Báo cáo Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rút lở mồm long móng (LMLM)

B ộ K H C N V iệ n T h ú y B ộ K H C N V iệ n T h ú y Bộ khoa học, công nghệ và môi tr−ờng Viện Thú Y 86, Đ−ờng Tr−ờng Chinh - Đống Đa – Hà Nội Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06: Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nh−ợc độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gene xác định typ vi rut Lở mồm long móng (LMLM) Chủ nhiệm đề tài: TS. Tô Long Thành 6102 19/9/2006 Hà Nội – 2005 Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y. Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện tr−ởng Viện Thú y trừ tr−ờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. Bộ KH CN Viện Thú y Mục lục Trang Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06 2 Danh sách cán bộ tham gia 3 Danh sách các đon vị tham gia, phối hợp 5 tóm tắt Báo cáo 6 Những từ viết tắt 13 Lời nói đầu 14 Ch−ơng I Tổng quan tài liệu 24 1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 24 1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 24 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới 24 1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam 25 1.1.2. Tóm l−ợc về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng 26 1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 27 1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida 27 1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn 27 1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn. 28 1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida 28 1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida 31 1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida 32 1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida 32 1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida 33 1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). 33 1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen. 34 1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida. 35 1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp gây ra ở gia cầm. 37 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. 37 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong n−ớc. 39 1.2.3. Đặc điểm của Salmonella. 41 1.2.4. Tình trạng ngộ độc thức ăn do Salmonella. 41 1.2.5. Biện pháp phòng bệnh. 42 1.2.6. vắc-xin chống Salmonella cho gà 43 1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella 43 1.2.6.2. Sơ l−ợc về kháng nguyên roi của S. typhimurium 44 1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhimurium có khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella. 45 1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin 46 1.3. Bệnh Lở mồm Long móng 47 1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình nghiên cứu về bệnh trong, ngoài n−ớc. 47 1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh trên thế giới và ở Việt Nam. 47 1.3.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới. 49 1.3.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trong n−ớc. 51 1.3.2. Vi rút gây bệnh LMLM. 52 1.3.2.1. Hình thái học. 52 1.3.2.2. Sức đề kháng của vi rút. 52 1.3.2.3. Đặc tính nuôi cấy. 52 1.3.3. Các ph−ơng pháp chẩn đoán. 53 1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng. 53 1.3.3.2. Đại c−ơng về chẩn đoán trong phòng thí nghiệm. 53 1.3.3.3. Chẩn đoán huyết thanh học. 54 1.3.3.3.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 54 1.3.3.3.2. Phản ứng trung hoà vi rút. 55 1.3.3.3.3. Phản ứng ELISA. 55 1.3.3.3.4. Các phản ứng huyết thanh học khác 56 1.3.3.4. Chẩn đoán vi rút học. 56 1.3.3.5. Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR. 56 Ch−ơng II: Nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 58 A. Nguyên liệu 58 2.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. 58 2.1.1. Động vật thí nghiệm. 58 2.1.2. Vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng. 58 2.1.3. Dụng cụ máy móc thí nghiệm. 58 2.1.4. Môi tr−ờng, hoá chất 58 2.2. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 59 2.2.1. Động vật và sản phẩm động vật. 59 2.2.2. Các loại môi tr−ờng thông th−ờng. 59 2.2.3. Các loại môi tr−ờng chuyên biết. 60 2.2.4. Các trang thiết bị phòng thí nghiệm cần thiết khác. 62 2.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 62 2.3.1. Chủng vi sinh vật. 62 2.3.2. Động vật. 62 2.3.3. Plasmid. 62 2.3.4. Môi tr−ờng nuôi cấy. 63 2.3.5 Các dung dịch. 63 2.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. 64 2.4.1. Bệnh phẩm. 64 2.4.2. Nguồn bệnh phẩm. 64 2.4.3. Dung dịch bảo quản bệnh phẩm. 64 2.4.4. Tế bào BHK- 21 và môi tr−ờng nuôi cấy tế bào. 65 2.4.5. Hoá chất, vật liệu và thiết bị để tiến hành phản ứng RT-PCR. 65 2.4.5.1. Mẫu ARN chuẩn. 65 2.4.5.2. Các hoá chất, vật liệu cần thiết tiến hành phản ứng RT- PCR. 65 2.4.5.3. Các hóa chất, vật liệu cần thiết cho việc tách dòng (cloning). 65 2.4.5.4. Thiết bị, máy móc. 66 2.4.5.5. Các cặp mồi đặc hiệu với vi rút LMLM type O, A , C hoặc Asia-1. 66 B. Ph−ơng pháp nghiên cứu 66 3.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. 66 3.1.1. Kiểm tra giống vi khuẩn dùng để nghiên cứu và sản xuất vacxin. 66 3.1.2. Xác định đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hoá của vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò chủng IR. 67 3.1.3. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn đối với chuột nhắt trắng. 69 3.1.4. Sản xuất vacxin vô hoạt toàn khuẩn có chất bổ trợ keo phèn – Saponin. 71 3.1.5. Kiểm nghiệm vắc xin 72 3.1.5.1. Kiểm tra vô trùng vắc xin. 72 3.1.5.2 Kiểm tra an toàn vacxin 72 3.1.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin. 72 3.1.5.3.1. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thí nghiệm. 72 3.1.5.3.2. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của vacxin đối với trâu, bò. 72 3.1.6. Ph−ơng pháp xử lý số liệu. 76 3.1.6.1. Ph−ơng pháp tính chỉ số miễn dịch. 76 3.1.6.2. Ph−ơng pháp xử lý số liệu bằng toán thống kê. 76 3.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 77 3.2.1. Các ph−ơng pháp vi sinh vật học thông th−ờng. 77 3.2.2. Các ph−ơng pháp sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin. 77 3.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S.enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp. 78 3.3.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn. 78 3.3.2. Ph−ơng pháp tổng hợp chuỗi (PCR). 78 3.3.3. Xử lý ADN bằng enzym hạn chế. 78 3.3.4. Phản ứng nối ghép gen. 79 3.3.5. Biến nạp vào E. coli. 79 3.3.6. Tách chiết ADN plasmid từ E. coli. 80 3.3.7. Cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp. 81 3.3.8. Biến nạp plasmid vào nấm men P. pastoris bằng xung điện. 82 3.3.9. Western Blot, ELISA. 83 3.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. 84 3.4.1. Các ph−ơng pháp chẩn đoán, định typ vi rút LMLM của Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế. 84 3.4.2. Ph−ơng pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm. 84 3.4.3. Ph−ơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định type vi rút LMLM. 86 3.4.3.1. Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô. 86 3.4.3.2. Tạo cADN bằng phản ứng sao chép ng−ợc. 86 3.4.3.3. Phản ứng PCR. 86 3.4.3.5. Kiểm tra sản phẩm PCR. 87 3.4.4. Tách dòng và giải trình tự đoạn gen mã hóa cho serotype O của vi rút gây bệnh LMLM phân lập tại Việt nam. 88 3.4.4.1. Lai sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCRR2.1 và biến nạp vào tế bào khả biến (competent E. coli cells). 88 3.4.4.2. Tách chiết Plasmid. 89 3.4.4.3. Cắt bằng enzym giới hạn. 89 3.4.5. Ph−ơng pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút gây bệnh LMLM. 90 3.4.5.1. Ph−ơng pháp nuôi tế bào BHK-21 (Baby Hamster Kidney - 21). 90 3.4.5.2. Ph−ơng pháp tách tế bào bám dính. 90 3.4.5.3. Ph−ơng pháp gây nhiễm vi rút LMLM lên tế bào BHK-21. 90 Ch−ơng III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 92 4.1. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. 92 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết của các địa ph−ơng. 92 4.1.2. Tính t−ơng đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn P. multocida chủng IR với đại diện các chủng P. multocida phân lập đ−ợc. 95 4.1.3. Kết quả xác định liều kháng nguyên thích hợp kích thích khả năng sản sinh miễn dịch tốt nhất trên trâu bò. 96 4.1.4. Kết quả xác định công thức bổ trợ thích hợp và theo dõi độ dài miễn dịch của vắc xin keo phèn-saponin. 97 4.1.5. Kết quả chế vắc xin tụ huyết trùng trâu bò keo phèn- saponin chủng IR. 98 4.1.6. Tính t−ơng đồng kháng nguyên của vi khuẩn P.multocida chủng IR với các chủng P. multocida khác đang sử dụng chế vắc xin THT trâu bò tại Việt Nam. 99 4.2. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhimurium bằng công nghệ vi khuẩn. 99 4.2.1. Kết quả điều tra một vài đặc điểm dịch tễ tại 4 cơ sở chăn nuôi gà giống. 99 4.2.2. Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. 100 4.2.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella phân lập đ−ợc. 102 4.2.4. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đ−ợc trên chuột nhắt trắng. 104 4.2.5. Kết quả thử khả năng mọc của các chủng Salmonella trên các loại môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau. 105 4.2.6. Kết quả thử đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 106 4.2.7. Kết quả thử độc lực của các chủng Salmonella phân lập đ−ợc 106 4.2.8. Kết quả xác định LD 50 của các chủng Salmonella phân lập đ−ợc 107 4.2.9. Sản xuất thử nghiệm vacxin S. enteritidis và S. Typhimurium vô hoạt keo phèn 108 4.2.10. Kết quả thử thuần khiết vacxin 108 4.2.11. Kết quả thử vô trùng của vacxin 108 4.2.12. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trắng 109 4.2.13. Kết quả thử an toàn trên gà mái hậu bị 110 4.2.14. Kết quả kiểm tra hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 110 4.2.15. Kết quả thử nghiệm hiệu lực của vác xin trên gà 111 4.2.16. Thí nghiệm xác định liều sử dụng của vacxin 111 4.3. Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhimurium bằng vi khuẩn biến nạp 113 4.3.1. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 113 4.3.1.1. Đ−a gen vào vectơ pCR2.1 113 4.3.1.1.1. Tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn 113 4.3.1.1.2.Nhân đoạn gen fliC3, gm3, sef14 từ hệ gen S. typhimurium, S. enteritidis 114 4.3.1.1.3. Đ−a sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pCR2.1 115 4.3.1.2. Đ−a gen vào vectơ biểu hiện pET22b(+) 119 4.3.1.3. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong E. coli BL21 120 4.3.2. Biểu hiện gen fliC3, gm3, sef14 trong nấm men P. pastoris 122 4.3.2.1. Nhân các gen bằng PCR 122 4.3.2.2. Đ−a gen vào vectơ tách dòng pCR2.1 123 4.3.2.3. Đ−a gen vào vectơ biểu hiện pPIC9 123 4.3.2.4. Biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris 125 4.3.3. Thử đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên tái tổ hợp Flic3 126 4.3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp FliC 126 4.3.3.2. Gây miễn dịch kháng nguyên tái tổ hợp FliC và kháng nguyên toàn phần trên gà hậu bị 127 4.3.3.3. Western blot và ELISA 127 4.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp GM3 131 4.3.5. Nghiên cứu khả năng bảo hộ của protein tái tổ hợp Flic3 và Gm3 132 4.4. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR 134 4.4.1. Khái quát tình hình dịch bệnh LMLM tại Việt Nam trong vòng 5 năm trở lại đây thời gian gần đây 134 4.4.2. Diễn biến lâm sàng của bệnh trên bò và lợn 136 4.4.3. Thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh 138 4.4.3.1. Thu thập bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 138 4.4.3.2. Vận chuyển bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.3.3. Bảo quản mẫu bệnh phẩm từ gia súc nghi mắc bệnh LMLM 139 4.4.4. Thiết lập ph−ơng pháp RT–PCR để phát hiện vi rút gây bệnh LMLM bằng mẫu ARN đã biết 140 4.4.5. Chẩn đoán định type các mẫu bệnh phẩm thu thập tại tỉnh Qủang Trị 143 4.4.6. Kết quả xác định tính đặc hiệu của các cặp mồi dùng trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM. 145 4.4.7. Kết quả ứng dụng ph−ơng pháp RT-PCR để chẩn đoán định typ vi rút LMLM từ các bệnh phẩm thu thập từ thực địa 147 4.4.8. Tách dòng và giải trình trình tự đoạn gene mã hoá cho serotype O của vi rut LMLM thu thập tại tỉnh Qủang Trị 149 4.4.8.1. Tách dòng đoạn gene đặc hiệu chung để nhận biết các type O, A, C, và asia-1 và đoạn gene đặc hiệu cho typ O 149 4.4.8.2. Kết quả giải trình trình tự nuclêotide 151 4.4.9. Kết quả phân lập vi rút trên tế bào dòng BHK-21 153 4.4.9.1 Điều kiện làm việc với vi rút LMLM 153 4.4.9.2. