý nguyên liệu hữu cơ cho sản xuất phân HCVSVĐCCN. Kết quả nghiên cứu chính được tổng hợp như sau: a). Nhiệt độ ban đầu của khối ủ Thí nghiệm được tiến hành với độ ẩm nguyên liệu là 50% và nhiệt độ khởi điểm là 20 và 300 C. Cứ sau 2 ngày đo nhiệt độ khối ủ và đếm số lượng VSV hiếu khí phân giải xenluloza. Kết quả kiểm tra trong bảng 39 cho thấy ở nhiệt độ ban đầu 30oC nhiệt độ khối ủ tăng nhanh cùng với sự gia tăng của vi sinh vật hiếu khí. Bảng 39. Biến động nhiệt độ và mật độ VSV hiếu khí phân giải xenluloza ở các nhiệt độ ban đầu khác nhau Nhiệt độ (oC) trong khối ủ với nhiệt độ ban đầu Mật độ VSV hiếu khí (CFU/g) trong khối ủ với nhiệt độ ban đầu Ngày Nhiệt độ môi trường ( 0C ) 20oC 30oC 20oC 30oC 0 31 20 30 65x107 65x107 2 28 36 48 84x107 95x107 4 26 46 55 95x107 115x107 6 30 52 57 100x107 120x107 8 32 55 65 110x107 145x107 10 29 60 60 120x107 130x107 12 33 36 35 90x107 110x107 14 35 35 35 70x107 70x107 b). Nguồn dinh dưỡng cacbon Để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của cho các vi sinh vật khởi động trong khối ủ, dự án đã bổ xung rỉ đường với các nồng độ khác nhau. Tiến hành đánh giá số lượng vi sinh vật phân giải xenlulo hiếu khí sau thời gian ủ 3 ngày. 39 Bảng 40. Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ mật đến quần thể vi sinh vật trong cơ chất Mật độ tế bào sau 3 ngày ủ (CFU/ml) Tỷ lệ rỉ đường (%) Vi khuẩn phân giải xenlulo Xạ khuẩn phân giải xenlulo Nấm mốc Nấm men VSV tổng số 0,1 2,2× 109 2,9× 109 3,3× 108 3,6× 107 5,5× 109 0,3 7,8× 109 6,5× 109 9,2× 108 7,5× 107 1,40× 1010 0,5 8,5× 109 7,8× 109 7,1× 108 8,2× 107 1,50× 1010 1,0 8,2× 109 6,8× 109 8,8× 108 7,7× 107 1,51× 1010 Kết quả tập hợp trong bảng 40 cho thấy với nồng độ rỉ đường tăng từ 0,1-0,5% mật độ vi sinh vật tăng theo, tuy nhiên khi tăng nồng độ rỉ mật ≥ 0,5% sự sai khác về mật độ vi sinh vật trong đống ủ là không đáng kể. Mật độ vi sinh vật phân giải xenlulo hiếu khí và mật độ xạ khuẩn trong công thức 0,3 và 0,5% rỉ mật gần tương đương nhau. c). Lượng men ủ Để xác định lượng men ủ phù hợp cho quá trình xử lý nguyên liệu đề tài đã tiến hành thí nghiệm với số lượng men ủ khác nhau trên cùng một cơ chất. Sau thời gian ủ 3 ngày tiến hành lấy mẫu và phân tích mật độ các nhóm vi sinh vật có trong khối ủ. Kết quả nghiên cứu được tổng hợp trong bảng 41. Qua số liệu bảng 41 có thể nhận thấy số lượng vi sinh vật phân giải xenlulo hiếu khí trong khối ủ tăng khi số lượng men ủ sử dụng tăng, tuy nhiên mức tăng của vi sinh vật trong khối ủ cũng không tỷ lệ thuận với số lượng men ủ sử dụng. Với tỷ lệ men ủ lớn hơn 0,3% mức độ tăng của vi sinh vật hiếu khí trong khối ủ không rõ so với số lượng men ủ sử dụng là 0,3%. Xạ khuẩn, nhóm vi sinh vật chính trong men ủ đạt mật độ cao nhất ở nồng độ men khởi động 0,3%, song sự chênh lệch về mật độ xạ khuẩn ở các tỷ lệ men ủ 0,2; 0,3 và 0,4% gần như không nhận thấy. Bảng 41: Ảnh hưởng