Báo cáo Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm axit amin và enzym từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và hải sản ở quy mô bán công nghiệp

bé khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖn n«ng nghiÖp vµ c«ng nghÖ sau thu ho¹ch b¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi KHCN cÊp nhµ n−íc nghiªn cøu ¸p dông c«ng nghÖ vi sinh hiÖn ®¹i ®Ó s¶n xuÊt chÕ phÈm axit amin vµ enzym tõ nguån thø phÈm n«ng nghiÖp vµ h¶i s¶n ë quy m« b¸n c«ng nghiÖp m∙ sè: kc.04.20 chñ nhiÖm ®Ò tµi: pgs.ts nguyÔn thïy ch©u 5980 23/8/2006 hµ néi - 2006 1 Danh s¸ch nh÷ng ng−êi tham gia thùc hiÖn ®Ò tµi Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1 1/ §Ò tµi nh¸nh: “Sö dông kü thuËt hiÖn ®¹i trong chän t¹o c¸c chñng gièng vi sinh vËt” PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh TS. §inh Duy Kh¸ng5 NCS. §ç thÞ Ngäc HuyÒn1 Th.S. Vò Kim Thoa1 KS. NguyÔn Ngäc HuyÒn1 CN. NguyÔn ThÞ H−¬ng Trµ1 Th.S. Bïi ThÞ H−¬ng1 2/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L-lysin” PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh Th.S. Vò Kim Thoa1 KS. NguyÔn Ngäc HuyÒn1 KS. TrÇn V¨n Tu©n 3/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L-methionin” Th.S. Bïi ThÞ H−¬ng1, chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh CN. Vò ThÞ H−¬ng1 CN. NguyÔn TuÊn1 KS. §ç Minh Trung1 4/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym phytaza” NCS. §ç ThÞ Ngäc HuyÒn1, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh CN. NguyÔn ThÞ Hång Hµ1 KS. Lª Thiªn Minh1 CN. §ç TÊt Thñy1 5/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym pectinaza” KS. Tr−¬ng Thanh B×nh1 , Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, ®ång chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh CN. Lª Thanh H−¬ng1 2 CN. NguyÔn Ngäc Linh1 CN. §ç ThÞ Thu HiÒn1 6/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym mananaza” PGS. TS. §Æng ThÞ Thu2, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh NCS. §ç Biªn C−¬ng2 KS. Phïng ThÞ Thñy2 7/§Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt thÞt qu¶ cµ phª lªn men lµm thøc ¨n gia sóc” CN. NguyÔn ThÞ H−¬ng Trµ1, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh PGS. TS. NguyÔn Thïy Ch©u1, ®ång chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh KS. Ng« TÊt Trung1 CN. §ç TÊt Thñy1 KS. L©m Tó Minh1 8/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic c¸c phÕ phô phÈm cña t«m b»ng c¸c chñng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i” GS. Lª V¨n LiÔn3, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh KS. Ph¹m Ngäc UyÓn3 KS. Ph¹m ThÞ Thµnh3 KS. Ph¹m ThÞ Thoa3 9/ §Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men b· døa b»ng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n cho bß s÷a” ThS. NguyÔn Giang Phóc3, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh CN. Bïi ThÞ Thu HuyÒn3 CN. NguyÔn Thµnh Long3 KS. NguyÔn V¨n Dòng3 KS. V−¬ng TuÊn Thôc3 KS. NguyÔn V¨n Lý3 CN. NguyÔn §×nh Phóc3 CN. NguyÔn V¨n Ph−¬ng3 3 10/§Ò tµi nh¸nh: “Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men men lactic c¸c phÕ phô phÈm cña c¸ b»ng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i” KS. L−¬ng V¨n ChÝnh4, Chñ nhiÖm ®Ò tµi nh¸nh CN. TrÇn Kh¸nh V©n4 KS. Lª V¨n Huyªn4 1: ViÖn C¬ ®iÖn N«ng nghiÖp vµ c«ng nghÖ sau thu ho¹ch 2: ViÖn C«ng nghÖ sinh häc- C«ng nghÖ Thùc phÈm, Trưêng §¹i häc B¸ch khoa Hµ néi 3: ViÖn Ch¨n nu«i Quèc Gia 4: ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp 5: ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc- Trung t©m Khoa häc Tù nhiªn vµ C«ng nghÖ Quèc gia 4 PhÇn I: Më ®Çu Tõ nhiÒu n¨m nay viÖc tËn dông c¸c phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp vµ sö dông chóng mét c¸ch cã hiÖu qu¶ ®a ®−îc c¸c nhµ khoa häc vµ c«ng nghÖ trªn thÕ giíi hÕt søc quan t©m ®i s©u nghiªn cøu vµ ®· ®¹t ®−îc rÊt nhiÒu thµnh tùu trong vÊn ®Ò nµy. C«ng nghÖ sinh häc ®ãng mét vai trß hªt søc quan träng trong viÖc tËn dông c¸c phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp ®Ó t¹o ra c¸c s¶n phÈm cã gi¸ trÞ kinh tÕ vµ gi¸ trÞ dinh d−ìng cao nh»m sö dông chóng mét c¸ch cã hiÖu qu¶, tr¸nh t×nh tr¹ng l·ng phÝ vµ g©y « nhiÔm m«i tr−êng. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhê chÝnh s¸ch ®æi míi cña §¶ng vµ nhµ n−íc, ngµnh n«ng nghiÖp n−íc ta ®· cã nh÷ng b−íc tiÕn bé râ rÖt. S¶n l−îng l−¬ng thùc còng nh− c¸c n«ng s¶n kh¸c ®· t¨ng mét c¸ch ®¸ng kÓ. S¶n l−îng lóa g¹o ®¹t gÇn 34 triÖu tÊn, ®−êng ®¹t gÇn 1 triÖu tÊn, dõa 500.000 tÊn, s¶n l−îng døa lµ 50 triÖu tÊn. Cµ phª ®¹t 500.000 tÊn. S¶n l−îng c¸c n«ng s¶n nµy t¨ng kÐo theo s¶n l−îng c¸c phÕ phô phÈm cña chóng còng t¨ng theo. Cô thÓ: s¶n l−îng c¸m g¹o trong n¨m 1999- 2000 lµ 1.7 triÖu tÊn, l−îng c¸m m× lµ 150 ngh×n tÊn, thÞt qu¶ cµ phª kho¶ng 1,5 triÖu tÊn, rØ ®−êng 450 ngh×n tÊn, b· døa 10 triÖu tÊn, b· døa sau Ðp 200000 tÊn, phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n kho¶ng 500 ngh×n tÊn. Do ch−a cã biÖn ph¸p tËn dông mét c¸ch khoa häc thÞt qu¶ cµ phª, b· døa ®· g©y « nhiÔm m«i tr−êng vµ trë thµnh nçi nhøc nhèi cña ng−êi d©n vïng chÕ biÕn c¸c n«ng s¶n nµy. ViÖc nghiªn cøu vµ triÓn khai c¸c c«ng nghÖ sinh häc ®Ó tËn dông c¸c phÕ phô phÈm nµy nh»m t¹o ra c¸c s¶n phÈm dinh d−ìng cao vµ cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao phôc vô chÕ biÕn thùc phÈm vµ ch¨n nu«i lµ mét vÊn ®Ò cÊp thiÕt cña ngµnh n«ng nghiÖp còng nh− cña c¸c c¸n bé lµm c«ng t¸c nghiªn cøu vÒ c«ng nghÖ sinh häc ViÖt Nam. Thùc tÕ cho thÊy rØ ®−êng ë n−íc ta hiÖn nay chñ yÕu míi chØ ®−îc sö dông ®Ó s¶n xuÊt cån. Trong khi ®ã, cã rÊt nhiÒu s¶n phÈm cã thÓ s¶n xuÊt ®−îc tõ rØ ®−êng ®Ó ®¸p øng nhu cÇu cuéc sèng cña nh©n d©n ta song vÉn ch−a triÓn khai ®−îc. §Æc biÖt c¸c axit amin nh− Lysin, Methionine lµ nh÷ng chÊt cã thÓ s¶n xuÊt tõ rØ ®−êng nh−ng ta vÉn ph¶i nhËp ngo¹i víi sè l−îng vµi tr¨m tÊn/n¨m trÞ gi¸ nhiÒu chôc tØ ®ång. V× vËy, viÖc nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt c¸c axit amin lysine, methionine lµ rÊt cÇn thiÕt ®Ó ®a d¹ng ho¸ c¸c s¶n phÈm sau ®−êng vµ ph¸t triÓn ch¨n nu«i, d−îc phÈm. HiÖn nay trong thùc tÕ c¸m g¹o, c¸m m× chñ yÕu ®−îc lµm thøc ¨n gia sóc vµ hÇu nh− ch−a cã s¶n phÈm sinh häc nµo cã gi¸ trÞ ®−îc t¹o ra tõ nguån c¸m g¹o vµ c¸m m×. 5 Ngµnh cµ phª ViÖt Nam cã tèc ®é ph¸t triÓn nhanh v−ît bËc so víi 20 n¨m tr−íc ®©y, diÖn tÝch cµ phª ®· t¨ng 25 lÇn, s¶n l−îng t¨ng 100 lÇn, cã nghÜa lµ n¨ng suÊt ®· t¨ng 4 lÇn, tØ lÖ vá thÞt qu¶ chiÕm kho¶ng 45% träng l−îng qu¶, trong khi ®ã c«ng nghÖ sau thu ho¹ch kh«ng ®¸p øng kÞp, g©y nªn nh÷ng tæn thÊt nÆng nÒ vµ g©y « nhiÔm m«i tr−êng. Víi nguån phÕ liÖu thuû h¶i s¶n rÊt lín vµ ®a d¹ng, bao gåm c¸ kÐm chÊt l−îng, ®Çu vµ vá t«m, c¸c phô t¹ng, ®Çu, x−¬ng, v©y cña c¸ t¹o ra tõ c¸c xÝ nghiÖp ®¸nh b¾t vµ chÕ biÕn xuÊt khÈu thuû s¶n. Nguån nguyªn liÖu nµy rÊt dÔ dµng vµ nhanh chãng bÞ thèi háng do t¸c ®éng cña khu hÖ vi sinh vËt ®a d¹ng trong ®iÒu kiÖn khÝ hËu n−íc ta. §©y thùc sù lµ mét vÊn ®Ò kh«ng nh÷ng lµm mÊt ®i mét nguån protein lín mµ con g©y « nhiÔm m«i tr−êng nghiªm träng. Ở n−íc ta l−îng b· c¬m dõa sau Ðp hµng n¨m lªn tíi vµi tr¨m ngh×n tÊn vµ hiÖn nay chØ ®−îc sö dông lµm ph©n bãn, v× vËy hiÖu qu¶ sö dông ch−a cao. §Æng ThÞ Thu vµ c¸c céng t¸c viªn ë trung t©m c«ng nghÖ sinh häc- §¹i häc B¸ch Khoa Hµ Néi ®· b−íc ®Çu tËp trung nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzim mananaza ®Ó n©ng cao gi¸ trÞ sö dông b· c¬m dõa sau Ðp. §©y lµ mét lo¹i enzim cã ý nghÜa kinh tÕ cao vµ ch−a ®−îc tËp trung nghiªn cøu s©u ë ViÖt Nam. V× vËy cÇn ®Çu t− cho vÊn ®Ò nµy cÇn ®Çu t− cho vÊn ®Ò nµy nh»m t×m ®−îc c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzim mananaza ë ViÖt Nam trong thêi gian tíi. §Ò tµi “Nghiªn cøu ¸p dông c«ng nghÖ vi sinh hiÖn ®¹i ®Ó s¶n xuÊt chÕ phÈm giµu axit amin vµ enzym tõ nguån thø phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n ë qui m« b¸n c«ng nghiÖp” m· sè KC-04-20 thuéc ch−¬ng tr×nh nghiªn cøu khoa häc vµ ph¸t triÓn c«ng nghÖ sinh häc. Môc tiªu chung cña ®Ò tµi lµ: TriÓn khai c«ng nghÖ míi cña c«ng nghÖ sinh häc trong tËn dông phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n