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21 153 4.4.9.3. Kết quả gây nhiễm bệnh phẩm nghi có chứa vi rút LMLM lên tế bào BHK-21 155 4.4.9.4. So sánh chẩn đoán vi rút LMLM bằng RT-PCR từ bệnh phẩm biểu mô và từ bệnh phẩm biểu mô đã cấy chuyển trên tế bào 156 4.4.10. So sánh ph−ơng pháp ELISA và RT-PCR để chẩn đoán- định typ virut LMLM 158 4.4.11. Nhận xét tổng quan về ph−ơng pháp RT-PCR trong chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM 160 Ch−ơng IVKết luận và đề nghị 163 Kết luận 163 I. Các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm 163 II. Về nội dung và ph−ơng pháp sử dụng 163 III. Về giải pháp khoa học công nghệ 164 IV. Các sản phẩm cụ thể 165 Đề nghị 165 Lời cảm ơn 166 Tài liệu tham khảo 167 2 Các đề tài nhánh của đề tài kc.04.06 TT Mã số Tên đề tài nhánh Cơ quan của chủ nhiệm đề tài nhánh 1 KC.04.06.01 Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao ThS. Hoàng Xuân Nghinh Viện Thú y 2 KC.04.06.02 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi murium bằng công nghệ vi khuẩn. TS. Trần Thị Hạnh Viện Thú y 3 KC.04.06.03 Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi murium bằng vi khuẩn biến nạp. TS. Tr−ơng Nam Hải Viện Công nghệ Sinh học 4 KC.04.06.04 Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR). TS. Tô Long Thành Viện Thú y 3 Danh sách cán bộ tham gia TT Họ và Tên Học vị chuyên môn Cơ quan công tác 1 Tr−ơng Văn Dung PGS. TS Viện Thú y 2 Hoàng Xuân Nghinh Th.S Viện Thú y 3 Đỗ Tuấn C−ơng BSTY Viện Thú y 4 Trần Ngọc ánh Th.S Viện Thú y 5 Nguyễn Lại Hoàn TS Viện Thú y 6 Tr−ơng Thị Hồng Hoa BSTY Viện Thú y 7 Lê Văn Phan BSTY Viện Thú y 8 Nguyễn Thị Bích BSTY Viện Thú y 9 Đặng Vũ Hoàng BSTY Viện Thú y 10 Trần Thị Thanh Hà BSTY Viện Thú y 11 Trần Thu Hiền Th.S Công Ty Hanvet 12 Nguyễn Thị Nguyệt Th.S Công Ty Hanvet 13 Nguyễn Lê Văn Th.S Viện Chăn nuôi 14 Trần Thị Hạnh TS Viện Thú y 15 Nguyễn Tiến Thành BSTY Viện Thú y 16 Đặng Thị Thanh Sơn BSTY Viện Thú y 17 Ngô Chung Thủy BSTY Viện Thú y 18 Trịnh Phú Ngọc TS Viện Thú y 19 Đặng Đình Th−ởng BSTY Viện Thú y 4 20 Thái Kim Thanh KTV Viện Thú y 21 Hoàng Quang Thỏa Th.S TT Thú y vùng Hà Nội 22 Lê Thị Thi BSTY Phân Viện TY NT 23 Lâm Minh Thuận BSTY ĐH Nông lâm Thủ Đức 24 Nguyễn Thị Hoa Lý TS Trung tâm kiểm tra Vệ sinh Thú y TW2 25 Tr−ơng Nam Hải TS Viện Công nghệ SH 26 Nguyễn Thanh Thuỷ CN Viện Công nghệ SH 27 Đỗ Thị Huyền Th.S Viện Công nghệ SH 28 Trần Ngọc Tân CN Viện Công nghệ SH 29 Nguyễn Hồng Thanh CN Viện Công nghệ SH 30 Nguyễn Thị Trung Th.S Viện Công nghệ SH 31 Nguyễn Thành Trung SV Đại học KH TN 32 Nguyễn Thị Thu Hằng SV Đại học KH TN 33 Nguyễn Minh Giang SV Đại học SP Hà Nội 34 Bùi Thị Tố Nga SV Đại học NN I 35 Nguyễn Ph−ơng Giang SV Đại học NN I 36 Nguyễn Thị H−ơng SV Đại học NN I 37 Đinh Duy Kháng TS Viện Công nghệ SH 38 D−ơng Hồng Quân CN Viện Công nghệ SH 5 Danh sách các đơn vị tham gia, phối hợp TT Đơn vị 1 Viện Thú y 2 Viện Công nghệ Sinh học 3 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng 4 Trung tâm Thú y vùng Thành phố Hồ Chí Minh 5 Chi Cục Thú y tirnh Lạng Sơn 6 Chi Cục Thú y tỉnh Phú Thọ 7 Chi Cục Thú y tỉnh Bắc Giang 8 Chi Cục Thú y tỉnh Thái Bình 9 Chi Cục Thú y tỉnh Ninh Thuận 10 Chi Cục Thú y tỉnh Thừa Thiên Huế 11 Chi Cục Thú y tỉnh Quảng Trị 12 Chi Cục Thú y tỉnh Daklak 13 TT Thú y vùng Hà Nội 14 Phân Viện TY NT 15 ĐH Nông lâm Thủ Đức 16 Trung tâm kiểm tra Vệ sinh Thú y TW2 6 tóm tắt Báo cáo Đề tài: Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vacxin nh−ợc độc vô hoạt phòng bệnh cho giá súc, gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gen xác định loại vi rut Lở mồm Long móng (LMLM) Mã số: KC.04.06. Thuộc Ch−ơng trình Khoa học Công nghệ cấp Nhà n−ớc KC.04 “nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ sinh học” giai đoạn 2001-2005. Theo tinh thần của Hợp Đồng "Nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ số: 06/2001/HĐ - ĐTCT – KC – 04.06 ký ngày 24 tháng 10 năm 2001 giữa Ban Chủ nhiệm Ch−ơng trình KC-04 - đại diện cho Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi tr−ờng với Viện Thú y – là cơ quan Chủ trì Đề tài và Chủ nhiệm Đề tài, Đề tài KC.04.06 có ba mục tiêu nh− sau: - Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nh−ợc độc biến nạp gen phòng bệnh cho gà. - Tạo chủng vi khuẩn tụ huyết trùng để sản xuất vắc xin. - Định type vi rut LMLM để lựa chọn vắc xin phù hợp. Đề tài đ−ợc thực hiện từ tháng 11 năm 2001 và kết thúc vào tháng 12 năm 2004 với tổng số kinh phí là 2700 triệu đồng trong đó kinh phí từ ngân sách nhà n−ớc là 2600 triệu đồng. Để thực hiện các mục tiêu của Đề tài theo nh− Hợp đồng đã yêu cầu, chúng tôi đã lựa chọn; với sự chấp thuận của Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi Tr−ờng, 4 đề tài nhánh (xem Bảng 1) với các nội dung nghiên cứu khác nhau nhằm đ−a ra các công nghệ sản xuất thích hợp để có đ−ợc các loại vắc xin sẽ đ−ợc sử dụng trong phòng chống bệnh Tụ huyết trùng trâu bò – là bệnh gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trâu bò của n−ớc ta và vấn đề ô nhiễm thực phẩm do Salmonella enteritidis và Salmonella typhi 7 murium gây ra ở các sản phẩm của từ gia cầm – đây là những mầm bệnh có tầm quan trọng về y tế, đặc biệt liên quan đến vấn đề an toàn thực phẩm. Đối với bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) – là một bệnh đặc biệt nguy hiểm của động vật guốc chẵn, mục tiêu của đề tài là thiết lập ph−ơng pháp chẩn đoán-định type vi rút gây bệnh LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR). Một trong những ứng dụng thực tiễn của ph−ơng pháp này là xác định type vi rút gây bệnh LMLM một cách nhanh chóng và chính xác để lựa chọn và sử dụng vắc xin thích hợp. Bảng 1. Phân công chủ đề nghiên cứu và Chủ trì các Đề tài nhánh TT Mã số nhánh Đề tài nhánh Chủ trì Cơ quan 1 KC.04.06.01. Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao Hoàng Xuân Nghinh Viện TY 2 KC.04.06.02. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhi murium bằng công nghệ vi khuẩn Trần Thị Hạnh Viện TY 3 KC.04.06.03. Sản xuất vắc xin phòng chống S. enteritidis và S. typhi murium bằng vi khuẩn biến nạp Tr−ơng Nam Hải Viện CNSH 4 KC.04.06.04. Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR Tô Long Thành Viện TY Đề tài bắt đầu đ−ợc thực hiện vào cuối tháng 10 năm 2001 và kết thúc vào tháng 12 năm 2004 theo nh− thời l−ợng cho phép của Hợp đồng. Nhìn chung, theo kế hoạch nghiên cứu đã đ−ợc xác định cho từng năm, các đề tài nhánh đều hoàn thành công việc đúng tiến độ. Kết quả của từng đề tài nhánh mà chúng tôi tập hợp sau đây sẽ chứng minh điều đó. Tuy nhiên, Ban Chủ nhiệm đề tài của Viện Thú y cũng nh− Ban Chủ 8 nhiệm ch−ơng trình KC-04 đã thống nhất đánh giá và ghi nhận những cố gắng đã đạt đ−ợc của các đề tài nhánh thực hiện trên đối t−ợng gia cầm nhằm hoàn thành các nội dung của đề tài theo đúng tiến độ đề ra. Chúng ta đều biết trong thời gian thực hiện đề tài, dịch cúm gia cầm do vi rút H5N1 nổ ra vào cuối năm 2003 và vẫn âm ỉ cho đến hiện nay đã gây ảnh h−ởng không nhỏ đến việc thực hiện các thực nghiệm trên bản động vật. Cho đến thời điểm chúng tôi tổng kết Đề tài này, các đề tài nhánh đều hoàn thành các nội dung công việc đã đ−ợc ký với Ban Chủ nhiệm Ch−ơng trình. 1. Đề tài nhánh KC.04.06.01: Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện vắc xin phòng chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò chất l−ợng cao. Bằng việc phân lập vi khuẩn P. multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu bò từ trâu bò bị bệnh tại một số địa ph−ơng trong n−ớc và so sánh tính t−ơng đồng kháng nguyên của chúng với các chủng vi khuẩn hiện đang đ−ợc sử dụng để chế tạo vắc xin, các tác giả đã lựa chọn chủng IR của vi khuẩn P. multocida để chế tạo vắc xin. Đề tài nhấn mạnh vào hai yếu tố nhằm nâng cao hiệu quả của vắc xin: (i) xác định liều kháng nguyên kích thích sinh miễn dịch tốt nhất và (ii) cải tiến công thức của chất bổ trợ, dùng hỗn hợp saponin và keo phèn để tạo đáp ứng miễn dịch cao và độ dài miễn dịch tốt hơn so với các vắc xin đang đ−ợc sử dụng trong n−ớc. Sau khi thử nghiệm vắc xin với kết quả khả quan ở một số địa ph−ơng nh− Phú Thọ và Bắc Giang, vắc xin đã đ−ợc kiểm nghiệm tại Cục Thú y với kết quả đạt yêu cầu. Các kết quả thu đ−ợc đ−ợc tóm tắt nh− sau: - Phân lập đ−ợc 16 chủng vi khuẩn Pasteurella multocida từ trâu bò chết ở một số địa ph−ơng trong n−ớc. - Chọn vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR là chủng gốc để chế vắc xin. - Xác định tính t−ơng đồng kháng nguyên giữa vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR với các chủng đại diện phân lập đ−ợc từ các địa ph−ơng. - Xác định liều kháng nguyên thích hợp là 25 tỷ vi khuẩn/1 liều vắc xin. - Công thức bổ trợ thích hợp: Saponin 1%, keo phèn 20%. - Độ dài miễn dịch chắc chắn của vắc xin trên bản động vật: ít nhất 6 tháng. 9 - Có thể dùng các vi khuẩn Pasteurella multocida chủng IR; 4 chủng: Pb1, Pb2, Pbu1, Pbu2; chủng P52 để chế vắc xin. - Vắc xin đ−ợc kiểm nghiệm cấp quốc gia: Đạt yêu cầu. Trong quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu đã đề ra, đề tài đã tiếp nhận 5 sinh viên đại học Thú y thực tập tốt nghiệp với kết quả bảo vệ báo cáo tốt nghiệp đạt kết quả cao (xem Phụ Lục). 2. KC.04.06.02: Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi murium bằng công nghệ vi khuẩn. Đề tài đ−ợc tiến hành với b−ớc điều tra cơ bản nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp trên các đối t−ợng gia cầm của một số trại chăn nuôi. Từ những chủng Salmonella phân lập đ−ợc, các tác giả đã định type và l−u giữ đ−ợc các chủng vi khuẩn S. typhi murium và S. enteritidis. Bằng các kỹ thuật vi sinh vật học, các tác giả đã chọn đ−ợc một chủng S. typhi murium và một chủng S. enteritidis để sản xuất vắc xin vô hoạt kep phèn. Kết quả thử nghiệm vắc xin cho thấy vắc xin bảo hộ tốt cho chuột và an toàn cho gà đ−ợc dùng vắc xin. Các kết quả cụ thể nh− sau: - Đã xác định đ−ợc tỉ lệ nhiễm Salmonella spp trên gà và vịt ở miền Bắc, miền Trung và miền Nam. Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên gia cầm của Việt Nam la 4,24%. - Đã phân lập và định týp đ−ợc 2 chủng Salmonella typhi murium (7,55%) và Salmonella enteritidis (1,80%) trong tổng số vi khuẩn Salmonella phân lập đ−ợc. - Đã thử độc lực và khả năng sống sót của 13 chủng vi khuẩn phân lập đ−ợc. - Xác định đ−ợc chỉ tiêu LD50 của 13 chủng phân lập đ−ợc với kết quả từ 10-2,7 đến 10-3,2. - Chọn đ−ợc 2 chủng S. enteritidis (E17) và S. typhi murium (T6) có các đặc tính sinh vật hóa học điển hình, có độc lực cao, khả năng sống sót cao để sản xuất vacxin vô hoạt keo phèn. 10 - Đã sản xuất thử nghiệm thành công 2 loại vacxin vô hoạt keo phèn S. enteritidis (E17) và S. typhi murium (T6), với kết quả bảo hộ tốt trên chuột nhắt trắng và an toàn trên gà thí nghiệm. - Đã xác định đ−ợc liều vacxin có hiệu giá kháng thể cao nhất là 2,5 ml/ con. Trong quá trình thực hiện, đề tài đã tiếp nhận 1 sinh viên đại học Thú y thực tập tốt nghiệp và 1 hoạc viên thạc sỹ. Đề tài đã công bố 2 bài báo (xem Phụ Lục). 3. KC.04.06.03: Sản xuất vắc xin phòng bệnh do S. enteritidis và S. typhi murium bằng vi khuẩn biến nạp. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, các tác giả đã tách dòng các đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên lông H:i của vi khuẩn S. typhi murium, H:g,m và kháng nguyên lông sef14 của vi khuẩn S. enteritidis. Các đoạn gen này đã đ−ợc biểu hiện trong vi khuẩn E. Coli và khả năng sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp FliC3 và Gm3 đ−ợc xác định là t−ơng tự nh− kháng nguyên tự nhiên. Thử nghiệm công c−ờng độc cho gà đ−ợc dùng vắc xin tái tổ hợp cho thấy vắc xin tái tổ hợp bảo hộ đ−ợc cho gà chống lại vi khuẩn Salmonella. Các kết quả thu đ−ợc nh− sau: - Đã tách dòng thành công các đoạn gen mã hoá cho kháng nguyên roi H:i của vi khuẩn S. typhi murium, H:g,m và kháng nguyên lông sef14 của vi khuẩn S. Enteritidis. - Biểu hiện thành công gen mã hoá kháng nguyên roi của S. typhi murium và S. enteritidis trong vi khuẩn E. Coli BL21. - Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp FliC3 và Gm3 đ−ợc xác định là t−ơng tự nh− kháng nguyên tự nhiên. - Đã tạo thành công vacxin tái tổ hợp chống Salmonella ở gà. Thêm vào đó: Đề tài đã đào tạo đ−ợc 2 sinh viên đại học và 1 thạc sỹ khoa học, đ−ợc nhận giải Báo cáo Khoa học ấn t−ợng của Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003, Giải nhì Hội nghị Khoa học Thanh niên của Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 11 Đề tài đã công bố 03 ấn phẩm (xem Phụ Lục) có liên quan đến nội dung khoa học của đề tài. 4. KC.04.06.04: Định type vi rút LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR. Với hơn 250 bệnh phẩm thu thập đ−ợc từ các ổ dịch của trâu bò và lợn nghi là mắc bệnh Lở mồm Long móng (LMLM), lần đầu tiên ở Việt Nam, các tác giả đã áp dụng thành công kỹ thuật RT-PCR nhằm chẩn đoán định type vi rút gây bệnh LMLM. Thêm vào đó, các tác giả đã phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM từ bệnh phẩm thu thập ở một số địa ph−ơng trên nuôi cấy tế bào dong BHK-21 và đây chính là ph−ơng pháp làm tăng số l−ợng vi rút và sau đó tiến hành định type bằng ph−ơng pháp RT-PCR từ những bệnh phẩm chất l−ợng kém hoặc số l−ợng vi rút trong bệnh phẩm không đủ để tiến hành ngay ph−ơng pháp RT-PCR. Các kết quả cụ thể đã thu đ−ợc nh− sau: - Đã ứng dụng thành công ph−ơng pháp RT-PCR trong điều kiện trang thiết bị và nghiên cứu của Việt Nam với các mẫu ARN chuẩn chiết tách từ vi rút LMLM của Việt Nam, nhận từ Phòng thí nghiệm Tham chiếu về bệnh LMLM Pirbright, Anh quốc. - Đã sử dụng ph−ơng pháp RT-PCR đối với bệnh phẩm biểu mô thu thập từ gia súc (trâu, bò, lợn) nghi mắc bệnh LMLM với kết quả của ph−ơng pháp đạt độ đặc hiệu cao. Trong tr−ờng hợp chỉ cần xác định mầm bệnh có phải là vi rút gây bệnh LMLM hay không, chỉ cần sử dụng cặp mồi 1F/1R dặc hiệu chung cho tất cả các typ vi rút gây bệnh LMLM nhằm có câu trả lời nhanh nhất để triển khai các biện pháp khống chế bệnh. - Đã duy trì, bảo quản và phục hồi tế bào BHK-21 một cách dễ dàng và nó trở thành nguyên liệu quí cho các nghiên cứu sâu hơn về vi rút LMLM. Sử dụng tế bào này, đã phân lập thành công vi rút gây bệnh LMLM ở tỉnh Quảng Trị và đã khẳng định đây là một vi rút typ O bằng ph−ơng pháp RT-PCR. Đây là một ph−ơng pháp thay thế trong tr−ờng hợp số l−ợng vi rút trên bệnh phẩm thấp, cần gây nhiễm lên tế bào cảm thụ để tăng số l−ợng vi rút và sau đó tiến hành định type bằng ph−ơng pháp RT-PCR. 12 Thêm vào đó, đề tài đã h−ớng dẫn 3 sinh viên đại học Thú y, 1 Thạc sỹ Thú y và công bố 4 bài báo (xem phần Phụ Lục). 13 Những từ viết tắt ADN Acid Deroxyribonucleic Amp+ Ampicillin. BHK-21 Baby Hamster Kidney dòng 21 bp base pair. BSA Bovine Serum Albumin cADN Complementary ADN CPE Cytopathogen effect DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium DMSO Dymethyl Sulffoxide dNTP Deroxyribonucleotide 5’-triphosphates. DTT Dithiothretiol EDTA Ethylen diamin tetra axit axetic. ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay. EtBr Ethidium bromide. FAO Food and Agricultural Organization FCS Fetal Calf Serum FMD Foot and Mouth Disease. IPTG Isopropy-β-D-thiogalactopyranoside. Kb Kilo base. LB Luria-Bertani medium. LMLM Lở mồm Long móng OIE Office Internaitionale des Epizooties PBS Phosphate- Buffered- Saline RT-PCR Reverse Trancription- Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodecyl sunphat. TAE Tris- axetat-EDTA. Taq pholymerase Polymerase của Thermus aquaticus TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose TE Tris- EDTA. Trypsin- EDTA Ethylene- Diamine- Tetra-Acetate WRL World Reference Laboratory X-gal 5-Bromo-4chlorua-3 indolyl-β-O galactosyranozit. 14 Lời nói đầu Lịch sử nghiên cứu và phát triển vắc xin đã có chiều dài hơn 200 năm kể từ lần đầu tiên khi Edward Jenner thử nghiệm dùng vắc xin chống bệnh đậu mùa cho cậu bé James Phipps tám tuổi sống tại một làng quê n−ớc Anh vào năm 1795. Nhờ đó mà cậu bé đã đ−ợc cứu sống khi dịch bệnh đã lan rộng, c−ớp đi sinh mạng của bao ng−ời. Cách phòng bệnh nh− vậy trên thực tế đã tồn tại trong dân gian của các n−ớc Trung Quốc, ấn Độ, và Ba T− từ hơn một ngàn năm tr−ớc. Tuy nhiên, Jenner là nhà khoa học đầu tiên đã xem xét vấn đề một cách có hệ thống, vì vậy ông đ−ợc xem là ng−ời khởi đầu cho ngành vắc-xin học. Gần một thế kỉ sau, vào năm 1885, Louis Pasteur đã chế tạo thành công vắc xin chống bệnh dại và đã chứng minh khả năng bảo vệ cơ thể chống lại bệnh truyền nhiễm bằng chính tác nhân gây bệnh đó nh−ng đã bị làm suy yếu đi hoặc đã bị giết chết. Qua các công trình nghiên cứu, Pasteur đã phát hiện ra vai trò của các vi sinh vật trong thế giới sống. Nhờ đó, ông không chỉ đánh đổ đ−ợc thuyết tự sinh duy tâm mà còn đặt nền móng cho sự phát triển của ngành vắc-xin học hiện đại. Loại vaccine này đã đ−ợc sử dụng rộng rãi vào cuối thế kỷ XIX tuy nhiên khả năng phòng bệnh của loại vắc xin này ch−a cao. Với đặc điểm của ngành Thú y, phòng bệnh luôn đ−ợc coi là là tốt hơn điều trị, nên có thể nói vắc xin hiện nay vẫn đ−ợc coi là biện pháp chủ yếu để phòng bệnh cho gia súc và gia cầm. Việc điều trị gia súc và gia cầm, ngoài tốn kém về chi phí thuốc còn có thể gây nên hiện t−ợng kháng thuốc kháng sinh đối với vi sinh vật và tạo nên các chất tồn d− trong sản phẩm động vật mà nó có thể ảnh h−ởng trực tiếp đến sức khỏe của ng−ời tiêu dùng. Hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi rõ ràng phụ thuộc nhiều vào việc phải hay không phải điều trị bệnh cho gia súc, gia cầm. Trong số các loại vắc xin dùng trong y học nói chung và thú y học nói riêng, hai loại đ−ợc dùng phổ biến là vắc xin vô hoạt (vi sinh vật đã đ−ợc giết chết) và vắc xin nh−ợc độc (vi sinh vật vẫn còn sống nh−ng không có khả năng gây bệnh). Mặc dù tr−ớc đây vắc xin nh−ợc độc đ−ợc coi là tạo đ−ợc miễn dịch cao hơn và dài hơn so với vắc xin vô hoạt; nh−ng đến nay với các chất bổ trợ mới, vắc xin vô hoạt đã dần dần thay thế cho vắc xin nh−ợc độc trên thị tr−ờng thế giới, nhất là tại các n−ớc có trình độ phát triển khoa học kỹ thuật cao ng−ời ta không muốn gặp phải nguy cơ xuất hiện lại các chủng 15 vi sinh vật có khả năng gây bệnh cho gia súc và gia cầm từ vắc xin, dù là với một xác suất nhỏ nhất. Nh− đã nói ở trên, để khắc phục các nh−ợc điểm của vắc xin đ−ợc tạo ra từ vi khuẩn đã đ−ợc vô hoạt, các nhà khoa học đã nghiên cứu ra vắc xin sống bằng cách làm suy yếu vi khuẩn. Loại vắc xin này có khả năng bảo vệ cơ thể rất tốt nh−ng nó lại có rủi ro rất lớn đối với những cơ thể có sức đề kháng kém. Do nh−ợc điểm đó mà vắc xin sống nh−ợc độc đã ra đời. Loại vắc xin này đ−ợc điều chế bằng cách làm bất hoạt hoặc phá huỷ các gen mã hoá cho độc lực của tác nhân gây bệnh. Vì nguồn kháng nguyên hầu nh− không bị thay đổi nên vắc xin này cũng có hiệu lực rất cao, khả năng bảo vệ cơ thể rất tốt. Nh−ng các nghiên cứu về mức độ an toàn của vắc xin cho thấy, các chủng vắc xin đ−ợc tạo ra lại có tính di truyền không ổn định. Các gen độc đã bị bất hoạt nh−ng sau một thời gian nó có thể phục hồi và vì thế vắc xin sống nh−ợc độc cũng còn mang rủi ro lớn. Gần đây, nhờ sự phát triển nh− vũ bão của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã nghĩ ra việc tạo vắc xin phòng bệnh mới dựa vào kháng nguyên tiểu phần. Vì là kháng nguyên tiểu phần nên vắc xin này sẽ có độ an toàn rất cao và khả năng bảo hộ vẫn đ−ợc đảm bảo. Đây là loại vắc xin đang đ−ợc quan tâm nghiên cứu hàng đầu và sẽ đ−ợc sử dụng rộng rãi trong một t−ơng lai không xa. Trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng nhất ở vật nuôi, phải kể đến vi rut gây bệnh Lở mồm long móng (LMLM) (Loeffler và Frosch, 1898), vi rut Dịch tả lợn (USA, 1833; trích dẫn theo Sharma, 1995), vi rut gây bệnh Newcastle (Kranevel, 1926), vi rut dại (Zinke, 1804).... Với vi khuẩn gây thiệt hại nhiều nhất cho ngành chăn nuôi phải kể đến là tụ huyết trùng trâu bò, tụ huyết trùng lợn, tụ huyết trùng gia cầm do vi khuẩn Pasteurella multocida, và các bệnh của gia súc gia cầm do vi khuẩn Salmonella spp. (Salmonellosis). ở các n−ớc có nền khoa học phát triển cao, ng−ời ta đã sản xuất thành công các loại vắc xin t−ơng ứng đối với các bệnh kể trên. Ví dụ, đối với vắc xin LMLM, hiện nay có 8 n−ớc sản xuất, mà chủ yếu là Pháp, Anh, Hà lan và Nga (Liên xô cũ)… với sản phẩm là vắc xin vô hoạt dùng bổ trợ dầu. ở châu á, Trung quốc và Thái lan cũng tiến hành sản xuất vắc xin LMLM với số l−ợng hạn chế, chủ yếu để dùng trong n−ớc. Đối với các bệnh khác, mặc dù chủng vi sinh vật dùng để sản xuất vắc xin có thể khác nhau, nh−ng hầu hết các n−ớc đều tự chủ sản xuất và tự đảm bảo đ−ợc nhu cầu vắc xin trong n−ớc. 16 Đối với bệnh tụ huyết trùng trâu bò, hầu hết các n−ớc có bệnh đều sản xuất vắc xin từ một chủng vi khuẩn P. multocida nào đó và đều tiến hành các ch−ơng trình tiêm phòng (Ramdan và Adler, 1993). Nhìn chung, vắc xin chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò th−ờng đ−ợc dùng là vắc xin chết với bổ trợ keo phèn hoặc bổ trợ dầu. ở Iran, ng−ời ta lại −a dùng vắc xin với bổ trợ saponin và dạng cải tiến sau này đ−ợc gọi là vắc xin phocmôn hóa có bổ trợ saponin (Theo FAO, 1979). Cũng đã có những tác giả đề xuất việc dùng vắc xin là chất chiết đã đ−ợc tinh khiết (purified extracts) nh− Penn và Nagy (1974, 1976), Muniandy và cs (1993). Cũng có một số thông báo về việc dùng vắc xin nh−ợc độc (Adelberg và cs, 1965; Oeschger và Berlyn, 1974; De Alwis và Carter, 1980). Tựu chung lại, muốn một vắc xin có hiệu quả trong việc phòng chốnng bệnh tụ huyết trùng trâu bò, ngoài các yếu tố quan trọng nh− nồng độ kháng nguyên..., thì sự t−ơng đồng giữa chủng vi khuẩn dùng để chế vắc xin và chủng vi khuẩn gây bệnh ngoài thực địa là điều kiện hết sức quan trọng. Với nhũng thành tựu của sinh học phân tử (SHPT), khoa học càng ngày càng hiểu biết rõ ràng hơn về bản chất gây bệnh của vi sinh vật, khả năng phòng vệ của cơ thể vật chủ với mầm bệnh và các yếu tố đóng vai trò quyết định trong đáp ứng của vật chủ đối với vi sinh vật (Zinkarnagel, 1999). Càng ngày, ng−ời ta càng hiểu chắc chắn hơn rằng không phải vật chủ hình thành đáp ứng miễn dịch đối với toàn bộ prôtêin cấu trúc của một vi sinh vật gây bệnh nào đó. Nói cách khác, không phải tất cả kháng nguyên (prôtêin) đều có khả năng gây đáp ứng miễn dịch (đặc biệt là miễn dịch phòng hộ) t−ơng tự nh− nhau. Chính vì thế, càng ngày càng thấy nhiều nghiên cứu về vắc xin tái tổ hợp (recombinant vaccines) dùng phòng bệnh cho gia súc, gia cầm, ví dụ nh− đối với bệnh LMLM (Bergmann và cs, 2000) Cedillo-Barron, 2001; Mason và Grubman, 2001), bệnh Newcastle (Carpentier, 1994; Wu, 2000; Huang, 2001), bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm của lợn (Sestak et al., 1998, Tuboly, 2001).... tức là các vắc xin trong đó không có mầm bệnh (cho dù là nh−ợc độc hoặc vô hoạt) mà chỉ có các kháng nguyên (tức là các prôtêin) có khả năng kích thích cơ thể vật chủ sản sinh đáp ứng miễn dịch phòng hộ. Việc ứng dụng các kỹ thuật SHPT để sản xuất các vắc xin tái tổ hợp nhằm tạo ra một vắc xin an toàn, có tính sinh miễn dịch cao ứng dụng trong phòng bệnh cho gia súc và gia cầm đã và đang đ−ợc thực hiện ở hầu hết các quốc gia tiên tiến trên thế giới. Các 17 tác nhân gây bệnh quan trọng này đã đ−ợc nghiên cứu rất chi tiết ở mức độ phân tử. Trình tự nhiều gen quan trọng mã hóa cho các protein khác nhau của các đối t−ợng này nh− gen mã hóa cho protein vỏ, gen mã hóa cho kháng nguyên liên kết, kháng nguyên gây ng−ng kết hồng cầu (HA) cũng nh− neuraminidaza (NA) của các vi rút, gen mã hóa cho các độc tố cũng nh− các tính trạng khác nhau của vi khuẩn đã đ−ợc đăng ký trong Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế. Có thể truy cập và ghi chép lại trình tự các bộ gen hoặc các đoạn gen quan trọng của hầu hết các mầm bệnh nguy hiểm cho gia súc và gia cầm tại Website của Viện Hàn lâm Y học Hoa kỳ và các Websites có liên quan theo địa chỉ: (). Để sản xuất một vắc xin có hiệu quả phòng hộ cao, việc lựa chọn chủng vi sinh vật để chế vẵc xin phù hợp về tính kháng nguyên với chủng vi rut gây bệnh ngoài thực địa là điều hết sức quan trọng. Điều này trở nên rất rõ ràng và hiển nhiên khi chúng ta biết rằng đối với vi rut LMLM có 7 type huyết thanh và hơn 70 d−ới type (subtypes) (Kitching, 1999, 2000). Đối với vi khuẩn P. multocida ng−ời ta đã phân lập đ−ợc hàng ngàn chủng vi khuẩn với phân nhóm A, B, D, và E với tính chất gây bệnh và tính kháng nguyên hoàn toàn khác biệt nhau (de Alwis, 1996, 1998). Cũng t−ơng tự nh− vậy, trong thiên nhiên tồn tại hàng ngàn chủng vi khuẩn Salmonella mà khả năng gây bệnh cũng nh− tính kháng nguyên của chúng đối với cùng một vật chủ hoặc với các vật chủ khác nhau thì hoàn toàn khác nhau. Cũng chính vì lẽ đó, hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử nh−: Ribotyping, PCR, lai phân tử, RFLP, điện di tr−ờng xung điện v.v... đã đ−ợc sử dụng để phát hiện cũng nh− định type các tác nhân gây bệnh. Đặc biệt đối với các tác nhân gây bệnh nguy hiểm có thể gây thành đại dịch và có tính biến đổi kháng nguyên rất phức tạp nh− vi rut gây bệnh LMLM, vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng thì việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ một các chính xác các chủng vi rút hay vi