của tỷ lệ men khác nhau đến quần thể vi sinh vật trong cơ chất hữu cơ sau 3 ngày ủ. Số lượng tế bào (CFU/g) Tỷ lệ men ủ (%) Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Nấm men Tổng số 0,1 2,1× 109 2,9× 109 1,8× 108 2,0× 107 4,8× 109 0,2 4,2× 109 6,8× 109 3,8× 108 3,2× 107 1,20× 1010 0,3 7,5× 109 7,2× 109 8,7× 108 7,9× 107 1,50× 1010 0,4 7,8× 109 6,9× 109 7,9× 108 9,2× 107 1,56× 1010 40 d). Độ ẩm của nguyên liệu. Nguyên liệu xử lý làm cơ chất hữu cơ cho phân bón hữu cơ vi sinh vật chức năng được điều chỉnh ở các độ ẩm khác nhau trước khi ủ. Trong thời gian 3 ngày đầu sau khi ủ tiến hành lấy mẫu và kiểm tra mật độ các vi sinh vật phân giải xenlulo hiếu khí. Kết quả tập hợp trong bảng 42 cho thấy mật độ xạ khuẩn và vi nấm tăng dần từ nguyên liệu có độ ẩm 25% đến độ ẩm 40% sau đó giảm dần, trong khi ở độ ẩm 35% đến 60% mật độ nấm men và vi khuẩn không có sự biến động đáng kể. Bảng 42. Biến động của vi sinh vật trong khối ủ có độ ẩm khác nhau. Số lượng tế bào (CFU/g) Độ ẩm (%) Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Nấm men Tổng số 25 1,3× 109 4,7× 109 5,9× 107 6,6× 107 5,0× 109 30 2,2× 109 5,9× 109 6,0× 109 7,2× 107 7,1× 109 35 3,1× 109 7,8× 109 6,5× 109 7,1× 107 1,18× 1010 40 4,5× 109 8,3× 109 7,0× 109 7,0× 107 1,20× 1010 45 5,0× 109 7,6× 109 6,6× 109 6,8× 107 1,29× 1010 50 4,8× 109 4,3× 109 5,2× 109 7,2× 107 7,5× 109 55 3,5× 109 4,5× 109 4,2× 109 6,7× 107 6,0× 109 60 2,5× 109 4,2× 109 2,3× 109 6,8× 107 5,5× 109 e). Thời gian ủ. Để xác định thời gian xử lý cơ chất hữu cơ làm nguyên liệu cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật chức năng dự án đã tiến hành xác định mật độ các nhóm vi sinh vật trong khối ủ ở các thời điểm khác nhau trong điều kiện có đảo trộn. Nguyên liệu được ủ trong các đống có độ dày 40cm. Sau 3 ngày đảo trộn 1 lần. Kết quả theo dõi nhiệt độ và mật độ các nhóm vi sinh vật được tập hợp trong bảng 43. Khi nhiệt độ khối ủ tăng, mật độ xạ khuẩn đồng thời cũng tăng theo và đạt mức cao nhất ở mức 109 CFU/g, trong khi mật độ nấm mốc, nấm men và vi khuẩn chỉ tăng khi nhiệt độ khối ủ không vượt quá 55oC. Sau khi nhiệt độ vượt quá mức 60oC mật độ vi khuẩn, nấm mốc và nấm men đều giảm hẳn. 41 Bảng 43. Biến động mật độ vi sinh vật theo thời gian ủ. Số lượng tế bào (CFU/g) Thời gian (ngày) Nhiệt độ (oC) Vi khuẩn Xạ khuẩn Nấm mốc Nấm men 1 40 9,6× 107 9,9× 107 4,8× 106 6,8× 107 2 55 4,5× 107 1,50× 108 6,5× 106 1,6× 107 3 75 3,4× 107 1,21× 108 2,1× 106 1,2× 107 4 47 9,6× 107 9,8× 107 5,2× 106 3,2× 107 5 56 4,1× 107 1,27× 108 4,6× 106 1,7× 107 6 65 - 8,8× 107 - - 7 42 - 4,0× 107 - - 8 35 - 3,0× 107 - - (-): không phát hiện ở nồng độ pha loãng10-1 Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên dự án đã tiến hành chế biến thử nghiệm cơ chất hữu cơ cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật chức năng. Số liệu bảng 44 cho thấy sau thời gian ủ 1-2 ngày nhiệt độ khối ủ bắt đầu tăng và đạt nhiệt độ cực đại sau 3 ngày, trong đó công thức sử dụng phân gà có tốc độ tăng nhiệt độ và nhiệt độ tối đa (72oC) cao hơn công thức sử dụng than bùn (60oC). Sự tăng nhiệt độ khối ủ có tác dụng tăng cường các phản ứng hoá học xảy ra trong quá trình ủ, kích thích sự hoạt động của vi sinh vật ưa nhiệt đồng thời tiêu diệt các vi sinh vật không có lợi chứa trong nguyên liệu ủ. Nhiệt độ khối ủ không có sự thay đổi với môi trường bên ngoài được xác định là 7 ngày đối với phân gà và 15 ngày đối với than bùn. Bảng 44. Kết qủa theo dõi biến động nhiệt độ trong quá trình chế biến cơ chất hữu cơ. Nhiệt độ (0C) cao nhất Cơ chất sử dụng Môi trường Đối chứng Thí nghiệm Thời gian ủ chín (ngày) Than bùn 32 35 60 15 Phân gà 32 55 72 7 Sự thay đổi tính chất lý, hoá học của các nguồn nguyên liệu trước và sau khi ủ được trình bày trong bảng 45. Kết quả cho thấy hàm lượng cacbon tổng 42 số của tất cả các nguyên liệu khi sử dụng kỹ thuật ủ mới giảm có ý nghĩa so với đối chứng không. Hàm lượng N tổng số, P tổng số và K tổng số có sự thay đổi chút ít so với đối chứng do hàm lượng cacbon tổng số giảm thông qua hoạt động của vi sinh vật . Bảng 45. Thành phần hoá học của cơ chất trước và sau khi ủ. Thành phần hoá học (%) Loại cơ chất Hữu cơ N P2O5 K2O Than bùn - Trước khi ủ - Sau khi ủ 39,96 24,27 0,96 1,05 0,40 0,46 0,30 0,35 Phân gà - Trước khi ủ - Sau khi ủ 43,70 31.05 1,27 1,51 1,39 1,48 1,35 1,55 Đánh giá cảm quan cho thấy sử dụng men ủ vi sinh vật cơ chất giàu hợp chất cacbon chuyển hoá màu và dễ bị mủn, đặc biệt khử được mùi khó chịu của cơ chất (bảng 46). Bảng 46. Tính chất cảm quan của nguyên liệu trong quá trình ủ. Chỉ tiêu đánh giá Phân gà Than bùn Thành phần cơ giới: - Trước khi ủ - Đối chứng - Thí nghiệm Bết, không xốp Bết, không xốp Tơi xốp Bết, không xốp Bết, không xốp Tơi xốp Màu sắc - Trước khi ủ - Đối chứng - Thí nghiệm đen đen đen sáng Nâu Nâu Nâu đen Mùi - Trước khi ủ - Đối chứng - Thí nghiệm Mùi hôi Mùi hôi Không còn mùi - - 43 Cơ chất giàu cacbon sau khi xử lý được đánh giá về độ hoai mục và độ an toàn đối với cây trồng. Số liệu nghiên cứu trong bảng 47 cho thấy các nguyên liệu hữu cơ sau khỉ xử lý bằng phương pháp ủ cải tiến đều có thể sử dụng làm cơ chất trồng cây. Bảng 47. Khả năng sử dụng phế thải giàu hợp chất cacbon sau xử lý làm cơ chất trồng cây Trọng lượng rau cải (g/chậu) Loại phế thải/ nguyên liệu Đối chứng Thí nghiệm Than bùn 60 95 Phân gà Không mọc 125 Từ các kết quả nghiên cứu nêu trên dự án đã tập hợp thành qui trình chế biến nguyên liệu, phế thải hữu cơ làm cơ chất cho phân bón hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng và được tóm tắt trong sơ đồ 2. Sơ đồ 2: Qui trình xử lý nguyên liệu, phế thải hữu cơ làm cơ chất cho phân bón hữu cơ vi sinh vật đa chủng, chức năng. Nguyên liệu hữu cơ Rỉ mật Men ủ vi sinh Dinh dưỡng khoáng cho VSV Phối trộn Ủ hoạt hoá Xử lí thô (nghiền, sàng, loại bỏ tạp chất...) Cơ chất hữu cơ 44 1.2.2 Sản xuất phânHCVSVĐCCN trên cơ sở nguyên liệu hữu cơ đã xử lý và chế phẩm VSVCN đậm đặc. Với mục tiêu sản xuất sản phẩm phân VSVĐCCN đảm bảo chất lượng trên cơ sở chế phẩm đậm đặc và cơ chất đã xử lý, dự án đã triển khai nghiên cứu về tỷ lệ phối trộn chế phẩm vi sinh vật đậm đặc và cơ chất hữu cơ, đánh giá chất lượng sản phẩm tạo ra theo thời gian bảo quản và nghiên cứu hiệu lực của phân HCVSVĐCCN đối với một số cây trồng ở các vùng sinh thái khác nhau. Kết quả phân tích mật độ các nhóm vi sinh vật trong sản phẩm trong 15 ngày đầu sản xuất được tập hợp trong bảng 48. Bảng 48. Mật độ vi sinh vật trong phân HCVSVĐCCN sử dụng cho khoai tây. Mật độ (CFU/g) tại thời điểm sau sản xuất (ngày) Tỷ lệ chế phẩm VSVCN và cơ chất hữu cơ Nhóm Vi sinh vật 0 7 14 VSVCĐN tự do 6,25x106 7,25x106 7,17x106 VSVPGL 9,25x106 2,15x107 2,02x107 1:1000 VSVĐK vi khuẩn héo xanh 7,25x105 5,25x106 5,07x106 VSVCĐN tự do 8,17x106 7,25x106 7,91x106 VSVPGL 9,32x106 2,41x107 2,78x107 2:1000 VSVĐK vi khuẩn héo xanh 8,21x106 9,95x106 9,61x106 VSVCĐN tự do 7,17x106 9,25x106 9,31x106 VSVPGL 9,02x106 1,41x107 3,98x107 5:1000 VSVĐK vi khuẩn héo xanh 7,81x106 9,72x106 9,66x106 Kết quả đánh giá chất lượng phân HCVSVĐCCN được tập hợp trong bảng 48 cho thấy mật độ các vi sinh vật chức năng trong sản phẩm được phối trộn với các tỷ lệ chế phẩm vi sinh vật chức năng khác nhau không có sự sai khác đáng kể. Mật độ vi sinh vật dao động trong khoảng từ 5,07x106 đến 3,98x107 vi sinh vật/g phân bón. Theo tiêu chuẩn TCVN 7185-2002 về phân bón hữu cơ vi sinh vật, các sản phẩm thuộc loại này đều phải có mật độ các vi sinh vật có ích ( cố định đạm, phân giải hợp chất photpho khó tan...) ≥ 106. Như vậy để bảo đảm tiêu chuẩn Việt Nam về phân bón hữu cơ vi sinh vật chỉ cần phối trộn chế phẩm vi sinh vật chức năng với cơ chất hữu cơ đã xử lý theo tỷ lệ 1/1000. Phân HCVSVĐCCN được bảo quản ở điều kiện phòng trong thời gian 6 tháng. Kết quả theo dõi biến động của các nhóm vi sinh vật trong sản phẩm được tập hợp trong bảng 49. Kết quả nghiên cứu cho thấy mật độ các vi sinh 45 vật chức năng sau 6 tháng bảo quản có giảm đi chút ít so với mật độ ban đầu (sau khi sản xuất 15 ngày). Tuy nhiên so với TCVN về phân bón vi sinh vật, sản phẩm vẫn đạt yêu cầu chất lượng. Mật độ các nhóm vi sinh vật chức năng tại thời điểm này dao động trong khoảng 1,01 x 106 đến 6,05 x 106 CFU/g phân bón. Bảng 49. Sự biến động của các nhóm vi sinh vật chức năng trong phân HCVSVĐCCN sử dụng cho khoai tây. Kết quả phân tích sau bảo quản Nhóm vi sinh vật Đơn vị đo 2 tháng 4 tháng 6 tháng Vi sinh vật tổng số CFU/g 2,12 x 107 1,02 x 107 6,05 x 106 VSV cố định nitơ CFU/g 4,21 x 106 2,11 x 106 1,01 x 106 VSV phân giải lân CFU/g 1,39 x 107 8,23 x 106 4,42 x 106 VSV đối kháng vi khuẩn héo xanh CFU/g 2,23 x 106 1,67 x 106 1,03 x 106 Trong quá trình bảo quản