nh»m s¶n xuÊt c¸c s¶n phÈm cã gi¸ trÞ kinh tÕ phôc vô ph¸t triÓn n«ng nghiÖp Môc tiªu cô thÓ lµ: ¸p dông ®−îc c¸c kü thuËt vi sinh kinh ®iÓn vµ kü thuËt sinh häc ph©n tö hiÖn ®¹i trong c«ng t¸c chän t¹o c¸c chñng gièng vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh cao cho c«ng nghÖ tËn dông phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp nh− rØ ®−êng, c¸m g¹o, c¸m m×, b· døa, thÞt qu¶ cµ phª, b· dõa sau Ðp vµ phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n nh− c¸ kÐm chÊt l−îng, ®Çu t«m 6 X©y dùng qui tr×nh c«ng nghÖ thÝch hîp ®Ó s¶n xuÊt c¸c s¶n phÈm cã gi¸ trÞ cao nh− axit amin L- lysin, L-methionine, c¸c enzym phytaza, pectinaza, mannanaza, c¸c thøc ¨n lªn men tõ c¸c phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp vµ phÕ phÈm thuû h¶i s¶n lµm thøc ¨n ch¨n nu«i X©y dùng ®−îc m« h×nh c«ng nghÖ thiÕt bÞ thÝch hîp ®Ó s¶n xuÊt c¸c s¶n phÈm nh− axit amin L-lysin, L-methionine, c¸c enzym phytaza, pectinaza, mannanaza, c¸c thøc ¨n lªn men tõ phô phÕ phÈm n«ng nghiÖp vµ thuû h¶i s¶n lµm thøc ¨n ch¨n nu«i §Ò tµi ®−îc thùc hiÖn trong 30 th¸ng tõ th¸ng 9 n¨m 2002 ®Õn th¸ng 3 n¨m 2005 víi tæng sè kinh phÝ lµ 2.700 triÖu ®ång tõ ng©n s¸ch SNKH cña Nhµ n−íc. D−íi ®©y lµ mét sè th«ng tin chung vÒ ®Ò tµi: Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Hä tªn : NguyÔn Thïy Ch©u Häc hµm, häc vÞ : PGS. TS Chøc danh khoa häc: NCVC §iÖn tho¹i CQ: 04.9342487 E.Mail: ntchau@netnam.com §Þa chØ c¬ quan: ViÖn C¬ ®iÖn C«ng nghiÖp vµ C«ng nghÖ sau thu ho¹ch Hµ Néi C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn c¬ ®iÖn n«ng nghiÖp vµ C«ng nghÖ sau thu ho¹ch Hµ Néi §Þa chØ: Sè 4 Ng« quyÒn, Hµ Néi 7 C¬ quan chÝnh phèi hîp thùc hiÖn TT Tªn tæ chøc §Þa chØ Ho¹t ®éng/®ãng gãp cho ®Ò tµi 1 ViÖn C«ng nghÖ Sau thu ho¹ch 4 Ng« QuyÒn, Hµ néi. Chñ tr× ®Ò tµi, Sö dông c¸c kü thuËt hiÖn ®¹i trong chän t¹o c¸c chñng gièng vi sinh vËt, nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt c¸c axit amin L-lysin, L-methionin, c¸c enzym phytaza, pectinaza, c«ng nghÖ s¶n xuÊt thøc ¨n ch¨n nu«i tõ thÞt qu¶ cµ phª 2 ViÖn Ch¨n nu«i Thôy Ph−¬ng- Tõ Liªm. Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men b· døa b»ng vi khuÈn Lactobacillus plantarium vµ Streptococcus lactis lµm thøc ¨n cho bß s÷a. 3 ViÖn Ch¨n nu«i Thôy Ph−¬ng- Tõ Liªm. - Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic c¸c phÕ phô phÈm cña t«m b»ng c¸c chñng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i 4 ViÖn Di truyÒn N«ng NghiÖp, ViÖn Ch¨n nu«i Cæ NhuÕ- Hµ Néi - Nghiªn cøu c«ng nghÖ lªn men lactic c¸c phÕ phô phÈm cña c¸ b»ng c¸c chñng vi khuÈn Lactobacillus lµm thøc ¨n ch¨n nu«i. 5 ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc vµ C«ng nghÖ thùc phÈm, Tr−êng §¹i häc B¸ch khoa- Hµ néi. §¹i Cæ ViÖt - Hµ Néi - Nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt enzym mannanaza ®Ó s¶n xuÊt mano- oligosacharit tõ b· dõa sau Ðp. 1. Néi dung ®Ò tµi: 1. TuyÓn chän bé chñng gièng vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh sinh häc tõ c¸c nguån thiªn nhiªn phôc vô cho ®Ò tµi 2. Sö dông c¸c kü thuËt hiÖn ®¹i trong chän t¹o c¸c chñng gièng vi sinh vËt bao gåm: + Sö dông kü thuËt ®ét biÕn chän t¹o c¸c chñng Corynebacterrium glutamicum sinh tæng hîp L- lysin vµ L-methionine cao 8 + Sö dông kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Ò biÓu hiÖn gen m· hãa phytaza ®Ò kh¸ng nhiÖt trong nÊm men Pichia pastoris + T¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen m· hãa bacteriocin tõ chñng tù nhiªn cã tÝnh ®Ò kh¸ng víi vi sinh vËt g©y bÖnh E. coli, Salmonella... 3. Nghiªn cøu vµ hoµn thiÖn c«ng nghÖ lªn men axit amin L- lysine, L- methionine, vµ c¸c enzym phytaza, pectinaza, mannanaza ë qui m« phßng thÝ nghiÖm vµ qui m« b¸n c«ng nghiÖp 150l/mÎ vµ 1500 l/mÎ 4. Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ lªn men thÞt qu¶ cµ phª, b· døa, phÕ phô phÈm thñy h¶i s¶n b»ng c¸c vi khuÈn lactic 5. Thö nghiÖm vµ ®¸nh gi¸ c¸c chÕ phÈm s¶n xuÊt ®−îc trªn ®µn gia sóc gia cÇm 2. Danh môc s¶n phÈm KHCN cña ®Ò tµi (hîp ®ång gi÷a Chñ nhiÖm ch−¬ng tr×nh KC.04 vµ c¬ quan chñ tr× ®Ò tµi) TT Tªn s¶n phÈm Sè l−îng ChØ tiªu Kinh tÕ - kü thuËt Ghi chó 1 ChÕ phÈm sinh häc 1.1 ChÕ phÈm axit amin L- lysin bæ sung vµo thøc ¨n gia sóc cho lîn, gµ. 10 kg ChÕ phÈm L- lysin ®¹t tõ 30-35g/l 1.2 ChÕ phÈm L-methionin bæ sung vµo thøc ¨n gia sóc cho lîn, gµ. 10 kg ChÕ phÈm L-methionin ®¹t tõ 30-35g/l 1.3 ChÕ phÈm enzym pectinaza cho lîn, gµ vµ chÕ biÕn mËt ong 10 kg ChÕ phÈm enzym pectinaza ®¹t kho¶ng 10®v/ml 1.4 ChÕ phÈm enzym mannanaza s¶n xuÊt mano- oligosacharit lµm thøc ¨n cho lîn, gµ 5 kg ChÕ phÈm emzym mannanaza ®¹t tõ 300 - 400 ®v/ml 1.5 ChÕ phÈm enzym phytaza bæ sung vµo thøc n¨ gia sóc cho lîn, gµ. 10kg ChÕ phÈm enzym phytaza ®¹t tõ 80 -85 ®v/g 1.6 ChÕ phÈm thÞt qu¶ cµ phª lªn men lµm thøc ¨n cho bß 10 tÊn 3 % axit lactic vµ 105 vi khuÈn lactic/g chÊt kh« 9 1.7 ChÕ phÈm b· døa lªn men lµm thøc ¨n cho bß 10 tÊn 3 % axit lactic vµ 105 vi khuÈn lactic/g chÊt kh« 1.8 S¶n phÈm lªn men tõ c¸c phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n lµm thøc ¨n ch¨n nu«i cho gia cÇm, lîn con. 1 tÊn 3 % axit lactic vµ 105 vi khuÈn lactic/g chÊt kh«. ChÕ phÈm cã kh¶ n¨ng t¨ng träng cña gia sóc tõ 15% -20%. 2 Chñng gièng vi sinh vËt 2.1 C¸c chñng Corynebacterium glutamicum Corynebacterium acetoglutamicum Candida tropicalis, Brevibacterium falvum tù nhiªn vµ ®ét biÕn sinh L-lysin, L- methionin cao. 4 chñng Chñng cã ho¹t tÝnh L- lysin ®¹t tõ 30g/l - 35g/l Chñng cã ho¹t tÝnh L- methionin ®¹t tõ 30g/l- 35g/l 2.2 C¸c chñng nÊm mèc Aspergillus niger sinh pectinaza 2-3 chñng Chñng cã ho¹t tÝnh pectinaza ®¹t kho¶ng 10®v/ml 2.3 C¸c chñng sinh enzym mannanase 2-3 chñng Chñng cã ho¹t tÝnh mannanaza ®¹t tõ 30- 40 ®v/ ml 2.4 Chñng Aspergillus niger tù nhiªn vµ chñng t¸i tæ h¬p cho ho¹t tÝnh phytaza cao tõ 3-5 lÇn so víi chñng tù nhiªn. 2-3 chñng Chñng cã ho¹t tÝnh phytaza ®¹t 80-85®v/l 2.5 C¸c chñng vi khuÈn Lactobacillus plantarum sinh axit lactic vµ bacteriocin. 2-3 chñng L−îng bacteriocin ®¹t 50ppm 3 Qui tr×nh c«ng nghÖ: 3.1 Quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L-lysin trªn m«i tr−êng rØ ®−êng b»ng c«ng nghÖ lªn men ch×m sôc khÝ. 1 quy tr×nh Qui m« 1500l/mÎ 3.2 Qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt axit amin L- methionin trªn m«i tr−êng rØ ®−êng b»ng c«ng nghÖ lªn men ch×m sôc khÝ. 1 qui tr×nh Qui m« 1500l/mÎ 3.3 Qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt 3 qui Qui m« 1500l/mÎ 10 enzym pectinaza, mananaza, phytaza trªn m«i tr−êng thÞt qu¶ cµ phª, b· dõa sau Ðp, c¸m g¹o b»ng c«ng nghÖ lªn men ch×m sôc khÝ. tr×nh 3.4 Qui tr×nh c«ng nghÖ lªn men thÞt qu¶ cµ phª, b· døa, phÕ phô phÈm thuû h¶i s¶n b»ng c¸c vi khuÈn lactic. 4 qui tr×nh Qui m« 1 tÊn thÞt qu¶ cµ phª/mÎ 3. KÕt qu¶ ho¹t ®éng cña ®Ò tµi 3.1. Tæng quan t×nh h×nh nghiªn cøu trong vµ ngoµi n−íc 3.1.1. Tæng quan vÒ L-lysin L-lysine b¶n chÊt lµ mét axit amin kh«ng thay thÕ, nghÜa lµ c¬ thÓ ng−êi vµ ®éng vËt kh«ng tù tæng hîp ®−îc axit amin nµy mµ ph¶i trùc tiÕp thu nhËn tõ nguån bæ sung bªn ngoµi. Ho¹t tÝnh sinh häc chØ biÓu hiÖn ë d¹ng ®ång ph©n L- lysine míi cã gi¸ trÞ dinh d−ìng víi ng−êi vµ ®éng vËt. L- lysine ®−îc øng dông réng r·i trong nhiÒu lÜnh vùc nh−: Sö dông bæ sung vµo thøc ¨n gia sóc lµm t¨ng chÊt l−îng vµ s¶n l−îng thÞt cña ®éng vËt nu«i. Trong c«ng nghiÖp d−îc phÈm L-lysine ®−îc sö dông nh− mét chÊt dinh d−ìng, kÝch thÝch sù ¨n ngon miÖng, sö dông nh− mét chÊt cã nguån gèc protein bæ sung trong qu¸ tr×nh c¾t ®øt c¨n bÖnh "stress” vµ nã còng cã chøc n¨ng chèng nhiÔm trïng m¸u. Trong c«ng nghiÖp thùc phÈm lµ chÊt bæ sung lµm giÇu thùc phÈm, n©ng cao chÊt l−îng c¸c lo¹i h¹t nh− lóa m×, ng«, g¹o bëi nÕu c¸c s¶n phÈm nµy thiÕu hôt L- lysine th× gi¸ trÞ dinh d−ìng rÊt thÊp. V× vËy trong thùc phÈm cña con ng−êi nh− thùc phÈm d¹ng chiªn, thùc phÈm láng, b¸nh m× th−êng ®−îc bæ sung d¹ng muèi L- lysine. Trong c«ng nghiÖp, L- lysine ®−îc s¶n sinh trong m«i tr−êng dinh d−ìng lªn men bëi c¸c chñng vi khuÈn Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, B. lactofermentatum hoÆc còng cã thÓ thu nhËn tõ dÞch thuû ph©n protein ®éng, thùc