khuẩn phân lập đều đ−ợc tất cả các n−ớc trên thế giới đặc biệt quan tâm. Đã có rất nhiều công trình công bố về việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ vi khuẩn P. multocida và xác định typ và subtyp của vi rut LMLM. Việc định subtyp một cách chính xác bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cực kỳ quan trọng vì nó giúp ta tìm ra qui luật l−u hành của tác nhân gây bệnh, chọn chủng chính xác, thích hợp cho việc sản xuất và ứng dụng vắc xin một cách hiệu quả. Đó cũng chính là lý do tại sao đối với các n−ớc ch−a tự xác định đ−ợc subtyp của chủng vi rut LMLM l−u hành trong các ổ dịch 18 của n−ớc mình đều phải gửi bệnh phẩm đến Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế tại Pirbright, V−ơng quốc Anh. Trong hoàn cảnh n−ớc ta, việc ứng dụng kỹ thuật SHPT trong việc định typ vi rút LMLM trở nên cấp thiết để chúng ta có thể chủ động trong công việc này, không phải mua Kit ELISA của n−ớc ngoài, và sau đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn ở mức độ sub-typ. Các prôtêin tái tổ hợp dùng trong nghiên cứu và phòng chống các bệnh LMLM (Leippert, 2001; Nayak và cs, 2001), Newcastle (Baumans, 2001), và Gumboro (Gomes, 2000)... cũng đã đ−ợc nhiều n−ớc nh− Mỹ, Nhật bản, Australia, Pháp, Canada, Anh v.v... nghiên cứu thành công để từng b−ớc thay thế cho các kháng nguyên toàn thân vi khuẩn hay toàn thân vi rut. Ng−ời ta đã tách đ−ợc gen mã hóa cho kháng nguyên glycoprotein vỏ của nhiều loại vi rut, ví dụ nh− vi rut LMLM, Gumbro, gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của vi rut Newcastle nh− kháng nguyên liên kết, kháng nguyên ng−ng kết hồng cầu, kháng nguyên neuraminidaza sau đó cho biểu hiện thành công với vi rut đậu gà hoặc Baculovirut hay trong vi khuẩn Salmonella (xem Shieh và cs, 2001). Càng ngày càng thấy xuất hiện nhiều vacxin thế hệ mới trên thị tr−ờng. Rõ ràng đây là một h−ớng nghiên cứu mới trong t−ơng lai nhằm mang lại hiệu quả của công việc phát hiện bệnh, phòng trị bệnh tốt mà lại đảm bảo dịch bệnh không có cơ hội trở lại, tạo điều kiện cho công cuộc khống chế dẫn đến tiêu diệt bệnh đ−ợc dễ dàng. Đây là một trong những điều kiện cơ bản nhằm tạo ra một đàn gia súc gia cầm sạch bệnh với thịt và sản phẩm khác từ động vật có chất l−ợng tốt cho nhân dân tiêu dùng và đảm bảo chất l−ợng cho xuất khẩu. Vi khuẩn Salmonella, tác nhân gây bệnh cho hầu hết các loài gia súc, gia cầm và ng−ời đã đ−ợc biết đến từ hàng trăm năm nay (Trích dẫn theo Hahn G, 1993). Nhờ có khả năng thích ứng với nhiều loại vật chủ, nên số l−ợng serotyp Salmonella không ngừng gia tăng kể từ khi nó đ−ợc phát hiện và đ−ợc công nhận là tác nhân gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1885. ở đầu thập kỷ 90, số l−ợng chủng Salmonella đã vào khoảng 2000 (Wilcock, Schwartz 1992). Chỉ 5 năm sau, con số đó đã đạt đến 3000 (Plonait, Bickhardt 1997). Bệnh do Salmonella spp gây ra đ−ợc phát hiện ở khắp các châu lục trên thế giới. Bệnh ở bê nghé chủ yếu do 2 loài S. dublin và S. typhi murium. Đặc biệt, ở gà bệnh do các loài Salmonella gây ra đ−ợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Ngoài 2 loài Salmonella là S. pullorum và S. gallinarum gây bệnh đặc hiệu cho gà sinh sản còn 19 có hai loài khác là S. typhi murium và S. enteritidis nhiễm trên gà mọi lứa tuổi. Hiện nay, S. typhi murium và S. enteritidis vẫn còn đang là vấn đề nan giải ngay cả với các quốc gia có nền kinh tế phát triển. ở Mỹ, thiệt hại do S. typhi murium và S. enteritidis gây ra hàng năm −ớc tính 77 triệu USD. ở úc, cũng th−ờng phải tốn kém hàng trăm ngàn USD để ngăn chặn các ổ dịch do S. typhi murium gây nên. ở ng−ời Salmonella spp. cũng đ−ợc đánh giá là tác nhân quan trọng gây ngộ độc thực phẩm cũng nh− gây nhiễm khuẩn đ−ờng tiêu hoá. ở Đức, năm 1994 đã thông báo có 1,6 triệu ng−ời bị ngộ độc thực phẩm do Salmonella. ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 112,6 triệu ng−ời bị ngộ độc thực phẩm. ở Canada cứ 11 ng−ời dân thì có 1 ng−ời bị ngộ độc thực phẩm. Chính vì những tác hại to lớn của vi khuẩn Salmonella mà hầu hết các n−ớc trên thế giới đã đầu t− nghiên cứu tìm các giải pháp phòng chống. Đến nay, đã có nhiều loại vacxin ra đời, đã hạn chế đ−ợc đáng kể thiệt hại do Salmonella spp gây ra. Các nhà nghiên cứu ở Đức cho rằng sử dụng vacxin sống đột biến gen Zoosaloral H và TAD Salmonella VACRT, với những lợi thế là vừa tạo miễn dịch dịch thể vừa tạo miễn dịch tế bào, có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với việc phòng chống bệnh do Salmonella gây ra ở gà, và cũng là biện pháp hữu hiệu ngăn chặn nguồn tàng trữ và lây lan mầm bệnh quan trọng nhất cho ng−ời (Martinvà cs, 1996). Việt nam là một n−ớc nằm ở vùng nhiệt đới có độ ẩm cao rất phù hợp với sự phát triển của nhiều loại vi sinh và và cũng chính vì thế nhiều bệnh truyền nhiểm dễ dàng phát sinh không những ở ng−ời mà cả ở vật nuôi. Hàng năm, các bệnh ở vật nuôi, đặc biệt là các bệnh LMLM, bệnh tụ huyết trùng, bệnh Newcastle, và bệnh do Salmonella gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi của n−ớc ta. Đối với tình hình trong n−ớc, bệnh Lở mồm Long móng là bệnh nguy hiểm nhất của gia súc, đ−ợc xếp hàng đầu trong danh sách các bệnh bảng A của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE). Bệnh đ−ợc phát hiện lần đầu tiên ở Nha Trang (Trung bộ) (năm 1898) và sau đó là ở Nam bộ (1920). Năm 1937-1940, có dịch ở Quảng ngãi. Năm 1952, bệnh phát ra ở Thừa thiên, đến 1953-1954 lan tràn vào miền Nam Trung bộ, ra miền Bắc Trung bộ (khu 4), khu 3, khu Tả ngạn, trung và th−ợng du Bắc bộ, Việt bắc và Tây bắc (Điện biên). Tháng 4 năm 1955, bệnh lại tái phát ở khu 3 và lan sang các khu Tả ngạn, Việt bắc, vào khu 4 (Trích dẫn theo Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1974). Có thể nói, tr−ớc đây bệnh xảy ra lẻ tẻ trong khắp cả n−ớc. Năm 1999, bệnh xảy ra tại 60 trong số 61 tỉnh, 20 thành của Việt nam (Theo tài liệu của Cục Thú y, Bộ NN và PTNT). Ngoài khả năng gây chết trực tiếp cho gia súc non do bội nhiễm vi khuẩn, gia súc bị bệnh LMLM bỏ ăn (do đau miệng), không có khả năng cày kéo và trở nên gầy yếu, kém tiết sữa...và đây chính là các thiệt hại chủ yếu đối với ngành chăn nuôi và ngành trồng trọt. Mặt khác, theo qui định của Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE), không đ−ợc xuất và nhập động vật (trâu bò, lợn, dê...) và sản phẩm động vật khi chúng bị mắc bệnh LMLM. Có thể nói, bệnh LMLM là bệnh gây trở ngại lớn nhất cho th−ơng mại quốc tế đối với động vật và các sản phẩm từ động vật. Đặc biệt, bệnh đã gây trở ngại cho việc th−ơng mại theo trục Bắc-Nam. Bệnh Lở mồm long móng xảy ra thành dịch địa ph−ơng hoặc dịch lẻ tẻ chủ yếu ở các n−ớc ph−ơng Nam (ngoại trừ ổ dịch Lở mồm long móng gần đây ở V−ơng Quốc Anh xảy ra từ tháng 3 năm 2001) và điều này là cơ sở cho việc cấm vận gia súc sống cũng nh− các sản phẩm thịt t−ơi từ các n−ớc phía Nam lên các n−ớc không có dịch LMLM ở phía Bắc. Mặc dù LMLM là một bệnh đã đ−ợc thừa nhận là phổ biến ở Việt Nam. Hiện tại, chúng ta ch−a nghiên cứu về bệnh này nên cũng ch−a nghiên cứu sản xuất vắc xin cũng nh− nghiên cứu các ph−ơng pháp chẩn đoán định type. Để phòng chống bệnh, hiện tại, chúng ta phải nhập vắc xin từ n−ớc ngoài và chủ yếu là từ các công ty nh− Merial, Intervet, Bayer và một số ít của Virbac. Theo phân loại hiện nay, vi rut gây bệnh LMLM có 7 typ với hơn 70 biến chủng d−ới typ (sub-typ) (Kitching, 2000) và các chủng dùng dể sản xuất vắc xin bán tại Việt nam chỉ là 3 đối với vắc xin của Merial và là 2 đối với vắc xin của Intervet. Chúng ta đã nhập và triển khai tiêm chủng phòng bệnh LMLM, tuy nhiên bệnh vẫn tồn tại thành dịch địa ph−ơng trong ở nhiều vùng trong cả n−ớc (Theo tài liệu của Phòng Dịch tễ, Cục Thú y). Chẩn đoán và định subtyp một cách chính xác sẽ giúp chúng ta tìm ra nguồn gốc của bệnh, định h−ớng cho việc nhập vắc xin để hạn chế và từng b−ớc tiến tới thanh toán bệnh này. Cho đến nay ch−a có một cơ sở nào trong n−ớc tiến hành phân lập vi rút cũng nh− ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định typ và subtyp một cách chính xác loại vi rut nguy hiểm này. Để chẩn đoán (và đồng thời là định typ), Cục Thú y hàng năm phải mua Kit chẩn đoán ELISA của n−ớc ngoài và phải gửi bệnh phẩm tới Phòng Thí nghiệm Tham chiếu quốc tế về LMLM ở Pỉbright (Anh quốc) để nhờ xác định subtyp. 21 Chính vì những lý do trên đây, chúng ta cần phải xây dựng một phòng thí nghiệm nghiên cứu về bệnh LMLM, phải tiến hành phân lập vi rút mở đ−ờng cho việc chủ động xác định typ và subtyp của vi rút tại Việt nam. Rõ ràng đây là một công việc hết sức khó khăn, đòi hỏi sự đầu t− của nhà n−ớc để xây dựng cơ sở vật chất và đội ngũ cán bộ khoa học kỹ thuật có đủ khả năng nghiên cứu về căn bệnh nguy hiểm này. Cũng rất rõ ràng là nếu chúng ta không bắt tay vào việc xây dựng một phòng thí nghiệm chuyên hóa, không đào tạo đội ngũ cán bộ và không tiến hành phân lập vi rút LMLM gây ra các ổ dịch ở Việt nam thì chúng ta không thể chủ động phòng chống bệnh, không thể hội nhập kinh tế với các n−ớc. Bệnh tụ huyết trùng (THT) tồn tại ở hầu hết tất cả các n−ớc trên thế giới đ−ợc nhiều nhà nghiên cứu khẳng định là bệnh theo mùa vụ (Vitoz, 1952, Phan Thanh Ph−ợng, 1969, De Alwis, 1992...). Bệnh th−ờng xảy ra vào tr−ớc và sau mùa m−a lũ và vào những nơi mà có khí hậu ẩm −ớt, nắng, nóng nhiều, m−a nhiều. Do đó, bệnh th−ờng thấy ở vùng Đông Nam châu á. Cho đến nay bệnh tụ huyết trùng ở gia súc gia cầm vẫn còn là mối quan tâm lớn của nhiều n−ớc trên thế giới, đặc biệt là các n−ớc ở vùng Đông Nam châu á, vì những bệnh này vẫn còn gây nhiều thiệt hại lớn cho chăn nuôi ở những n−ớc trong vùng. ở Việt nam, bệnh THT vẫn còn là một bệnh gây nhiều thiệt hại trong chăn nuôi gia súc gia cầm. Nhiều vụ dịch tụ huyết trùng xảy ra nh−ng chúng ta ch−a xác định đ−ợc type vi khuẩn một cách chính xác, nên việc đề xuất biện pháp khống chế ch−a phù hợp, do đó hiệu quả phòng chống bệnh ch−a đ−ợc cao, hoặc không có hiệu quả. Tình trạng này làm ảnh h−ởng nặng nề đến năng suất chăn nuôi. Điểm qua tình hình bệnh THT trong những năm gần đây cho thấy: số địa ph−ơng bị bệnh THT trâu bò có chiều h−ớng gia tăng. Đối với bệnh tụ huyết trùng trâu bò, chúng ta đã có thể tự sản xuất đ−ợc vắc xin bằng các chủng vi khuẩn nhập từ n−ớc ngoài, tuy nhiên việc giám sát dịch tễ học đối với vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng, đặc biệt là việc định typ một cách chính xác là việc làm hết sức quan trọng. Điều đó giúp chúng ta chọn chủng thích hợp để sản xuất và ứng dụng vắc xin một cách hiệu quả. Thực tế cho thấy, có nơi do tiêm phòng kém, nên dịch bệnh xảy ra, làm chết hàng ngàn gia súc, gia cầm; có nơi tiêm phòng xong dịch vẫn xảy ra. Nh− vậy dịch có thể nổ ra do tiêm phòng kém, hoặc 22 do chẩn đoán ch−a chính xác, hoặc có thể mầm gây bệnh là vi khuẩn serotyp khác với serotyp của chủng dùng để sản xuất vắc xin. Bởi thế, do những yêu cầu cấp bách của thực tế và do đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn tụ huyết trùng nên chúng ta phải có trong tay số liệu về các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập đ−ợc từ trâu bò bị bệnh THT ở các địa ph−ơng khác nhau và so sánh các chủng này với các chủng đang dùng để chế vắc xin trong n−ớc để tìm ra một chủng vắc xin thích hợp, cho hiệu quả phòng hộ cao. Bệnh do các loài Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm cũng đã đ−ợc quan tâm nghiên cứu từ cuối thập kỷ 70. Nguyễn Văn Lãm và cộng sự (1968) cũng đã phát hiện đ−ợc nguyên nhân gây bệnh phó th−ơng hàn lợn con là loài S. cholerae suis. Tác giả cũng đã chế tạo thành công vacxin để phòng chống bệnh. Sau đó cũng có nhiều công trình nghiên cứu khác đề cập đến loài vi khuẩn này với tác nhân gây bệnh ở nhiều loại gia súc gia cầm khác nhau đ−ợc nuôi ở hầu hết các vùng trong cả n−ớc (Đoàn Băng Tâm, 1987; Nguyễn Thị Nội, 1989; Lê Văn Tạo và cs, 1992; Vũ Bình MInh và Cù Hữu Phú, 1999; Trần Thị Hạnh và cs, 1997, 1998, 1999, 2000). Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu còn mang tính địa ph−ơng, cục bộ rời rạc, ch−a tìm ra đ−ợc những kết luận tầm quan trọng tính nguy hiểm của bệnh. Đặc biệt là việc định typ một cách chính xác các serotyp gây bệnh còn nhiều hạn chế. Do vậy mà các vacxin cũng nh− các biện pháp phòng chống bệnh hiện nay vẫn ch−a thực sự có hiệu qủa. ở n−ớc ta cho đến nay mới chỉ có duy nhất vacxin phó th−ơng hàn lợn phòng bệnh do S. cholerae suis gây ra. Còn ở các gia súc khác và gia cầm thì hầu nh− ch−a có vacxin. Có lẽ đây cũng là một trong những yếu tố góp phần làm gia tăng nhanh chóng tình trạng ngộ độc thực phẩm cũng nh− bệnh nhiễm khuẩn đ−ờng tiêu hoá ở ng−ời trong những năm gần đây. Bởi lẽ trong các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella cũng đ−ợc đánh giá là một tác nhân quan trọng bên cạnh vi khuẩn Shigella và E. coli. Năm 1999, ở n−ớc ta có 300 vụ ngộ độc thực phẩm với một số ng−ời bị bệnh là 7000 ng−ời, trong đó có 71 tr−ờng hợp tử vong. Đến cuối năm 2000 số ng−ời ngộ độc thực phẩm đã tăng lên 9000. Trên đây là những con số rất đáng lo ngại cho ng−ời tiêu dùng trong và ngoài n−ớc. Đây cũng là vấn đề cấp bách đặt ra đối với các tổ chức, các cơ quan hữu quan, các nhà quản lý và các nhà khoa học vì lợi ích kinh tế của quốc gia, vì sự an toàn của ng−ời tiêu dùng nói riêng và cho sức khoẻ cộng đồng nói chung. Sử dụng vacxin có tác dụng 23 phòng bệnh đạt hiệu qủa cao là biện pháp tốt nhất để phòng chống dịch bệnh nói chung và bệnh do Salmonella gây ra ở gia súc, gia cầm nói riêng. Xuất phát từ tình hình dịch bệnh trong n−ớc và tri thức của nhân loại về chẩn đoán và phòng trừ các bệnh của gia súc, chúng tôi đã nhận đơn đặt hàng của Bộ Khoa học và Công nghệ để thực hiện Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Nhà n−ớc mang mã số KC.04.06 mang tiêu đề "Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vắc xin nh−ợc độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc gia cầm và ứng dụng kỹ thuật gen xác định type vi rut lở mồm long móng (LMLM)". Các mục tiêu của Đề tài là: - Tạo công nghệ sản xuất vắc xin nh−ợc độc, biến nạp gen phòng bệnh cho gà. - Lựa chọn chủng vi khuẩn tụ huyết trùng để sản xuất vắc xin. - Định type vi rut LMLM bằng kỹ thuật sinh học phân tử (RT-PCR) để kựa chọn vacxin phù hợp. Để thực hiện các mục tiêu này, nh− đã nói ở phần trên, Đề tài KC.04.06 đ−ợc chia làm 4 nhánh với các nội dung khác nhau phù hợp với các mục tiêu cụ thể. Tuy nhiên, trong báo cáo tổng thể này, chúng tôi sẽ cố gắng trình bày một cách liên hoàn các kết quả thu đ−ợc theo các mục tiêu đã đề ra. Xin đ−ợc trân trọng giới thiệu báo cáo này. 24 Ch−ơng I Tổng quan tài liệu 1.1. Bệnh Tụ huyết trùng trâu bò. 1.1.1. Vài nét về lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu về bệnh tụ huyết trùng trên thế giới Năm 1878, Bollinger là ng−ời đầu tiên phát hiện bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại Đức. Năm 1879, Tousain phát hiện bệnh tụ huyết trùng ở gà. Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học ng−ời Pháp đã phát hiện đ−ợc vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera). Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết (Septicaemia disease). Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh ở lợn. Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học ng−ời Đức phát hiện thấy sự t−ơng đồng về triệu chứng, bệnh tích ở bò, gà và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng. Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh và đặt tên là Barbone. Trevissan đã đề nghị đặt tên chung cho giống vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella để t−ởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, ng−ời đầu tiên phát hiện vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà. Từ đó ng−ời ta căn cứ vào đặc tính sinh bệnh cụ thể cho từng loài vật, chia Pasteurella thành các loài khác nhau: Pasteurella gây bệnh cho bò là: P. boviseptica Pasteurella gây bệnh cho trâu là: P. bubaliseptica Pasteurella gây bệnh cho lợn là: P. suiseptica Pasteurella gây bệnh chogia cầm là: P. aviseptica 25 Năm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là: Pasteurella multocida để thể hiện cho khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của vi khuẩn này. 1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Việt Nam D−ơng Thế Long (1994) đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị bệnh THT trâu bò ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khẳng định: Tiêm phòng bệnh THT là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu. Trâu bò đ−ợc tiêm vacxin vào cuối tháng 3, đầu tháng 4 là thích hợp. Cùng năm, tác giả tìm hiểu mối t−ơng quan giữa các yếu tố khí hậu thời tiết và tình hình dịch bệnh THT trâu bò, cho biết: Các yếu tố m−a, nhiệt độ, ẩm độ, nắng tác động theo mức độ giảm dần đến tình hình phát sinh và phát triển dịch bệnh, tháng 6 là đỉnh cao của mùa dịch và trùng với mùa m−a của tỉnh Sơn La. Phan Thanh Ph−ợng và cộng sự, 1994 nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu sinh lý ở gia súc, gia cầm đ−ợc tiêm vacxin THT có các bổ trợ khác nhau nh−: Marcol 52 và Montanid 888, parafin và lanolin, dầu lạc, … khẳng định rằng các chỉ tiêu sinh lý có biến động nằm trong giới hạn sinh lý bình th−ờng. Nguyễn Ngã, 1995 nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi trùng gây bệnh THT trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn địa ph−ơng thích hợp có khả năng phối hợp với giống n−ớc ngoài để chế tạo vacxin đạt hiệu lực cao. Kết quả là vi khuẩn P. multocida chủng TS địa ph−ơng có khả năng bảo hộ cao và ổn định hơn cả. Hoàng Đạo Phấn, 1996 nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc hiệu đối với P. multocida phân lập từ gia súc, gia cầm. Kết quả cho thấy: 84,2% trong số 76 chủng vi khuẩn bị dung giải bởi các thực khuẩn thể đặc hiệu. Nguyễn Thiên Thu và Nguyễn Ngã, 1996 phân lập và xác định type huyết thanh P.multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam. Kết quả: trong tổng số 469 bệnh phẩm (dịch ngoáy mũi) có 21 bệnh phẩm có vi khuẩn gây bệnh THT, dùng phản ứng IHA xác định thấy có 18/21 mẫu thuộc type B Carter - type gây bệnh THT có thể thấy ở hạch lympho, niêm mạc đ−ờng hô hấp trên của trâu bò - với hiệu giá ng−ng kết 1/64. 26 Tr−ơng Văn Dung, 1998 nghiên cứu đặc tính và định type huyết thanh học (HTH) vi khuẩn gây bệnh THT trâu bò phân lập đ−ợc ở một số tỉnh phía bắc, kết quả là, trong 92 chủng có 14 chủng thuộc type A, 23 chủng thuộc type B, 30 chủng thuộc liên type A, B, D và 14 chủng không xác định. Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan, 2000 đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định type vi khuẩn P. multocida phân lập ở miền Trung Việt Nam. HB1, HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi đ−ợc dùng để xác định P. multocida type B gây bại huyết, xuất huyết. Trong số 7 chủng chuẩn quốc gia (I2, IR, 41, 43, 99, 483, 8936) thì chỉ có chủng IR là có hình ảnh đặc tr−ng của type B. TOX1, TOX2 là cặp mồi dùng để xác định P. multocida type A và D có gen độc tố (toxin) A đã xác định chỉ có chủng 99 mới có gen độc tố (toxin) A. Cao Văn Hồng, 2002 nghiên cứu về mùa dịch và ảnh h−ởng các yếu tố khí hậu đến bệnh THT gia súc ở Đăk lăk. Kết quả cho biết thời tiết có tác động đến bệnh THT gia súc, ảnh h−ởng của l−ợng m−a đến số gia súc ốm do THT là rõ rệt nhất. Tr−ơng Văn Dung, Hoàng Xuân Nghinh và cộng sự, 2000 xác định type HTH vi khuẩn gây bệnh THT trâu bò: - Type B gây bại huyết-xuất huyết (Haemorhagic Septicaemia) - Type A, D gây viêm phổi bê, nghé (Bovine Pneumonic Pasteurellosis) - Type D và Bordetella bronchiseptica gây viêm teo mũi truyền nhiễm. 1.1.2. Tóm l−ợc về nghiên cứu vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng Phan Thanh Ph−ợng và cộng sự nghiên cứu chế tạo vacxin nhũ hoá THT trâu bò có hiệu lực miễn dịch cao nhằm thay thế vacxin keo phèn có hiệu lực miễn dịch thấp. Kết quả: Chủng IR có bổ trợ lanolin và parafin có hoạt tính miễn dịch cao để chế vacxin nhũ hoá (kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1979- 1984) Nguyễn Ngã, Lê Minh Tâm và Nguyễn Bá C−ờng nghiên cứu và sản xuất vacxin THT trâu bò chủng Iran (kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật Thú y 1985-1989) Phan Thanh Ph−ợng và cộng sự nghiên cứu vacxin nhũ hoá THT trâu bò trong sản xuất. Kết quả: Sản xuất kháng nguyên trong bình lên men sục khí, tạo nhũ trong 27 máy gây nhũ, bảo quản vacxin trong tủ lạnh 4-100C, hiệu lực vacxin đạt 100% trong 12 tháng (công trình nghiên cứu KHKT 1990-1991) Vacxin phòng bệnh THT có 3 loại: Vacxin vô hoạt không có chất bổ trợ (Bacterin), vacxin vô hoạt có chất bổ trợ và vacxin tổng hợp. Vacxin bacterin: Vi khuẩn đ−ợc vô hoạt bằng formol với nồng độ 0,3%, vacxin có độ dài miễn dịch ngắn 3-4 tháng. Sau khi tiêm vacxin, có một tỷ lệ trâu bò phản ứng mạnh với vacxin, đôi khi có thể gây chết trâu bò. Hiện nay không sử dụng. Vacxin vô hoạt có chất bổ trợ: Vi khuẩn sau khi đ−ợc vô hoạt bằng formol 0,3% đ−ợc phối hợp với các chất bổ trợ nh− keo phèn, phèn chua hoặc dầu khoáng. Vacxin này dễ bảo quản, độ an toàn cao, độ dài miễn dịch t−ơng đối tốt 4-6 tháng. Theo danh mục thuốc thú y năm 1998 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, n−ớc ta hiện đang sử dụng chủ yếu là vacxin vô hoạt có chất bổ trợ phòng bệnh THT, gồm: * Vacxin THT trâu bò vô hoạt có bổ trợ phèn chua, chế từ chủng P52 do NAVETCO sản xuất. * Vacxin THT trâu bò vô hoạt có bổ trợ chất keo phèn chế từ chủng Pb1, Pb2, PbU1, PbU2 do Xí nghiệp thuốc thú y trung −ơng sản xuất. * Vacxin THT trâu bò vô hoạt có bổ trợ chất keo phèn, chế từ chủng IR do phân Viện Thú y miền trung sản xuất. * Vacxin THT trâu bò nhũ hoá, chế từ chủng IR có chất bổ trợ tạo nhũ là dầu khoáng do Viện Thú y sản xuất. Vacxin tổng hợp sinh học phân tử đã và đang có những b−ớc tiến đáng kể, điều đó cho phép ta nghĩ đến việc chế ra các loại vacxin tổng hợp, không những để phòng bệnh THT mà còn để phòng chống các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm khác trong t−ơng lai. 1.1.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida 1.1.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn P. multocida 28 Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và Pasteurella haemolytica. 1.1.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích th−ớc 0,25 -0,4 ì 0,4 -1,5 àm. Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di động. 1.1.3.3. Tính chất bắt màu của vi khuẩn. Pasteurella multocida bắt màu gram âm với thuốc nhuộm gram, vi khuẩn th−ờng dễ bắt màu với thuốc nhuộm anilin, tốt nhất với Methylen blue, đỏ Fucsin, có thể thấy khi dùng ph−ơng pháp nhuộm Giemsa và Wright. Các chủng có hình thành giáp mô thì có thể nhuộm bằng ph−ơng pháp nhuộm Hiss và Zilnelson. Trong cơ thể gia súc mắc bệnh (máu và phủ tạng: gan, lách , phổi…) và trong môi tr−ờng mới nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện t−ợng bắt màu sẫm ở hai đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu, nên ng−ời ta gọi Pasteurella là vi khuẩn l−ỡng cực. Manninger, 1919 giải thích tính l−ỡng cực của vi khuẩn, là do tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn phân chia, vi khuẩn tăng lên về kích th−ớc, độc lực và nguyên sinh chất, khi đó nguyên sinh chất dung giải dồn về hai đầu của vi khuẩn. Trong canh khuẩn th−ờng thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái nh− hình gậy dài, dùi cui, quả đấm, kích th−ớc lớn hơn bình th−ờng, có khi dài 2 – 3 àm hay hơn nữa. 1.1.3.4. Đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn P. multocida: P. multocida là loại vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí không bắt buộc, có thể nuôi ở nhiệt độ từ 150C đến 380C (thích hợp nhất ở nhiệt độ 370C), pH từ 7,2 đến 7,4. Trên các môi tr−ờng nuôi cấy thông th−ờng vi khuẩn phát triển kém, trong môi tr−ờng có thêm huyết thanh, máu thì vi khuẩn phát triển tốt. * Trong môi tr−ờng n−ớc thịt: 29 Sau 24 giờ nuôi cấy ở tủ ấm 370C canh khuẩn đục, lắc có hiện t−ợng vẩn nh− s−ơng mù rồi lại mất, đáy ống có cặn nhầy, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi tr−ờng. Môi tr−ờng có mùi tanh đặc tr−ng. Theo Carter (1955), mùi tanh đặc tr−ng nhất ở pha vi khuẩn phát triển nhanh, trong môi tr−ờng n−ớc thịt, vi khuẩn P. multocida phát triển theo 4 pha lần l−ợt: Pha chậm, pha nhanh, pha cân bằng và pha suy thoái, để lâu thì mùi tanh giảm dần. * Trên môi tr−ờng thạch th−ờng: Sau khi nuôi cấy vi khuẩn 24 giờ ở 370C, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S. Khuẩn lạc nhỏ, trong suốt long lanh nh− hạt s−ơng, mặt khuẩn lạc vồng. Nuôi lâu khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi tr−ờng. Trên môi tr−ờng thạch th−ờng, vi khuẩn P. multocida phát triển thành những dạng khuẩn lạc sau: Khuẩn lạc dạng S (Smooth): Dạng khuẩn lạc trơn, rìa gọn, bóng láng, long lanh, mặt vồng, có dung quang sắc cầu vồng, là dạng khuẩn lạc của vi khuẩn có độc lực mạnh. Vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạc này th−ờng tạo thành lớp giáp mô dầy hơn vi khuẩn có dạng khuẩn lạc xù xì. Khuẩn lạc dạng R (Rough): Khuẩn lạc th−ờng dẹt, có rìa nhám xù xì, nhám, có dung quang màu xanh. Vi khuẩn có dạng khuẩn lạc này có độc lực yếu. Khuẩn lạc dạng M (Mucoid): Khuẩn lạc nhầy −ớt, có kích th−ớc to nhất trong 3 loại khuẩn lạc, rìa nhẵn, dung quang sắc cầu vồng, vi khuẩn có độc lực yếu hơn độc lực của vi khuẩn cho khuẩn lạc dạng S. Hình dạng khuẩn lạc cũng có thể thay đổi, nếu nuôi cấy lâu ngày thì kích th−ớc khuẩn lạc lớn hơn, nhớt và dính chặt vào mặt thạch (gọi là khuẩn lạc già). Nếu cấy chuyển nhiều lần thì giáp mô bị mất, kích th−ớc của khuẩn lạc sẽ nhỏ lại, không màu và trong suốt. Những vi khuẩn có giáp mô lớn là những vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc dạng nhầy, ít phát quang, có bờ tròn gọn, những vi khuẩn có giáp mô nhỏ hơn là những vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc trơn, bóng láng. * Trên môi tr−ờng thạch máu: 30 Vi khuẩn phát triển tốt hơn trong môi tr−ờng thạch th−ờng. P. multocida không làm dung huyết. Kích th−ớc khuẩn lạc to hơn khuẩn lạc trên môi tr−ờng thạch th−ờng. Môi tr−ờng này th−ờng để giữ giống vi khuẩn. * Trên môi tr−ờng thạch huyết thanh: Môi tr−ờng này dùng để giám định, phân lập và xác định độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida. Trên môi tr−ờng này, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc đặc biệt, có hiện t−ợng phát quang khi xem khuẩn lạc d−ới kính hiển vi có thị kính với độ phóng đại thấp (20 lần) và góc chiếu tới 450 của ánh sáng đèn. Tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau. Nếu vi khuẩn có độc lực cao thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm khoảng 2/3 diện tích khuẩn lạc, 1/3 diện tích còn lại của khuẩn lạc là màu vàng và vàng da cam. Khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent). Nếu vi khuẩn có độc lực vừa thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy có màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam. Khuẩn lạc loại này gọi là Fo (Orange Flourescent). Nếu vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện t−ợng dung quang, không màu và gọi là loại Nf (Not Fluorescent), khuẩn lạc nhỏ, tròn, trong suốt. Hiện t−ợng dung quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy vi khuẩn sau 16-18 giờ ở nhiệt độ 370C, nếu khuẩn lạc nuôi cấy quá giờ trên hiện t−ợng dung quang sẽ giảm và mất đi. Đặc tính dung quang của P. multocida lần đầu tiên đ−ợc Dekrut (1921) phát hiện. Những khuẩn lạc dạng S trên môi tr−ờng thạch đặc biệt sau 16 giờ đến không quá 24 giờ ở nhiệt độ 370C nuôi cấy th−ờng có tính dung quang mạnh. Khuẩn lạc dạng M và R không có đặc tính này. Theo Smith, đặc tính dung quang có quan hệ chặt chẽ với sự tạo vỏ của P. multocida. Dựa vào đặc tính này ng−ời ta có thể chọn đ−ợc những chủng vi khuẩn gây bệnh THT có tính kháng nguyên cao và khả năng gây miễn dịch tốt. * Trong môi tr−ờng gelatin: 31 Dọc theo đ−ờng cấy trích sâu, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc mịn, hình hạt, không làm tan chảy gelatin. 1.1.3.5. Đặc tính sinh hoá của Pasteurella multocida Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn P. multocida đã đ−ợc các nhà nghiên cứu khảo sát dựa trên nguyên lý: Vi khuẩn là một tế bào sống nên khi đ−ợc nuôi trong các môi tr−ờng dinh d−ỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay đổi độ pH của môi tr−ờng. Khi đó dựa vào các chất chỉ thị màu thì ng−ời ta có thể xác định đặc tính sinh hoá của chúng. Một số đặc tính sinh hoá thông th−ờng của P. multocida Đặc tính sinh hoá Phản ứng(+); (-) Khả năng dung huyết - Môi tr−ờng Macconkey - Môi tr−ờng Gelatin - Phản ứng sinh Indol + Phản ứng sinh H2S + Phản ứng khử Nitrat + MR (Methyl red) - VR (Voge – Praskauer) - KCN + Ure - Catalase + Oxydase + Citrat - Malonate - Arginine decarboxylase - Lysine decarboxylase - Omithine decarboxylase + Chú thích: (+) Phản ứng d−ơng tính (-) Phản ứng âm tính Theo Carter năm 1984, vi khuẩn P. multocida có các đặc tính sinh hoá sau: - D−ơng tính trong phản ứng Oxydase và phản ứng Catalase. - Âm tính khi kiểm tra khả năng dung huyết, khả năng di động, khả năng làm tan chảy Gelatin và khả năng mọc trên môi tr−ờng Macconkey. 32 - Lên men, không sinh hơi các loại đ−ờng: Glucose, saccarose, manitose, sorbit và xylose. - Không lên men các loại đ−ờng: Lactose, maltose, arabinose, rammose, salixin, dunxid và adonit. 1.1.3.6. Giáp mô của vi khuẩn Pasteurella multocida Giáp mô là một lớp vỏ nhầy bao bọc ngoài tế bào, đ−ợc sinh ở điều kiện nhất định trong quá trình sinh tr−ởng. Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác động có hại của môi tr−ờng. Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất dinh d−ỡng cho vi khuẩn. Theo Manniger, 1919 vi khuẩn có giáp mô th−ờng có độc lực cao, nh−ng độc lực của vi khuẩn phụ thuộc vào cấu trúc hoá học của giáp mô hơn là sự có mặt của chúng. Theo Carter, 1967 vi khuẩn phân lập đ−ợc từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số đều thấy có giáp mô và độc lực. Theo Bain, 1954 thành phần của giáp mô có chứa axít hyaluronic và gắn một lớp polysaccarit. Theo Carter, 1975 giáp mô của type A có cấu tạo bởi axít hyaluronic nh−ng có sự liên quan mật thiết với các thành phần khác nh− polysaccarit, protein và lipit. Theo Harmon, 1991 axít hyaluronic không gây hoạt hoá kháng thực bào, nh−ng chất chiết giáp mô có thể ức chế khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trong máu bò. Nếu tách axít hyaluronic khỏi giáp mô sẽ làm tăng khả năng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào động vật ký sinh và tăng tính mẫn cảm của vi khuẩn đối với sự thực bào. Theo Wilson, 1992 tính kháng nguyên giáp mô của P. multocida xác định theo type huyết thanh A, B, D, E, F. 1.1.3.7. Độc tố của Pasteurella multocida Theo Sawuata, 1984 một số chủng P. multocida serotype D có sinh ra một yếu tố đ−ợc gọi là yếu tố sinh hoại tử da (Dermo Necroti Toxin - DNT) có bản chất là protein. 33 Tác động của DNT là gây hoại tử biểu bì, gây độc với tế bào phổi bò, gây chết và ỉa chảy nhầy, teo lách ở chuột. Theo Rimeler 1989 và Brogden (1980 - 1982): Trong chất lọc canh trùng già có một loại độc tố có bản chất lipo-polysaccarit. Khi tiêm chất này vào tĩnh mạch của trâu bò sẽ gây phản ứng sốt, ỉa chảy ra máu, có thể tử vong. 1.1.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida Cấu trúc kháng nguyên của P. multocida ch−a biết đầy đủ, vi khuẩn có một kháng nguyên thân (O) là gluxit - lipit – protein, độc đối với chuột nhắt và gây đ−ợc miễn dịch. Những chủng độc có một kháng nguyên phụ là kháng nguyên vỏ, có bản chất là polysaccarit, đây là một bán kháng nguyên, che lớp kháng nguyên thân O. Hiện nay, trong khi nghiên cứu chế vacxin phòng bệnh tụ huyết trùng cho gia súc, gia cầm, một số tác giả đã tiến hành tách kháng nguyên thân (O) và kháng nguyên vỏ (K) ra, sau đó mới trộn lẫn với nhau. Mục đích là bộc lộ kháng nguyên thân (O) để tạo miễn dịch tốt hơn. Pasteurella multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (t−ơng đồng kháng nguyên) tức là có khả năng miễn dịch chéo giữa các chủng, tính chất này nhiều hay ít phụ thuộc vào từng chủng. Cách thử kháng nguyên giao hỗ là lấy vi khuẩn chế vacxin đem tiêm cho thỏ rồi lấy vi khuẩn c−ờng độc của các chủng Pasteurella khác thử thách. Nếu có kháng nguyên giao hỗ thì thỏ không chết. Kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Cho đến nay, ng−ời ta đã xác định đ−ợc vi khuẩn P. multocida có 2 loại kháng nguyên: Kháng nguyên vỏ (kháng nguyên K) và kháng nguyên thân (kháng nguyên O). Những nghiên cứu về cấu trúc, số l−ợng và sự phân bố kháng nguyên P. multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vacxin đặc hiệu. Một vacxin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên t−ơng ứng với các Serotype của các chủng phân lập đ−ợc trong từng vùng hay khu vực. 1.1.4.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng nguyên O khỏi bị thực bào tác động. Đồng thời, kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp xúc giữa 34 kháng nguyên O và kháng thể O. Do đó, muốn phát hiện kháng nguyên O phải phá huỷ kháng nguyên K. Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không có ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) và xù xì (R). Kháng nguyên K nhận đ−ợc bằng cách cho canh khuẩn non vào n−ớc cất đun cách thuỷ trong 1giờ, ly tâm lấy phần dịch trong, bỏ cặn. Kháng nguyên có hai thành phần α và β, chúng đ−ợc cấu tạo từ protein và polysaccarit, ngoài ra còn có một số ít lipopolysaccarit. Kháng nguyên của vi khuẩn P. multocida có khả năng gắn với thụ thể của tế bào hồng cầu. Do vậy, ng−ời ta dùng kháng nguyên này để định type kháng nguyên giáp mô bằng phản ứng ng−ng kết hồng cầu gián tiếp (IHA - Indirect - Haemagglutination - Assay) Các protein trên màng, gọi là OMPs (Outer Membrance Proteins) đ−ợc coi là chất chỉ thị để đánh giá khả năng kích thích sinh miễn dịch trong rất nhiều phản ứng miễn dịch. Theo Muniady và Murata, 1993 tính sinh miễn dịch của một số lipopolysaccarit chính là do thành phần OMPs của màng tế bào vi khuẩn . 1.1.4.2. Kháng nguyên thân (O) - Somatic antigen. Kháng nguyên O có hai nhóm: Đặc hiệu và không đặc hiệu. Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O. Chỉ có Serotype B hầu nh− đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O. Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại: + Phân loại của Namioka và Murata , 1961 kháng nguyên O có 12 yếu tố. + Phân loại của Heddleston, 1972 kháng nguyên O có 16 yếu tố, ký hiệu từ 1- 16. Kháng nguyên O là kháng nguyên thành tế bào vi khuẩn Pasteurella multucida. Theo Namioka và Murata: Khi khuẩn lạc của P. multocida chuyển từ dạng S sang dạng R thì vi khuẩn vẫn giữ đ−ợc kháng nguyên O. Kháng nguyên O là một phức hợp protein - lipopolysaccarit. Kháng nguyên O của vi khuẩn P. multocida chiết xuất đ−ợc nhờ axít trichloacetic, dung dịch phenol và máy siêu âm. 35 Trong phản ứng huyết thanh học, kháng nguyên O có đặc tính loài rất cao, tuy vậy nó cũng tạo thành phản ứng chéo với các huyết thanh kháng các vi khuẩn gram âm khác nh− P. pseudotuberculosis, P. haemolytica. 1.1.5. Các type huyết thanh học của P. multocida. Carter và Chengapa, 1981 cho rằng: Cần kết hợp hai phản ứng là phản ứng ng−ng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch để xác định serotype của vi khuẩn Pasteurella multocida. Theo qui định của FAO, để xác định serotype của Pasteurella multocida cần kết hợp cả hai hệ thống định type kháng nguyên: Định type kháng nguyên vỏ và định type kháng nguyên thân. Hiện nay, hai hệ thống định type của Pasteurella multocida đ−ợc dùng phổ biến là: Namioka (1961) - Carter (1955) Carter (1955) - Heddleston (1972) Theo Rober, 1947 Pasteurella multocida gồm 4 type là I, II, III, IV. Hudson, 1954 tìm thêm type V. Carter, 1952 dựa vào phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phản ứng IHA xác định đ−ợc bốn type: A, B, C, D. Năm 1961, Carter phát hiện thấy chủng vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở Châu Phi. Chủng này không hoàn toàn giống với các chủng trên nh−ng có quan hệ kháng nguyên với type B và ông đặt tên là type E. Năm 1963, Carter phát hiện thấy type C không tồn tại và quyết định xóa bỏ danh pháp của type này. Năm 1987, Rimler và Rhoader bằng phản ứng IHA đã bổ sung thêm một type mới gây bệnh THT cho gà tây, gọi là type F. Nhiều thực nghiệm đã chứng minh đ−ợc mối quan hệ giữa hai hệ thống định type của Robert và Carter nh− sau: 36 Carter Quan hệ Robert Type A T−ơng đ−ơng với Type II, III, IV Type B T−ơng đ−ơng với Type I Type D T−ơng đ−ơng với Type IV Type E, F Không t−ơng ứng với type nào Tóm tắt hệ thống phân loại Pasteurella multocida Tác giả Phản ứng Phân loại Phân loại theo kháng nguyên K Carter (1955) IHA Type A, B, C, D Carter (1961) IHA Type E Carter (1963) IHA Bỏ type C .Rimler và Rhoader (1987) IHA Type F Phân loại theo kháng nguyên K Namioka và Murata (1961) NK tế bào đã xử lý HCl Type 1 - 12 Namioka và Bruner (1963) AGPT Type 1 - 16 Namioka và Murata (1964) AGPT Type 1 - 16 Heddleston (1996) AGPT Type 1 - 16 Chú thích: NK Phản ứng ng−ng kết AGPT (Agar - Gel - Precipitation - Test) Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch IHA (Indirect - Haemagglutination - Assay) Phản ứng ng−ng kết gián tiếp hồng cầu. Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR và RT - PCR) đã và đang là ph−ơng pháp chẩn đoán nhanh nhất và chính xác nhất, đ−ợc ứng dụng trên thế giới và ở Việt Nam, để định type vi khuẩn P. multocida. Đinh Duy Kháng và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định type vi khuẩn P. multocida phân lập ở miền Trung Việt Nam. 37 1.2. Bệnh và vấn đề an toàn, vệ sinh thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp gây ra ở gia cầm. Vi khuẩn Salmonella đã đ−ợc nghiên cứu từ hàng trăm năm nay. Tuy nhiên trong khoảng 10 năm trở lại đây, chúng rất đ−ợc sự quan tâm của các nhà nghiên cứu bởi sự gia tăng của các bệnh ngộ độc thực phẩm ở ng−ời do Salmonella gây ra. Các đàn gia súc, gia cầm bị bệnh là nguồn tàng trữ vi khuẩn Salmonella. Trong đó gà, trứng gà và các sản phẩm của chúng là nguồn tàng trữ mầm bệnh lớn nhất lây sang ng−ời, sau đó là bò (Williams; J.E., 1984; Konnai et all, 2001; Martin G., Ingrid Hanel et al.,1996). Sự ngăn chặn và đẩy lùi bệnh do Salmonella ở gia cầm và gia súc có hiệu quả là điều kiện quyết định bảo vệ con ng−ời tránh khỏi các mầm bệnh này. Mục tiêu theo đuổi đến cùng của các nhà khoa học là xây dựng các đàn gà sạch mầm bệnh. Tuy nhiên, do những đặc điểm dịch tễ phức tạp của bệnh nh−: khả năng tồn tại và l−u hành của Salmonella ở những loài động vật không có biểu hiện lâm sàng và ở nhiều các vật chủ đã làm cho quá trình phòng chống bệnh trở nên khó khăn. Cho đến nay, lĩnh vực vacxin đã lôi cuốn nhiều sự chú ý của các công trình nghiên cứu vì phòng bệnh bằng vaxin đ−ợc coi là biện pháp hiệu quả để khống chế bệnh (Selbitz và CS.,1995). ở nhiều n−ớc trên thế giới, một số loại vacxin đã lần l−ợt ra đời nh−: vacxin vô hoạt toàn khuẩn, vacxin sản xuất từ các chủng đột biến gen, vacxin tái tổ hợp. Tuy vậy ở n−ớc ta cho tới nay vấn đề Salmonella nói chung và đặc biệt là 2 loài vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu ở ng−ời là S. typhi murium và S. enteritidis còn ít đ−ợc đi sâu nghiên cứu. 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella. Quá trình nghiên cứu phát hiện Salmonella và các tác nhân gây bệnh lao, dịch tả, nhiệt thán,… đã đ−ợc bắt đầu từ hơn 100 năm. Năm 1880 Eberth lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn d−ới kính hiển vi. Sau đó 4 năm , năm 1884 Gaffky đã nuôi cấy thành công vi khuẩn loài vi khuẩn Salmonella typhi , lúc đầu đ−ợc gọi với các tên nh− Bacillus typhosus, Bacterium typhi và E berthella typhi hay E berthella typhosa. Chỉ tên giống Salmonella đ−ợc Lignieres sử dụng đặt tên cho trực khuẩn gây bệnh dịch tả, Hog-cholera bacillus vào năm 1900. Tên của loài vi khuẩn quen thuộc đối với chúng ta 38 ngày nay là S. choleraesuis lần đầu tiên trong báo cáo năm của phòng chăn nuôi công nghiệp Mỹ năm 1885 với sự nhìn nhận nhầm lẫn cho là tác nhân gây bệnh dịch tả lợn (Barnes, Sorensen, 1975). Salmon lúc bấy giờ là Tr−ởng phòng nghiên cứu, vì vậy mà tên ông đ−ợc lấy để đặt tên cho vi khuẩn mới này. Song Smith, ng−ời cộng sự của Salmon mới thật sự là ng−ời phát hiện ra vi khuẩn Salmonella. Một vài năm sau đó lần l−ợt các loài khác đ−ợc phát hiện và những loài vi khuẩn đó vẫn có ý nghĩa trong y học cho tới ngày nay. Vào tháng 5 năm 1988 đã xảy ra một vụ dịch ở Frankenhausen vùng Thueringen (Đức) làm 58 ng−ời bị bệnh do ăn phải thịt bò mắc bệnh đem giết mổ đột xuất. Trong vụ dịch này đã làm một thanh niên trẻ qua đời. Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm lúc đó đ−ợc đặt tên là Bacillus enteritidis (nay gọi là Salmonella enteritidis). Vi khuẩn do Gaertner ng−ời vùng Jena phát hiện. Căn cứ vào nơi tìm thấy vi khuẩn cũng nh− ng−ời phát hiện ra vi khuẩn mà trong một khoảng thời gian dài nh− S. enteritidis đ−ợc gọi tên là trực khuẩn Gaertner hoặc là Typhus Gaertner Jena. Năm 1891 Jensen đã phân lập đ−ợc S. dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy. Cùng năm đó S. typhi murium đ−ợc phát hiện thấy ở vùng Greiswald và Breslau (Selbitz H.J và CS, 1995). Hai năm sau đó, 1893, chính tại Breslau đã xảy ra một vụ ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm đem giết mổ đột xuất, tuy đã đ−ợc bác sỹ thú y phê chuẩn “không dùng làm thực phẩm “. Song thịt đã bị đánh cắp và tiêu dùng, kết quả là bệnh đã nổ ra ở ng−ời. Kaensche là ng−ời nghiên cứu và tìm ra vi khuẩn đặt tên là trực khuẩn Kaensche. Với một vài dẫn chứng trên đây cho thấy ý nghĩa của giống vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho cả gia súc, gia cầm và ng−ời. Bởi vậy mà bên cạnh việc định h−ớng về phòng chống bệnh do Salmonella gây ra có ý nghĩa về mặt kinh tế, vì dịch bệnh này đôi khi xảy ra khá nghiêm trọng, còn phải quan tâm đến ý nghĩa phòng chống bệnh truyền lây từ gia súc sang ng−ời do Salmonella, một vấn đề cũng không kém phần quan trọng. Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc đầu đ−ợc đặt một tên chung là bệnh phó th−ơng hàn “para-typhus”. Cho đến năm 1914, có tổng cộng 12 loài vi khuẩn đ−ợc mô tả và xếp vào giống Salmonella. Trong những năm 1930 số l−ợng loài đã tăng nhanh chóng. Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc kháng nguyên của Salmonella bắt đầu một thời kỳ khoa học mới về giống vi khuẩn này. Sau đó Kauffmann tiếp tục thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về Salmonella. Vào năm 39 1934, 2 nhà khoa học đã thiết lập bảng cấu trúc kháng nguyên đầu tiên đặt tên là: “Kauffmann – White – Schema”. Từ đó đến nay, bảng cấu trúc kháng nguyên Salmonella spp luôn luôn đ−ợc bổ sung. Năm 1993 đã có 2375 serrotype Salmonella đ−ợc định danh (Selbitz H-J và CS, 1995). Đến năm 1997, con số serotype Salmonella đã lên đến 3000 (Plonait, Birkhartd, 1997). Năm 1998, lại có thêm 6 serotype nữa đ−ợc bổ sung. Nh− vậy giống Salmonella vẫn luôn thu hút đ−ợc sự chú ý của các nhà chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật học. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong n−ớc. Khi phân lập Salmonella từ phân, tổ chức máu tim... của động vật và ng−ời, ở ng−ời đã tìm thấy các serotyp gây bệnh: Salmonella typhi , Salmonella paratyphi A, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis. - ở trâu bò: Salmonella dublin, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis. - ở cừu: Salmonella abortus ovis, Salmonella montevideo, Salmonella dublin, Salmonella choleraesuis, Salmonella anatum. - ở ngựa: Salmonella abortus equi, Salmonella choleraesuis. - ở gia cầm và chim: Salmonella pullorum, Salmonella gallinarum, Salmonella arizona, Salmonella enteritidis, Salmonella choleraesuis và nhiều serotyp khác. Theo Đinh Nam Lân và cs (2002) khảo sát tình hình nhiễm Salmonella ở vịt cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella là 12,7%, cao nhất là vịt con d−ới 1 tháng tuổi (18%), vịt đẻ (12,5%), vịt mới nở (10%) và vịt tr−ởng thành (7,5%). Thí nghiệm đ−ợc tiến hành ở một số vùng thuộc tỉnh cần thơ. Viện Pasteur Sài Gòn, trong những năm 1951 - 1952 - 1953 đã phân lập đ−ợc 6 giống Salmonella ở ng−ời (4 chủng từ máu, 2 chủng tách từ n−ớc tiểu) và 35 giống Salmonella từ 360 lợn mổ ở lò sát sinh, trong đó có 23 giống thuộc Salmonella choleraesuis. Năm 1954 và 1955 tại Campuchia đã phân lập đ−ợc 4 serotyp Salmonella choleraesuis ở ng−ời (trích theo Nguyễn Quang Tuyên, 1996 ). Tác giả Lê Văn Tạo và cs (1992) đã tiến hành phân lập, xác định serotyp của vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn đã cho biết: 50% thuộc Salmonella choleraesuis; 40 12,5% Salmonella enteritidis; 6,25% Salmonella choleraesuis và còn lại thuộc các serotyp khác. Trần Xuân Hạnh (1995) đã phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella trên lợn ở thành phố Hồ Chí Minh cho biết kết quả: Salmonella typhi ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình th−ờng 6 - 16 tuần tuổi là 4,2%; Salmonella paratyphi ở lợn 6 - 16 tuần tuổi là 2,8%. Đặc biệt Salmonella choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn bệnh và 2,8% ở lợn bình th−ờng. Tạ Thị Vịnh và cs (1996) b−ớc đầu thăm dò, xác định E. coli và Salmonella trên lợn bình th−ờng và lợn tiêu chảy. Các tác giả đã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợn bệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây) và Gia Lâm (Hà Nội) cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella cao ở lợn khoẻ trong giai đoạn 22 - 60 ngày tuổi. Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn lợn bình th−ờng và tăng dần theo lứa tuổi, dao động từ 70 - 90%. Theo Hồ Văn Nam và cs (1997) [số l−ợng và tỷ lệ xuất hiện Salmonella trong phân lợn ỉa chảy là 51,3 triệu vi khuẩn trong 1 gam phân và chiếm tỷ lệ 90,4% ở lứa tuổi từ 1 - 21 ngày. Lợn trên 60 ngày tuổi là 43,6 triệu/1 gam phân, tỷ lệ 98,6%. Lợn nái có l−ợng vi khuẩn thấp nhất: 28,5 triệu vi khuẩn /1 gam phân, chiếm 88,8%. Tác giả đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm cấp tính và mãn tính trên lợn và thu đ−ợc kết quả về bệnh tích đại thể ở 2 dạng bệnh cấp tính và mãn tính. Đào Trọng Đạt và cs (1995) cũng nh− một số tác giả khác cho biết: Salmonella là trực khuẩn hình gậy hai đầu tròn có kích th−ớc 0,4-0,6 x 1-3 à, không hình thành giáp mô, nha bào, di động và gram âm. Trực khuẩn mọc trên thạch có kích th−ớc nhỏ (1 - 2 à) hơn là mọc trên môi tr−ờng lỏng. Theo tác giả thì hầu hết vi khuẩn phó th−ơng hàn của các loài đều giống nhau về hình thái và tính chất nuôi cấy, do đó không thể phân biệt và định typ trên môi tr−ờng nuôi cấy thông th−ờng. Các tác giả khác cũng có những mô tả t−ơng tự. Theo James và John (1981) Salmonella có kích th−ớc 2 - 4 x 0,5 à. Theo Nguyễn Vĩnh Ph−ớc (1964) Salmonella là vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, không hình thành giáp mô, nha bào phần lớn vi khuẩn thuộc nhóm Salmonella có thể di động (trên thân có 7 - 12 lông) trừ Salmonella pullorum và Salmonella gallinarum ở gà. 41 1.2.3. Đặc điểm của Salmonella. Salmonella là vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, có dạng hình que dài 2 - 5àm rộng 0,7 - 1,5 àm. Chúng không sinh vỏ, không sinh bào tử nhỏ và có thể phát triển d−ới điều kiện kị khí hoặc hiếu khí. Salmonella phát triển tốt nhất ở 370C trong môi tr−ờng có pH trung tính, tạo ra các khuẩn lạc nhỏ màu trắng mịn, đ−ờng kính 2 mm. Đa số Salmonella đều có khả năng di động nhờ hệ thống roi (trừ S. gallinarum) và có giải nhiệt độ phát triển rộng, thấp nhất là 5,50C (S. heidelberg) và cao nhất là 450C. Trong quá trình trao đổi chất, Salmonella sử dụng xitrat và glucoza làm nguồn dinh d−ỡng và th−ờng không lên men lactoza (trừ chủng S. gallinarum). Nhiều nghiên cứu về quá trình tiến hoá của Salmonella đã chỉ ra rằng chúng có cùng tổ tiên với E. coli, và trong quá trình tiến hoá Salmonella đã thu nhận đ−ợc rất nhiều gen từ các phage hoặc từ các vi khuẩn khác thông qua sự tiếp hợp. Hầu hết các gen này đều là những gen quy định cấu trúc của kháng nguyên và có vai trò trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn. Vi khuẩn Salmonella sống kí sinh ở ng−ời và động vật, ngoài ra còn đ−ợc tìm thấy trong đất, n−ớc, rác thải và phân động vật. Chúng có thể tồn tại hàng tuần trong n−ớc và hàng năm trong môi tr−ờng đất. Salmonella đ−ợc phân loại dựa vào sự khác biệt về cấu trúc kháng nguyên bề mặt (O antigens) hay dựa vào kháng nguyên roi (H antigen). Chúng bao gồm hơn 50 typ kháng nguyên bề mặt và đ−ợc phân biệt bằng các con số nh−: O: 4, 5, 12 hay chỉ có một số nh− O: 35. Ngoài ra, theo hệ thống phân loại của Kaufmann-White thì Salmonella đ−ợc chia làm hai loài là S. enterica và S. bongori. Hầu hết Salmonella lây nhiễm trên ng−ời và động vật là thành viên của S. enterica. Salmonella gồm hơn 2400 typ huyết thanh khác nhau mà trong đó S. enterica chiếm khoảng 99%. S. enterica lại đ−ợc chia thành nhiều đơn vị d−ới loài nh−ng hai dạng chủ yếu gây bệnh ở ng−ời và động vật là S. typhi murium và S. enteritidis. 