dự án đã tiến hành kiểm tra các đặc điểm hoá và lý học khác của sản phẩm. Kết quả phân tích được tập hợp trong bảng 50 cho thấy tỷ lệ các chất dinh dưỡng chứa trong sản phẩm hầu như không có sự biến động. Độ ẩm của sản phẩm có dấu hiệu giảm hơn so với ban đầu, xong ở mức độ không đáng kể. Bảng 50. Sự biến động các đặc điểm lý, hoá học của phân HCVSVĐCCN sử dụng cho khoai tây. Kết quả phân tích sau bảo quản Chỉ tiêu chất lượng Đơn vị đo 2 tháng 4 tháng 6 tháng pH 7,0 7,0 7,0 Độ ẩm % 30,5 29,89 29,50 Hữu cơ tổng số % 16,01 16,02 16,00 N tổng số % 1,01 1,02 1,03 P2O5 hữu hiệu % 1,05 1,03 1,04 K2O % 1,07 1,06 1,06 Từ kết quả sản xuất thử nghiệm với sản phẩm phân HCVSVĐCCN sử dụng cho khoai tây dự án đã tiến hành các sản xuất thử nghiệm với sản phẩm sử dụng cho hồ tiêu, cây công nghiệp và cây bộ đậu. Kết quả tương tự như sản phẩm sử dụng cho khoai tây được xác định đối với sản phẩm sử dụng cho hồ tiêu và cây công nghiệp (bảng 51). 46 Bảng 51. Chất lượng phân HCVSVĐCCN sử dụng cho cây công nghiệp. Kết quả phân tích sau bảo quản Chỉ tiêu chất lượng Đơn vị đo 2 tháng 4 tháng 6 tháng PH 7,0 7,0 7,0 Độ ẩm % 31,5 30,89 31,00 Hữu cơ tổng số % 16,61 16,57 16,49 N tổng số % 1,04 1,03 1,03 P2O5 hữu hiệu % 1,05 1,04 1,04 K2O % 1,15 1,14 1,16 VSV cố định nitơ CFU/g 4,21 x 106 2,31 x 106 1,21 x 106 VSV phân giải lân CFU/g 1,49 x 107 6,13 x 106 3,32 x 106 VSV đối kháng F. oxysporum CFU/g 2,33 x 106 1,27 x 106 1,05 x 106 Trong sản phẩm phân HCVSVĐCCN sử dụng cho cây bộ đậu, sau thời gian bảo quản 2 tháng mật độ vi khuẩn nốt sần giảm hẳn và không thể phát hiện được ở độ pha loãng 10-2 sau tháng thứ 4 (bảng 52). Do vi khuẩn nốt sần là loại vi sinh vật không sinh nha bào hoặc bào tử nên đề tài chỉ xác định mật độ vi khuẩn nốt sần trong phân HCVSVĐCCN sử dụng cho cây bộ đậu trong thời gian bảo quản 2 tháng. Sản phẩm loại này không bảo đảm mật độ vi khuẩn nốt sần sau thời gian bảo quản 2 tháng Bảng 52. Chất lượng phân HCVSVĐCCN sử dụng cho lạc. Kết quả phân tích sau bảo quản Chỉ tiêu chất lượng Đơn vị đo 2 tháng 4 tháng 6 tháng PH 7,0 7,0 7,0 Độ ẩm % 29,5 29,49 29,2 Hữu cơ tổng số % 16,81 16,67 16,72 N tổng số % 1,01 1,02 1,01 P2O5 hữu hiệu % 1,00 1,01 1,00 K2O % 1,05 1,04 1,04 VSV cố định nitơ CFU/g 4,21 x 106 - - VSV phân giải lân CFU/g 1,09 x 107 7,11 x 106 2,21 x 106 VSV đối kháng VKHX CFU/g 2,00 x 106 1,31 x 106 1,02 x 106 1.2.3. Hiệu quả phân HCVSVĐCCN đối với cây trồng. 1.2.3.1. Cà chua. 47 Thử nghiệm trên cà chua được thực hiện với 2 loại đất. Đối với giống cà chua Trang Nông F1 được tiến hành tại huyện Mê Linh - Vĩnh phúc, giống cà chua Ấn Độ được tiến hành tại huyện Ý Yên – Nam Định. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của phân HCVSVĐCCN tập hợp tại bảng 53 và bảng 54 cho thấy, số quả trung bình/cây và P trung bình quả cà chua tại các công thức thí nghiệm có sử dụng phân HCVSVCN đều cao hơn so với công thức đối chứng. Số lượng quả/cây ở công thức đối chứng chỉ đạt 15,20 quả/cây (thí nghiệm tại Mê Linh – Vĩnh Phúc)và 15,5 quả/cây tại Ý Yên – Nam Định, trong khi đó các công thức có sử dụng phân HCVSVCN đạt số quả trung bình đạt cao nhất ở công thức 2 là 17,15 quả/cây. Các công thức có sử dụng phân HCVSVĐCCN và giảm lượng phân khoáng - công thức 3 (giảm 20% lượng phân khoáng NP) đạt số quả/cây là 16,83, công thức 4 (giảm 30% lượng phân khoáng NP) cho số quả/cây đạt 16,00 đều cao hơn so với công thức đối chứng. Về trọng lượng quả, ở cả ba công thức có sử dụng phân HCVSVĐCCN đều cao hơn so với canh tác bình thường của nông dân. Số liệu thử nghiệm tại Mê Linh – Vĩnh Phúc cho thấy năng suất của cà chua ở công thức đối chứng là 16,57 tấn/ha/vụ. Công thức 2 cho năng suất cà chua 19,47 tấn/ha/vụ tăng 17,50% so với đối chứng. Công thức 3 giảm 20% lượng phân bón NP cho năng suất là 18,28 tấn/ha, cao hơn với công thức đối chứng là 1,71 tấn/ha tương đương với tỷ lệ tăng là 10,32%. Công thức 4 giảm 30% lượng phân bón NP cho năng suất là 17,51 tấn/ha, cao hơn so với công thức đối chứng là 0,94 tấn/ha tương đương với tỷ lệ tăng là 5,67%. Bảng 53. Hiệu quả của phân HCVSVĐCCN đến cà chua taị Vĩnh Phúc. Tăng so với ĐC Công thức Số quả trung bình (quả/cây) P trung bình quả (g/quả) Năng suất (tấn/ha) tấn/ha % CT1= ĐC: Nền NPK (120-70-90) + 20 tấn PC 15,20 47,51 16,57 - - CT2: Nền NPK + 2 tấn phân HCVSVĐCCN 17,15 50,35 19,47 2,90 17,50 CT3: 80% nền NPK +2 tấn phân HCVSVĐCCN 16,83 49,27 18,28ns 1,71 10,32 CT4: 70% nền NPK +2 tấn phân HCVSVĐCCN 16,00 48,06 17,51ns 0,94 5,67 CV(%) 7,10 LSD 0,05 2,4 Số liệu thử nghiệm tại Ý Yên – Nam Định cho thấy năng suất của cà chua ở công thức đối chứng là 16,85 tấn/ha, trong khi công thức 2 , 3 và 4 cho năng suất cà chua lần lượt là 19,50 tấn/ha, 18,89 tấn/ha và 18,35 tấn/ha cao 48 hơn so với công thức đối chứng là 2,65 tấn/ha, 1,71 tấn/ha và 1,50 tấn/ha tương đương với tỷ lệ tăng năng suất tương ứng là 15,73%, 12,11% và 8,90%. Bảng 54. Hiệu quả của phân HCVSVĐCCN đến cà chua tại Nam Định. Tăng so với ĐC Công thức Số quả trung bình (quả/cây) P trung bình quả (g/quả) Năng suất (tấn/ha) tấn/ha % CT1= ĐC: Nền NPK (120-70-90) + 20 t PC 15,5 50,2 16,85 - - CT2: Nền NPK + 2 t phân HCVSVĐCCN 17,9 51,1 19,50 2,65 15,73 CT3: 80% nền NPK +2 t phân HCVSVĐCCN 16,8 50,9 18,89ns 2,04 12,11 CT4: 70% nền NPK +2 t phân HCVSVĐCCN 16,5 50,7 18,35ns 1,50 8,90 CV(%) 7,5 LSD 0,05 2,6 Kết quả theo dõi tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn đối với cà chua được tổng hợp trong bảng 55 và 56. Tại Vĩnh Phúc công thức đối chứng có tỷ lệ bệnh héo xanh là 5,75%, trong khi tỷ lệ bệnh héo xanh ở các công thức sử dụng phân HCVSVĐCCN - công thức 2, 3 và 4 lần lượt là 1,02%, 1,21% và 1,23% tương đương với mức độ giảm bệnh héo xanh là 82,61%, 79,13% và 78,61%. Như vậy phân HCVSVĐCCN đã thể hiện được khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây cà chua. Bảng 55. Hiệu quả của phân HCVSVĐCCN đến khả năng hạn chế bệnh HXVK đối với giống cà chua Trang Nông F1 tại Vĩnh Phúc. Công thức thí nghiệm Tỷ lệ bệnh héo xanh (%) Mức độ giảm bệnh so với ĐC (%) CT1= ĐC: Nền NPK (120-70-90) + 20 tấn PC 5,75 - CT2: Nền NPK + 2 t phân HCVSVĐCCN 1,02 82,26 CT3: 80% nền NPK +2 t phân HCVSVĐCCN 1,21 78,96 CT4: 70% nền NPK +2 t phân HCVSVĐCCN 1,23 78,7 Kết quả thí nghiệm tại Ý Yên – Nam Định thể hiện trong bảng 56 cho thấy, trong khi tỷ lệ bệnh héo xanh ở công thức đối chứng là 3,21%, thì tỷ lệ 49 này ở các công thức sử dụng phân HCVSVĐCCN là 0% (công thức 2) và 1% (công thức 3), tương dương với mức độ giảm bệnh là 68,85-100 %. Công thức 4 có tỷ lệ bị bệnh héo xanh là 1,05% tương đương với mức độ giảm bệnh héo xanh là 67,29%. Bảng 56. Hiệu quả của phân HCVSVĐCCN đến khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn đối với giống cà chua Ấn Độ tại Nam Định. Công thức thí nghiệm Tỷ lệ bệnh héo xanh (%) Mức độ giảm bệnh so với ĐC (%) CT1= ĐC: Nền NPK (120-70-90) + 20 tấn PC 3,21 - CT2: Nền NPK + 2 tấn phân HCVSVĐCCN - 100,00 CT3: 80% nền NPK +2 t phân HCVSVĐCCN 1,00 68,85 CT4: 70% nền NPK +2 t phân HCVSVĐCCN 1,05 67,29 1.2.3.2.Khoai tây. Thí nghiệm được tiến hành trên đồng ruộng với giống khoai tây Solara gồm 4 công thức, trong đó công thức đối chứng sử dụng 100% nền phân khoáng (N.P.K:120.120.120) và phân chuồng, các công thức thí nghiệm sử dụng phân HCVSVĐCCN thay thế phân chuồng, trong đó công thức 3 và công thức 4 giảm lượng phân khoáng đi lần lượt là 20% và 30% NP. Kết quả theo dõi được tập hợp tại bảng 57. Bảng 57. Hiệu quả của phân HCVSVĐCCN tới khả năng sinh trưởng và phát triển cây khoai tây. Công thức Tỷ lệ mọc Chiều cao cây (cm) Số thân/khóm Diện tích tán lá (%) CT1 74,7 52,8 3,4 94,0 CT2 75,3 65,4 3,4 97,0 CT3 75,0 55,9 3,4 94,7 CT4 74,8 52,9 3,4 94,2 Kết quả bảng 57 cho thấy, giữa các công thức thí nghiệm và đối chứng có sự thay đổi về các chỉ số sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây. Tuy nhiên mức độ sai khác về tỷ lệ mọc và diện tích tán lá giữa các công thức thí nghiệm và công thức đối chứng không đáng kể. Ở công thức đối chứng, chiều cao trung bình của cây đạt 52,8cm thấp hơn so với công thức 2 là 12,6 cm. ở 50 các công thức 3 và 4 có giảm lượng phân khoáng, chiều cao ở công thức giảm 20% lượng phân NP cao hơn công thức đối chứng là 3,1 cm, chiều cao ở công thức giảm 30% lượng phân NP thì tương đương với chiều cao cây ở công thức đối chứng. Như vậy phân hữu cơ vi sinh vật chức năng đã có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây. Bảng 58. Ảnh hưởng của phân HCVSVĐCCN tới năng suất khoai tây. Công thức Năng suất (kg/10m2) Tỷ lệ tăng so với đối chứng (%) CT1:Nền (NPK) + Phân chuồng 13,8 - CT2: Nền + Phân HCVSVĐCCN 16,2 17,39 CT3: 80% NP Nền +Phân HCVSVĐCCN 14,6 5,79 CT4: 70% NP Nền+Phân HCVSVĐCCN 