vËt. Trªn thÕ giíi viÖc s¶n xuÊt axit amin ë quy m« c«ng nghiÖp ®· ®−îc b¾t ®Çu tõ n¨m 1908. NhËt B¶n ®· cã lÞch sö trªn 40 n¨m s¶n xuÊt vµ ¸p dông axit amin ë quy m« c«ng nghiÖp víi s¶n l−îng 90.000 tÊn/n¨m (chñ yÕu hai h·ng c«ng nghiÖp vi sinh khæng lå lµ "Kiowa Hakko" vµ "Ajinamoto"). ë Ph¸p (h·ng "Eurolysine") cã s¶n l−îng L-lysine ®¹t kho¶ng 20 000 tÊn/n¨m. N¨m 1983 s¶n l−îng L-lysine trªn toµn thÕ giíi lµ 70 000 tÊn/n¨m nh−ng ®Õn n¨m 2000 ®· t¨ng lªn 600 000 tÊn/n¨m. NhiÒu nhµ m¸y s¶n xuÊt L- 11 lysine cßn ®−îc x©y dùng ë Mü, T©y Ban Nha, c¸c n−íc céng hoµ thuéc Liªn X« (cò) vµ Nam T− (cò)...ViÖc gia t¨ng nhanh chãng s¶n l−îng L-lysine trªn thÕ giíi ®ång nghÜa víi nhu cÇu rÊt lín vÒ s¶n phÈm nµy. HiÖn nay ë ViÖt Nam nhu cÇu sö dông lysin cho thùc phÈm con ng−êi vµ thøc ¨n ch¨n nu«i gia t¨ng nhanh chãng. Hµng n¨m chóng ta ph¶i nhËp khÈu 100% L-lysin víi sè l−îng lín. Trong nh÷ng n¨m qua (1980-1985) TS. Hå S−ëng, ViÖn C«ng nghiÖp Thùc phÈm, ®· s¶n xuÊt lysin tõ chñng tù nhiªn cã tªn lµ VTP 22( kh«ng cã tªn chi vµ tªn loµi) ë qui m« 5000l/mÎ, chñng nµy cho s¶n l−îng lysin 30-35g/l. ChÕ phÈm lysin ë d¹ng th« lµ 80% vµ ë d¹ng sÖt lµ 15-20%. TS. Ng« TiÕn HiÓn còng ®· nghiªn cøu lªn men lysin theo ph−¬ng ph¸p bÒ mÆt. Tuy nhiªn theo nh− lý thuyÕt th× lªn men theo ph−¬ng ph¸p bÒ mÆt kh«ng cho s¶n l−îng lysin cao so víi ph−¬ng ph¸p lªn men ch×m sôc khÝ. TS. Ng« ThÞ M¹i vµ céng sù còng ®· nghiªn cøu vÒ lysin, chñng s¶n xuÊt lµ chñng Corynebacterium glutamicum tù nhiªn lÊy tõ nguån ATCC. Tuy nhiªn th¸ch thøc lín nhÊt víi chóng ta lµ cã rÊt Ýt nghiªn cøu hoµn chØnh vÒ L-lysine vµ ch−a cã c¬ së nµo triÓn khai s¶n xuÊt L- lysine quy m« c«ng nghiÖp chÊt l−îng cao, gi¸ thµnh h¹. Cho ®Õn nay ë nhiÒu n−íc kh¸c nhau hÇu nh− tÊt c¶ c¸c chñng cã ho¹t tÝnh cao vµ ®−îc øng dông ®Ó s¶n xuÊt axit amin ®Òu lµ c¸c chñng ®ét biÕn. §Æc biÖt lµ c¸c vi khuÈn Corynebacterium, Brevibacterium cã kh¶ n¨ng ph¸t triÓn tèt trong nh÷ng m«i tr−êng chøa nhiÒu cacbon vµ Ýt nit¬. ë ®©y sù ph¸ vì c©n b»ng gi÷a trao ®æi chÊt cacbon vµ sù ®ång ho¸ nit¬ lµ nguyªn nh©n dÉn ®Õn sù h×nh thµnh axit amin víi sè l−îng lín, v−ît qu¸ xa so víi nhu cÇu néi t¹i cña tÕ bµo vµ tÝch luü ë tÕ bµo hay tho¸t ra ngoµi m«i tr−êng. HiÖn t−îng nµy ®−îc gäi lµ siªu tæng hîp axit amin cña vi sinh vËt vµ th−êng lµ do t¸c ®éng cña con ng−êi b»ng ph−¬ng ph¸p ®ét biÕn g©y ra ®Ó thu ®−îc s¶n phÈm mong muèn. §Æc ®iÓm cña chñng vi khuÈn sinh L-lysine C¸c chñng vi sinh vËt sinh L-lysine ®−îc dïng trong s¶n xuÊt lµ c¸c thÓ ®ét biÕn thuéc c¸c gièng vi khuÈn C. glutamicum vµ Brevibacterium. NhiÒu chñng ®−îc tuyÓn chän qua b−íc lµm ®ét biÕn vµ thu ®−îc nh÷ng chñng míi cã ho¹t lùc cao h¬n nhiÒu so víi chñng nguyªn thuû. §Æc tÝnh cña nh÷ng chñng nµy lµ cÇn biotin víi l−îng cao h¬n nhiÒu so víi chñng nguyªn thuû sinh axit glutamic, chÞu ®−îc ë nång ®é ®−êng lín tíi 12 20% hoÆc cao h¬n vµ ®Æc biÖt lµ cÇn mét sè axit amin cho sinh tr−ëng, còng nh− cho sinh tæng hîp L-lysine. Kinoshita ®· thu ®−îc nh÷ng chñng sinh L-lysine theo thø tù sau: nh÷ng chñng cÇn homoserin (hoÆc hçn hîp threonine + L-methionine) > nh÷ng chñng cÇn threonine > nh÷ng chñng cÇn isoleucine > nh÷ng chñng cÇn leucine > nh÷ng chñng cÇn hçn hîp isoleucine + leucine. Trong c«ng nghiÖp th−êng dïng nh÷ng chñng thuéc c¸c gièng Micrococcus glutamicus, Brevibacterium vµ C. glutamicum cÇn homoserin. C¸c chñng nµy cã cïng mét con ®−êng tæng hîp L-lysine nh− ë E. coli nh−ng ph−¬ng thøc ®iÒu hoµ l¹i ®¬n gi¶n h¬n nhiÒu. Mét trong nh÷ng chñng nµy kh«ng cã enzym L-homoleucinedehydrogenaza. L-lysine chØ ®iÒu chØnh ng−îc enzym aspactokinaza mµ kh«ng øc chÕ ng−îc enzym dehydropicolinatsyntetaza. − Enzym aspactokinaza chÞu øc chÕ ng−îc cña L-lysine vµ threonine. − Enzym homoserindehydrogenaza chÞu sù øc chÕ ng−îc cña threonine Gluco Pyruvat Oxalaxetat Aspastat β – Aspastat – phosphat Aspastat – β – semialdehyt (2) (3) Homoserin Threonin isoleucin Methionin L-lysin (1) 13 S¬ ®å 1: S¶n xuÊt L-lysine nhê mét thÓ ®ét biÕn C. glutamicum trî d−ìng homoserin. Nh÷ng ®−êng chÊm chÊm biÓu thÞ sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng. ë chñng hoang d¹i L-lysine vµ threonine cïng g©y ra mét sù øc chÕ phèi hîp (E) ®èi víi aspactokinaza (1). Do khuyÕt homoserin dehydrogenaza (2) mµ kh«ng cã sù t¹o thµnh threonine. Dihydropicolinat – synthase (3) kh«ng mÉn c¶m dÞ lËp thÓ. HËu qu¶ lµ sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng (E) bÞ triÖt tiªu vµ cã sù tæng hîp thõa L-lysine. Cã ba ph−¬ng ph¸p ®−îc dïng ®Ó lo¹i sù ®iÒu chØnh ng−îc: • Sö dông chñng ®ét biÕn trî d−ìng cÇn homoserin. Chñng nµy cã thÓ mäc ®−îc khi trong m«i tr−êng cã threonine vµ L-methionine. Víi nång ®é axit amin nµy thÊp th× aspactokinaza sÏ kh«ng bÞ øc chÕ vµ L-lysine sÏ t¹o thµnh nhiÒu h¬n. • Sö dông c¸c chñng ®ét biÕn mÉn c¶m cao víi threonine. Enzym homoserindehydrogenaza cã thÓ bÞ øc chÕ bëi nång ®é threonine rÊt thÊp vµ aspactokinaza cã thÓ sÏ kh«ng bÞ øc chÕ. • Sö dông c¸c chñng ®ét biÕn cã kh¶ n¨ng kh¸ng mét chÊt t−¬ng ®ång cña enzym. Chóng cã enzym aspactokinaza kh«ng bÞ øc chÕ ng−îc bëi L-lysine vµ threonine. L-lysine lµ mét axit amin thuéc hä aspactat vµ ®−îc tæng hîp qua mét con ®−êng trao ®æi chÊt ph©n nh¸nh mµ qua ®ã homoserin, L-methionine, threonine vµ isoleucine còng ®−îc t¹o thµnh. C. glutamicum chØ cã mét aspactokinaza bÞ øc chÕ dÞ lËp thÓ bëi L- lysine vµ threonine Mét axit amin riªng lÎ trong kiÓu ®iÒu hoµ nµy kh«ng cã t¸c dông øc chÕ. B»ng c¸ch sö dông mét thÓ ®ét biÕn cÇn homoserin vµ khuyÕt homoserin dehydrogenaza mµ threonine kh«ng ®−îc t¹o thµnh. Nhê vËy sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng bi triÖt tiªu vµ con ®−êng sinh tæng hîp dÉn tíi viÖc s¶n xuÊt thõa L-lysine. Mét ®iÒu kiÖn n÷a ®Ó cã sù tæng hîp L-lysine kh«ng øc chÕ lµ sù cã mÆt cña gen dihydrodipicolinat-syntetaza kh«ng mÉn c¶m víi s¶n phÈm cuèi cïng. Do ®ã kh«ng xuÊt hiÖn sù øc chÕ bëi s¶n phÈm cuèi cïng ë nh¸nh L-lysine, nh− vÉn x¶y ra ë c¸c gièng kh¸c. ë C. glutamicum cã thÓ tæng hîp thõa L-lysine nhê ®ét biÕn theo kiÓu nµy. 14 MÆc dï phÇn lín axit amin ®−îc s¶n xuÊt tõ ho¸ häc, tæng hîp b»ng ho¸ häc th× quang häc kh«ng t¸c ®éng ®Õn d¹ng hçn hîp D vµ L. Nh−ng trong sinh ho¸ th× axit amin d¹ng L lµ quan träng nªn ngµy nay ng−êi ta th−êng s¶n xuÊt axit amin b»ng con ®−êng sinh tæng hîp. Tuy nhiªn trong s¶n xuÊt c«ng nghiÖp axit amin cÇn ph¸ vì c¬ chÕ ®iÒu chØnh ®Ó chñng cã kh¶ n¨ng siªu s¶n xuÊt (Chibata, K. Nakayama,K and Esaki 1986. Biotechnology of amino acid production, vol 24, progress in Industrial Microbiology. Kodansha). Mét vÝ dô vÒ s¶n xuÊt L-lysine ë chñng Brevibacterium flavum lµ ®iÒu chØnh sinh ho¸ cña enzym aspartokinase, l−îng L-lysine d− lµm øc chÕ ng−îc ho¹t ®éng cña enzym nµy vµ t¹o nªn d¹ng L-lysine t−¬ng ®ång S-aminoethylcysteine (AEC). Tuy nhiªn nÕu sö dông chñng B. flavum ®ét biÕn ®Ó s¶n xuÊt th× l−îng L-lysine d− kh«ng øc chÕ ng−îc ®Õn aspartokinase n÷a. §ét biÕn AEC bÒn sÏ dÔ dµng chän vÞ trÝ ®Ó s¶n xuÊt d¹ng ®ét biÕn cña asspartokinase ë ®iÓm biÕn ®æi kh«ng ph©n biÖt ®−îc AEC hay L-lysine vµ trong øc chÕ ng−îc L-lysine bÞ khö rÊt nhiÒu. Chñng ®ét biÕn B. flavum cã thÓ s¶n xuÊt h¬n 60g/l L- lysine. Mét nh©n tè quan träng kh¸c trong s¶n xuÊt axit amin lµ sù bµi tiÕt. Nãi chung sinh vËt kh«ng bµi tiÕt axit amin, do cã sù øc chÕ ng−îc hay k×m h·m trong ®ét biÕn bÒn th−êng kh«ng x¶y ra trong tÕ bµo. ViÖc s¶n xuÊt vµ bµi tiÕt qu¸ møc axit glutamic phô thuéc vµo tÝnh thÊm cña tÕ bµo. Vi khuÈn C. glutamicum dïng s¶n xuÊt c«ng nghiÖp axit glutamic cÇn vitamin biotin (lµ nh©n tè cÇn thiÕt trong sinh tæng hîp axit bÐo). ThiÕu hôt biotin dÉn tíi tæn th−¬ng mµng tÕ bµo vµ d−íi ®iÒu kiÖn néi bµo axit glutamic ®−îc bµi tiÕt. M«i tr−êng sö dông ®Ó s¶n xuÊt axit glutamic th−¬ng m¹i chøa ®Çy ®ñ biotin trong giai ®o¹n sinh tr−ëng, sau ®ã biotin bÞ thiÕu hôt vµ bµi tiÕt axit glutamic. S¬ ®å 2,3 : S¶n xuÊt c«ng nghiÖp L-lysine ë chñng B. flavum Asspartate Lysin øc chÕ ng−îc ATP ADP Aspartylphosphate Asspartate semialdehyde Methionine Threonin Dihydrodipicolinate Isoleucin Aspartokinase 15 (2) con ®−êng sinh ho¸ tõ aspartate biÕn ®æi thµnh L-lysine nh−ng