1.2.4. Tình trạng ngộ độc thức ăn do Salmonella. Hiện t−ợng ngộ độc ở ng−ời xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau, tuy nhiên, nguyên nhân do thức ăn nhiễm khuẩn chiếm khoảng 70%. Theo thống kê năm 2001, hàng năm trên thế giới có khoảng 16 triệu tr−ờng hợp nhiễm bệnh và có tới 600.000 ca tử vong do ăn phải các loại thực phẩm nh− thịt, trứng, sữa, … từ gia cầm đã bị nhiễm 42 Salmonella. Salmonella đ−ợc biết đến nh− một nguyên nhân gây bệnh cách đây hơn một trăm năm, đ−ợc đặt tên theo nhà khoa học đã tìm ra chúng, đó là Daniel E. Salmon. Vi khuẩn này đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi và ngành công nghiệp thực phẩm. Hơn thế nữa, chúng còn có khả năng gây ra nhiều bệnh hiểm nghèo cho con ng−ời, ảnh h−ởng không nhỏ đến sức khỏe cộng đồng. Một ví dụ điển hình về n−ớc Mỹ sẽ cho chúng ta thấy mức độ trầm trọng của vấn đề. Hàng năm có khoảng 30% dân số n−ớc Mỹ bị ngộ độc thức ăn. Tính riêng cho năm 1987, nhiễm độc do Salmonella gây ra đã làm n−ớc này hao tổn trên 1 tỉ đô la. Khi S. typhi murium xâm nhập vào cơ thể ng−ời, chúng có thể chui qua niêm mạc ruột. Tại ruột, một phần các tế bào Salmonella bị dung giải và giải phóng nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở bụng, làm tổn th−ơng mảng Payer gây xuất huyết đ−ờng tiêu hoá. Ngoài ra chúng có thể kích thích trung khu thần kinh thực vật gây trạng thái sốt và có thể gây trụy tim mạch. Các triệu chứng lâm sàng của nhiễm độc do loại vi khuẩn này gây nên bao gồm sốt cao, tiêu chảy, đau bụng, cơ thể mất n−ớc trầm trọng. Thông th−ờng bệnh này có thể tự khỏi trong vòng một tuần. ở mức độ nặng hơn thì có thể gây sốt th−ơng hàn hay còn có những biểu hiện khác nh− nhiễm trùng máu cấp tính, sẩy thai, viêm khớp và bệnh đ−ờng hô hấp. 1.2.5. Biện pháp phòng bệnh. Dựa trên một số kết quả nghiên cứu có thể kết luận một cách ngắn gọn rằng các vấn đề quan trọng đối với thực tiễn cần chú ý là phải tìm biện pháp phòng bệnh hữu hiệu. Vacxin phòng bệnh là biện pháp đ−ợc đánh giá cao và đ−ợc đi sâu nghiên cứu từ lâu. Đặc biệt là xu thế sử dụng vacxin sống trong phòng bệnh do Salmonella gây ra ở gia súc và gia cầm, tuy mới đ−ợc đ−a vào sử dụng từ hơn 10 năm trở lại đây nh−ng nó đã thể hiện đ−ợc −u thế so với vacxin vô hoạt. (Selbitz H-J, 2001). Lợn đ−ợc uống vacxin nh−ợc độc chủng S. choleraesuis đột biến có hiệu giá kháng thể thấp trong huyết thanh và trong ruột non, nh−ng phản ứng trên da của kháng nguyên thử bằng ph−ơng pháp tiêm nội bì lại rõ rệt. Đối với vacxin aroA-Minusmutant chế tạo từ chủng S.typhi murium đột biến thì sau khi tiêm phòng cho lợn các tác giả Lumsden và Wilkie (1993, trích theo Selbitz H-J và cs, 1995) đã chứng minh đ−ợc kháng thể dịch thể kháng LPS và kháng nguyên toàn 43 khuẩn bằng phản ứng ng−ng kết hồng cầu. Các tác giả cũng cho biết có sự gia tăng của tế bào lympho đặc hiệu kháng kháng nguyên O trong máu ngoại vi. ở bê, sau khi cho uống vacxin sống S. dublin cho thấy không những kháng thể các lớp IgG và IgM đ−ợc tạo thành mà sau 48 giờ còn xuất hiện phản ứng quá mẫn chậm DTH mà còn thể hiện trong việc tạo kháng thể kháng LPS (Daroden et al, 1992). Bò sữa sau khi đ−ợc tiêm vác xin vô hoạt bằng cả 2 đ−ờng tiêm d−ới da và nội tuyến sữa đều chứng minh đ−ợc kháng thể trong sữa đầu. Song ph−ơng pháp tiêm trực tiếp vào tuyến sữa các vác xin phòng bệnh do S. dublin và S. typhi murium gây ra không những kích thích tạo IgG1, IgG2, IgA mà còn tạo IgM (Staak et al, 1990- trích theo Selbitz, H-J và cs, 1995). Miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào cũng thấy ở gia cầm. Tuy nhiên cho đến nay vẫn ch−a thể đ−a ra đ−ợc những chỉ tiêu cụ thể chắc chắn nào cho hiệu lực phòng bệnh trong điều kiện phòng thí nghiệm. Gà con sau khi uống vác xin chủng S. typhi murium đột biến, công c−ờng độc, sau đó xác định kháng thể bằng ELISA cho thấy sự có mặt của IgM, IgG và IgA (Hassan và Curtis, 1990) đã xác định đ−ợc khả năng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Tuy vacxin sống có những −u thế nh− vậy, nh−ng cho tới nay nhiều n−ớc trên thế giới vẫn ch−a có đủ điều kiện để giám sát giống vacxin đột biến gen. Lời khuyên cho những n−ớc này là sử dụng vacxin chết, tuy hiệu quả thấp hơn so với vacxin sống, nh−ng có độ an toàn cao và nếu kết hợp với các biện pháp vệ sinh khử trùng chuồng trại th−ờng xuyên thì cũng có thể đạt hiệu quả phòng bệnh đến 95% (Selbitz, và cs, 1995). 1.2.6. vắc-xin chống Salmonella cho gà 1.2.6.1. Một số loại vaccine chống Salmonella Hiện nay trên thị tr−ờng có nhiều loại vaccine, chủ yếu là vaccine sống và vaccine giảm độc lực có khả năng bảo vệ gà chống lại Salmonella. Vaccine sống là vaccine đ−ợc tạo ra từ các chủng Salmonella độc đ−ợc làm yếu bằng nhiệt, cơ học, hoá học v.v... có khả năng bảo vệ gà rất tốt nh−ng loại vaccine này lại gây rủi ro lớn cho gà vì chủng sống có khả năng phục hồi đ−ợc khả năng sinh tr−ởng và dễ dàng quay trở lại gây bệnh. Vì vậy loại vaccine này đ−ợc sử dụng một cách dè dặt và hạn chế hơn. 44 Loại vaccine đ−ợc −a chuộng hiện nay là vaccine giảm độc lực đ−ợc tạo ra dựa trên việc xoá bỏ hoặc bất hoạt gen gây độc. Mặc dù loại vaccine này có hiệu lực cao nh−ng vẫn biểu hiện một số bất lợi đặc biệt là khi bỏ một gen gây độc, trên thực tế vẫn còn độc ví dụ chủng cya crp vẫn có khả năng gây bệnh cho lợn thử nghiệm. Loại vaccine aroA đ−ợc xem là an toàn cho lợn thực nghiệm nh−ng vẫn có khả năng gây chết cho chuột. Bên cạnh đó, ng−ời ta đã chứng minh rằng gà đ−ợc phòng bệnh vẫn đẻ trứng mang mầm bệnh Salmonella. Năm 2000, McSorley và cộng sự đã miễn dịch cho gà bằng FliC và thấy rằng FliC có khả năng bảo vệ gà cao hơn rất nhiều vaccine chết và có độ an toàn cao. Ông đề nghị có thể sử dụng FliC tái tổ hợp để làm vaccine cho gà. 1.2.6.2. Sơ l−ợc về kháng nguyên roi của S. typhi murium Salmonella có hai loại kháng nguyên chủ yếu là kháng nguyên bề mặt O và kháng nguyên roi H. ở một số typ huyết thanh khác nh− S. Typhi , S. Dublin và S. Hirschfeldii có thêm kháng nguyên Vi. Kháng nguyên này nằm trong lớp lypo-poly- saccharide ở trên màng và có liên quan đến tính độc đối với một số tế bào vật chủ nhất định. Hình 1: Cơ chế hoạt động luân phiên của hai gen fljB và fliC của vi khuẩn S. typhi murium (bmb.psu.edu/courses/micro401). S. typhi murium có 2 kháng nguyên roi H:i và H:1,2 đ−ợc mã hoá từ 2 gen fliC, fljB. Sự biểu hiện của 2 gen này không đồng thời và đ−ợc kiểm soát bởi nhóm gen sớm và nhóm gen trung gian và nhóm gen muộn. Cả ba lớp gen đó bao gồm khoảng 50 gen thuộc 17 operon khác nhau. Tín hiệu khởi đầu cho mỗi chu kì hoạt động của hệ thống này (Hình 1) chính là cAMP-CAP. Sản phẩm dịch mã của 2 gen là sợi protein flagellin- một đơn vị duy nhất cấu thành nên trục của roi vi khuẩn. Ng−ời ta theo dõi thấy xác suất xảy ra sự thay thế giữa hai gen đó trong một thế hệ tế bào là 10-5 đến 10-3. Tuy nhiên FliC vẫn tồn tại phổ biến hơn FljB. 45 Cơ chế hoạt động luân phiên của hai gen fliC, fljB có sự tham gia tích cực của gen fljA. Trên chiều dài của ADN nhiễm sắc thể, operon fljB-fljA nằm phía tr−ớc operon fliC và có hai promotơ riêng biệt nhau. Operon fljB-fljA do một promotor điều khiển có khả năng hoạt động nh− một invertasome với hai trình tự lặp lại đảo ng−ợc nằm ở hai đầu. Mỗi trình tự có chiều dài 13 cặp. Khi promotor của operon fljB-fljA nằm xuôi chiều, hai gen fljB và fljA sẽ đ−ợc phiên mã. Protein fljB sẽ tham gia vào cấu trúc trục roi. Protein fljA có vai trò là một chất ức chế gen fliC. Trong tr−ờng hợp này roi của vi khuẩn S. typhi murium sẽ có kiểu hình H1, hay flagellin sẽ nằm ở pha H:1,2. Ng−ợc lại, khi promotor của operon fljB-fljA đảo chiều theo cơ chế thắt thòng lọng (looping), gen fljB và fljA sẽ ngừng hoạt động. Nhờ vậy, gen fliC không còn bị ức chế chế bởi protein fljA. Nó sẽ đ−ợc phiên mã và cho ra flagellin H2 hay còn gọi là pha H:i. 1.2.6.3. Kháng nguyên roi của Salmonella typhi murium có khả năng bảo hộ cho gà chống Salmonella. Salmonella có hai kháng nguyên chủ yếu là kháng nguyên O và kháng nguyên H. Kháng nguyên O có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch mạnh và hiệu quả do kháng nguyên này có bản chất là lipoprotein gồm 3 thành phần: polysacarit, lipit và protein. Tuy nhiên, đối với vắc-xin tái tổ hợp kháng nguyên H là một lựa chọn thích hợp dựa trên những cơ sở sau: Thứ nhất kháng nguyên H chỉ bao gồm một đơn vị cấu thành duy nhất là protein flagellin. Vì vậy, việc phân lập kháng nguyên này trở nên dễ dàng và nhanh chóng với kĩ thuật ADN tái tổ hợp, hứa hẹn một thế hệ vắc-xin có độ an toàn cao hơn gấp nhiều lần so với các loại vắc-xin cũ. Thêm vào đó, cơ chế di truyền cũng nh− điều hòa biểu hiện protein này ở Salmonella đã đ−ợc nghiên cứu rất kĩ l−ỡng. Kháng nguyên H chính là protein flagellin đơn nhất cấu tạo nên trục roi của vi khuẩn. Flagellin của Salmonella không chỉ tham gia thành phần cấu trúc mà theo nghiên cứu của Andrew và các đồng tác giả năm 2001 cho thấy nó còn đ−ợc tiết ra môi tr−ờng d−ới dạng protein đơn (protein hòa tan). Có thể nhờ đặc điểm này mà flagellin có vai trò sinh đáp ứng miễn dịch mạnh. Thứ hai, vì protein roi tham gia chức năng cấu trúc nên chúng không có tính độc. Điều này tạo thuận lợi cho việc chế tạo vắc xin. 46 1.2.6.4. Khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin Khi thế giới chuyển sang giai đoạn sản xuất vắc-xin bằng kháng nguyên thành phần, một số công trình đã tập trung nghiên cứu khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein flagellin của tế bào vi khuẩn để áp dụng cho loại vắc-xin này. Một số nghiên cứu đã cho thấy kháng nguyên roi và kháng nguyên lông của S. enteritidis có khả năng bảo vệ gà chống lại Salmonella. Tuy nhiên, khả năng bảo vệ gà ch−a đ−ợc tốt lắm vì kháng nguyên lông chỉ bảo vệ đ−ợc gà khi gà đã lớn trong khi đó kháng nguyên lông chỉ bảo vệ đ−ợc gà còn rất nhỏ. Gần đây có công trình của Stephen J. cùng các đồng tác giả. Họ dùng ph−ơng pháp xác định khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của một kháng nguyên thông qua việc xác định hàm l−ợng IFN-γ sinh ra trong suốt quá trình lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh. IFN-γ là một loại cytokin do tế bào CD4+ tiết ra để hoạt hóa các đại thực bào và tăng c−ờng khả năng bảo vệ cơ thể tr−ớc sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đối với chuột đã đ−ợc tiêm protein fliC l−ợng IFN-γ sản sinh ra bởi dòng tế bào CD4+ đặc hiệu cho protein fliC (fliC-specific CD4+ cell) gia tăng trong suốt quá trình lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh (S. typhi murium). Đặc biệt là sau bốn tuần bị nhiễm khuẩn, l−ợng IFN-γ trung bình thu đ−ợc từ lô chuột phòng chủng bằng fliC đạt xấp xỉ với l−ợng IFN-γ trung bình thu đ−ợc từ lô chuột phòng chủng bằng vi khuẩn S. typhimurium bị giết bằng nhiệt. Từ đó có thể đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của protein FliC là rất cao. Hình 4 minh họa cho kết quả nghiên cứu này. Điều quan trọng hơn là nghiên cứu này còn chứng minh protein fliC có khả năng bảo vệ trên 70% số chuột thí nghiệm khỏi lây nhiễm vi khuẩn S. typhimurium. Cụ thể là sau một tuần, toàn bộ các cá thể của lô chuột không đ−ợc tiêm phòng đều bị mắc bệnh và chết. Còn ở lô chuột đ−ợc tiêm phòng bằng fliC, có trên 70% số chuột vẫn còn sống sót trong suốt tuần thứ hai và sau đó. Nghiên cứu này cho thấy triển vọng phát triển vắc-xin kháng nguyên thành phần dựa trên protein roi của vi khuẩn S. typhimurium là rất lớn. Trong khi đó, việc sử dụng kĩ thuật ADN tái tổ hợp để phân lập kháng nguyên thành phần là điều kì diệu nhất mà công nghệ sinh học có thể mang lại cho một thế hệ vắc-xin mới. 47 1.3. Bệnh Lở mồm Long móng 1.3.1. Bệnh Lở mồm Long móng và tình hình nghiên cứu về bệnh trong, ngoài n−ớc. 1.3.1.1. Bệnh Lở mồm Long móng, tình hình bệnh trên thế giới và ở Việt Nam. Bệnh Lở mồm Long móng (LMLM) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm của loài động vật móng guốc chẽ đôi nh−: trâu, bò, lợn, dê, cừu… Bệnh do một vi rút ARN thuộc họ Picornaviridae, một loại vi rút h−ớng th−ợng bì, gây ra. Bệnh có những đặc điểm đặc tr−ng là sốt và hình thành mụn n−ớc ở miệng, chân và vú của gia súc cảm thụ (Nguyễn Vĩnh Ph−ớc, 1978; Nguyễn Tiến Dũng, 2000; Donaldson. 2000). Mặc dù bệnh xuất hiện nh− là một bệnh thể nhẹ, tỷ lệ chết ở gia súc tr−ởng thành không cao nh−ng hậu quả là sự thiệt hại về kinh tế rất trầm trọng. Theo số liệu của Tổ chức Dịch tễ Thế giới (OIE - Office Internationale des Epizooties), bệnh LMLM gây sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, làm giảm sản l−ợng thịt 25%, giảm sản l−ợng sữa 50% và ở cừu năng suất lông giảm 25%. Vi rút LMLM có thể gây ra các ổ dịch rộng lớn, tỷ lệ mắc bệnh cao gần nh− 100% và bệnh có thể lây lan trong phạm vi một hoặc nhiều n−ớc (Donaldson, 2000; Văn Đăng Kỳ, 2000). Do tính chất nguy hiểm nên bệnh LMLM đ−ợc OIE xếp đầu bảng A (bảng gồm 15 bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm ở động vật) và bắt buộc các n−ớc thành viên phải khai báo, các n−ớc đang có bệnh LMLM không đ−ợc xuất khẩu thịt và các sản phẩm khác của động vật móng guốc chẵn chẽ đôi sang các n−ớc khác. Trong khi đó, việc giao l−u buôn bán động vật và các sản phẩm động vật ở các địa ph−ơng trong n−ớc cũng nh− n−ớc ngoài đòi hỏi cấp thiết phải phòng chống bệnh LMLM, nhằm ngăn chặn lây lan giữa các vùng trong n−ớc và các n−ớc khác bằng các biện pháp phù hợp với điều kiện kinh tế xã hội của mình (Sổ tay Dịch bệnh Động vật, 2000). Theo tổng hợp của Phòng Thí nghiệm WRL, trong năm 2003 có 87 n−ớc và lãnh thổ có xuất hiện bệnh LMLM và Việt Nam nằm trong khu vực dịch LMLM th−ờng xuyên l−u hành (Hình 2). Việc khống chế tiến tới tiêu diệt bệnh LMLM ở Việt nam trở nên đặc biệt khó khăn do chúng ta có biên giới đ−ờng bộ chung với Trung Quốc, Lào và Campuchia. Việc phòng chống bệnh LMLM vì thế không phải là vấn đề của một 48 quốc gia mà trở thành một vấn đề khu vực, thậm chí vấn đề toàn cầu đặc