14,5 5,07 CV(%) 19,4 LSD 0,05 5,385 Kết quả xác định ảnh hưởng của phân HCVSVĐCCN đối với năng suất khoai tây cho thấy, các công thức sử dụng phân HCVSVĐCCN thay thế phân chuồng đều cho năng suất cao hơn công thức đối chứng. Mức độ tăng ở các công thức 2, 3, 4 lần lượt là 17,39%, 5,79% và 5,07%. Như vậy sử dụng phân HCVSVĐCCN có thể thay thế phân chuồng với số lượng bằng 1/10 lượng phân chuồng cần bón, năng suất khoai tây không ảnh hưởng ngay cả khi giảm 20-30% lượng phân khoáng cần bón. Kết quả xác định khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn được trình bày tại bảng 59. Bảng 59. Khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn khoai tây của phân HCVSVĐCCN. Công thức Số khóm bị bệnh (khóm) Tỷ lệ bệnh (%) Mưc độ giảm bệnh so với đối chứng (%) CT1:Nền (NPK) + Phân chuồng 11,7 23,4 - CT2: Nền + Phân HCVSVĐCCN 4,7 9,4 59,83 CT3:80% NP Nền+Phân HCVSVĐCCN 5,4 10,8 53,85 CT4:70% NP Nền+Phân HCVSVĐCCN 6,0 12,0 48,72 51 Trong khi ở công thức 1 số khóm bị bệnh héo xanh là 11,7 khóm/50 khóm điều tra, chiếm tỷ lệ bị bệnh héo xanh vi khuẩn là 23,4%, thì ở công thức 2 số khóm bị bệnh héo xanh chỉ là 4,7 khóm/50 khóm điều tra, tương đương với lệ bị bệnh là 9,4%. Công thức 3 số khóm bị bệnh héo xanh là 5,4 khóm/50 khóm điều tra, tương đương 10,8%. Công thức 4 số khóm bị bệnh héo xanh là 6,0 khóm/50 khóm điều tra, tương đương 12,0%. Như vậy phân HCVSV ĐCCN đã có tác dụng làm giảm tỷ lệ bệnh héo xanh từ 48,72 % đến 59,83%. 1.2.3.3. Cây lạc. Ảnh hưởng của phân HCVSVĐCCN tới sinh trưởng, phát triển của cây lạc được tập hợp tại bảng 60 cho thấy phân HCVSVĐCCN có tác dụng tích cực đến sinh trưởng, phát triển của cây lạc thông qua các chỉ tiêu về chiều cao cây, chỉ số diện tích lá và trọng lượng khô thân lá trong tất cả các giai đoạn phát triển của cây. Số liệu nghiên cứu về mức độ hình thành nốt sần trong bảng 60 cho thấy, mặc dù số lượng nốt sần/cây của các công thức không có sự sai khác đáng kể, song trọng lượng tươi nốt sần có sự khác biệt rất rõ. Điều đó xác định phân HCVSVĐCCN có tác dụng tích cực đến sự hình thành nốt sần và khả năng cố định nitơ của cây lạc. Bảng 60. Ảnh hưởng của phân HCVSVĐCCN đến sinh trưởng và khả năng cố định nitơ của cây lạc Công thức thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi CT1 (ĐC): NPK (30.90.60) + 10 t PC CT1. NPK (30.90.60) + 1 t HCVSVĐCCN CT3: NPK (24.81.60) +1 t HCVSVĐCCN Chiều cao cây (cm): - Giai đoạn hoa - Gia đoạn thu hoạch 24,1 24,6 25,1 25,9 24,4 25,2 Chỉ số diện tích lá (m2 lá/m2 đất) - Giai đoạn hoa - Gia đoạn thu hoạch 1,34 1,24 1,69 1,41 1,42 1,30 Khối lượng khô thân lá (g/m2) - Giai đoạn hoa - Gia đoạn thu hoạch 163 151,2 196 176,2 166,3 165,4 Số lượng nốt sần (nốt/cây) 66 69 72 Khối lượng tưới nốt sần (g/m2) 4,35 5,22 6,38 52 Kết quả đánh giá hiệu quả của phân HCVSVĐCCN đối với năng suất lạc được tổng hợp trong bảng 61 cho thấy, sử dụng phân H