L-lysine cã thÓ bÞ øc chÕ ng−îc ®Õn ho¹t ®éng cña enzym aspartokinase dÉn ®Õn dõng s¶n xuÊt L-lysine. (3) cÊu tróc L-lysine vµ d¹ng t−¬ng ®ång cña nã S-aminoethylcystein (AEC). AEC th−êng øc chÕ sinh tr−ëng, nh−ng chñng B. flavum ®ét biÕn AEC bÒn ë vÞ trÝ biÕn ®æi trªn aspartokinase cña chóng ®−îc sinh tr−ëng vµ s¶n xuÊt qu¸ møc L-lysine do øc chÕ ng−îc kh«ng kÐo dµi. HiÖn nay c¸c nhµ khoa häc ®· sö sông c¸c kü thuËt ®ét biÕn b»ng ho¸ chÊt (nitrosoguanidin, raffinate) vµ kü thuËt sinh häc ph©n tö (t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn c¸c gen dihydrodipicolinate synthase, aspartate kinase, dihydrodipicolinate reductase) nh»m t¨ng ho¹t lùc cña c¸c chñng s¶n xuÊt (Caroline,United State Patent, 1999), (Hungming, International patent, 2001). 3.1.2. Tæng quan vÒ L-methionin L-methionin lµ axit amin cã nhãm (-S-) vµ mét nhãm cacboxyl (-COOH) trong ph©n tö [20,21]. C«ng thøc cña L-methionin nh− sau: CH3- S- CH2 - CH2 -CH - COOH NH2 Còng nh− c¸c axit amin kh¸c, L-methionin cã thÓ chÞu sù chuyÓn amin ho¸ nh−ng cïng qu¸ tr×nh nµy nã tham gia trong nhiÒu ph¶n øng ho¸ sinh trong c¬ thÓ nhê sù cã mÆt nhãm metyl (-CH3) trong ph©n tö, nhãm nµy sÏ chuyÓn cho c¸c hîp chÊt kh¸c. S-Aminoethylcysteine HCNH2 NH2 CH2 CH2 CH2 CH2 COOH CH2 CH2 S CH2 NH2 HCNH2 COOH Lysine 16 L-methionin c«ng thøc ph©n tö lµ C5H11N1O2S, khèi l−îng Mol lµ 149,21. L- methionin kh«ng hoµ tan tèt trong n−íc. Con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin: ë E.coli vµ c¸c loµi hä hµng th× con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin ®−îc biÕt tõ sím. TÊt c¶ c¸c b−íc trao ®æi chÊt diÔn ra qua 13 gen met gäi lµ c¸c ®¬n vÞ ®iÒu hoµ met. ë E.coli gen metA m· ho¸ homoserine succinyl xóc t¸c cho viÖc chuyÓn ho¸ homoserin thµnh O-acetyl homoserine. Cßn ë C. glutamicum gen metA m· ho¸ homoserine acetyltransferase vµ nã sö dông acetyl coenzym A nh− chÊt cho acyl. Tuú thuéc vµo mçi vi sinh vËt, mµ qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ O_acetyl homoserine thµnh homocysteine cã thÓ x¶y ra theo hai nh¸nh. Brevibacterium flavum chØ sö dông nh¸nh H2S ®Ó sinh homocysteine. C¸c loµi kh¸c sö dông ®−îc c¶ hai con ®−êng. Nh−ng C. glutamicum th−êng sö dông con ®−êng Cystathionine. Aspartate Aspartate phophate Aspartate semialdehyde Homoserine O - Acetyl homoserine Cystathionine Homocysteine L-Methionine Aspartate kinase Aspartate sermialdehyde dehydrogenase Homoserine dehydrogenase Homoserin acetyltransferase (metA) Cystathionine gamma - synthase met C met E hoÆc met H Acetyl coA Cysteine H2S met 2 Oxaloacetate 17 S¬ ®å 4: C¸c enzym ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp L-methionin Vai trß sinh häc vµ øng dông L-methionine trong cuéc sèng L-methionin ¶nh h−ëng lín ®Õn sinh tr−ëng, sù lµm viÖc cña gan, ®iÒu hoµ ho¹t ®éng cña tuyÕn gi¸p, khö ®éc c¸c chÊt ®éc x©m nhËp vµo c¬ thÓ. L-methionin cßn cã thÓ thay thÕ ®−îc l−îng cystein cßn thiÕu trong thøc ¨n gia sóc. L-methionin ë møc ®é ®¸ng kÓ cã thÓ thay thÕ ®−îc vitamin cholin lµ vitamin ®ãng vai trß quan träng trong vç bÐo gia cÇm vµ lîn. C¸c axit amin b¾t buéc ph¶i cã trong thøc ¨n cña tÊt c¶ c¸c loµi ®éng vËt, trõ ®éng vËt nhai l¹i ®· tr−ëng thµnh. ë c¸c loµi nhai l¹i nµy, c¸c axit amin kh«ng thay thÕ ®−îc cung cÊp do c¸c vi sinh vËt tæng hîp ë d¹ cá. V× vËy, ®èi víi lîn vµ gia cÇm ng−êi ta ®· quan t©m nhiÒu ®Õn c©n ®èi c¸c axit amin, ®Æc biÖt lµ L-methionin vµ L-lysin trong thøc ¨n nu«i d−ìng. ViÖc c©n ®èi L-methionin trong khÈu phÇn thøc ¨n cã ý nghÜa quan träng v× L-methionin lµ mét axit amin chøa l−u huúnh lµ nguån nguyªn liÖu cÇn thiÕt cho sù sinh tr−ëng. ViÖc nhiÔm mì ë gan lµ mét trong nh÷ng triÖu chøng ®iÓn h×nh nhÊt cña viÖc thiÕu L-methionin trong khÈu phÇn thøc ¨n, bÖnh nµy cã thÓ ch÷a khái khi khÈu phÇn thøc ¨n chøa nhiÒu axit amin nµy. Kh«ng ®ñ L-methionin trong thøc ¨n th× qu¸ tr×nh ®Î trøng, s¾c tè l«ng ë lîn, gµ, vÞt sÏ bÞ c¶n trë. Khi thªm L-methionin th× qu¸ tr×nh nµy trë l¹i b×nh th−êng. NhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu còng ®· x¸c nhËn vai trß quyÕt ®Þnh cña L- methionin trong hµng lo¹t c¸c c«ng tr×nh sinh lý kh¸c. Nã tham gia trong sù trao ®æi selen vµ cholesterin, trong viÖc h×nh thµnh c¸c hocmon sinh tr−ëng vµ hocmon adrenotropic ë phÇn tr−íc cña n·o thuú. L-methionin còng rÊt cÇn thiÕt ®Ó duy tr× tr¹ng th¸i b×nh th−êng cña hÖ thÇn kinh. L-methionin chøa nhãm chøc l−u huúnh ®Æc biÖt quan träng ®èi víi sóc vËt non trong qu¸ tr×nh t¨ng tr−ëng. ChÝnh v× vËy mµ ë c¸c n−íc ph¸t triÓn ®· cã c¬ së s¶n xuÊt L-methionin ®Ó bæ sung chóng vµo hçn hîp thøc ¨n gia sóc. øng dông cña L- methionin vµo ch¨n nu«i ®· mang l¹i hiÖu qu¶ kinh tÕ rÊt cao. Hµng lo¹t c¸c thÝ nghiÖm ë Liªn X« (cò) vµ c¸c n−íc cã ngµnh ch¨n nu«i ph¸t triÓn kh¸c chøng minh r»ng khÈu phÇn thøc ¨n ch¨n nu«i ®−îc bæ sung L-methionin cã t¸c dông sinh häc rÊt m¹nh. ë mét sè n−íc, ®Ó nu«i bÐo gµ con vµ lîn ng−êi ta lµm giµu hÇu nh− tÊt c¶ c¸c hçn hîp thøc ¨n b»ng DL-methionin tæng hîp. Träng l−îng gµ con trong løa tuæi 70 ngµy khi kh«ng cho thªm L-methionin th× gµ m¸i chØ ®¹t 1206 gam, gµ trèng ®¹t 897 gam. Nh−ng khi cho thªm L- 18 methionin th× gµ m¸i ®¹t 1310 gam, gµ trång ®¹t 1072 gam. Chi phÝ thøc ¨n cho mét ®¬n vÞ t¨ng träng gi¶m 7% ®Õn 9%. Trong mét thÝ nghiÖm cña Enmison vµ Luis trªn cõu cÇn 2,1gam L-methionin trong mét ngµy ®èi víi cõu cã khèi l−îng 50kg. ë løa tuæi rÊt sím, gia cÇm cÇn mét l−îng lín c¸c axit amin chøa l−u huúnh ®Æc biÖt lµ L-methionin ®Ó mäc l«ng nhanh, v× l«ng vò cã chøa tíi 10% Cistin. §èi víi gia cÇm cßn nhá, cã l−îng l«ng phñ t−¬ng ®èi lín h¬n trªn mét ®¬n vÞ khèi l−îng, ®ßi hái nhiÒu L-methionin vµ Cistin h¬n, nã chiÕm 4,5% so víi protein, gµ m¸i lÊy thÞt to cÇn 4%, gµ t©y 3,3%. Lîi Ých cña viÖc sö dông L-methionin vµo ch¨n nu«i lµ cao nhÊt khi thøc ¨n nghÌo protein. S¶n xuÊt L-methionin b»ng chñng ®ét biÕn Chñng ®ét biÕn Brevibacterium flavum tæng hîp L-methionin, s¶n phÈm thu ®−îc ë d¹ng ®Æc tr−ng ®ång ®¼ng víi L-methionin: Gièng víi L-methionin, d¹ng ®ång ®¼ng nµy øc chÕ ho¹t ®éng cña homoserin dehydrogenase vµ do ®ã øc chÕ sinh tr−ëng cña vi khuÈn tù nhiªn. Tuy nhiªn, nÕu sö dông chñng Brevibacterium flavum ®ét biÕn ®Ó s¶n xuÊt th× l−îng L-methionin d− kh«ng øc chÕ ng−îc ®Õn homoserin dehydrogenase n÷a, chñng ®ét biÕn Brevibacterium flavum cã thÓ s¶n xuÊt tèt h¬n [20] . Theo h−íng nµy, ®Çu tiªn cÇn cã chñng bè mÑ ®ét biÕn ®Ó lµm t¨ng tÇn sè ®ét biÕn. Do s¶n phÈm ®ét biÕn b»ng vËt lý vµ ho¸ häc lµ kh«ng ®Æc hiÖu, cÇn ph¶i t¸ch nh÷ng ®ét biÕn kh«ng liªn quan, g©y bÊt lîi cho sinh vËt, lµm chËm sù ph¸t triÓn trong nu«i cÊy hay lµm gi¶m tÕ bµo. Nh÷ng chñng kh«ng mong muèn cã thÓ lo¹i bá bëi Etionin CH3 S CH2 CH2 HCNH2 COOH Methionin CH3 S CH2 CH2 HCNH2 COOH CH3 S CH2 CH2 HCNH2 COOH CH2 19 lai ng−îc chñng ®ét biÕn víi chñng hoang d¹i (lai ng−îc lµ lai tõng chñng víi chñng bè mÑ tù nhiªn cña nã). Sö dông kü thuËt sinh häc ph©n tö ®Ó t¨ng s¶n l−îng L-methionin MÆc dï viÖc t¹o ra c¸c chñng ®ét biÕn cã kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng víi chÊt ®ång ®¼ng cña L-methionin ®· kh¾c phôc ®−îc c¬ chÕ øc chÕ ng−îc, tõ ®ã gióp cho s¶n xuÊt L- methionin t¨ng cao, nh−ng qu¸ tr×nh øc chÕ ng−îc nµy vÉn Ýt nhiÒu cã xu h−íng x¶y ra, lµm h¹n chÕ sù t¨ng s¶n l−îng L-methionin. ViÖc t¸ch dßng, biÓu hiÖn gen metA b»ng c¸c promotor m¹nh ®· gióp kh¾c phôc ®−îc hiÖn t−îng nªu trªn vµ lµm t¨ng ®¸ng kÓ s¶n l−îng L-methionin.[97] §Ó t¨ng s¶n l−îng L-methionin, hiÖn nay c«ng nghÖ gen ®· ph©n tÝch ®−îc yÕu tè lµm t¨ng ho¹t ®éng s¶n sinh L-methionin cña chñng C.acetoglutamicum. Goyon vµ céng sù 1998 ®· tiÕn hµnh t¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù gen met2 lµ gen m· ho¸ homserin O- transacetylase, mét trong nh÷ng enzym cña con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin, ®©y lµ ph¸t hiÖn quan träng ®Ó biÕt ®−îc cÊu tróc gen. Trong thêi gian nµy ®· cã nhiÒu ph¸t hiÖn thó vÞ vÒ con ®−êng aspartat qua ®ã s¶n xuÊt L-methionin. Tuy nhiªn n¨m 1998, Park cïng céng sù ®· nghiªn cøu metA ë chñng C.acetoglutamicum, gen m· ho¸ cho homoserin acetyltransferase enzym ®Çu tiªn cña con ®−êng sinh tæng hîp L-methionin tõ homserin. ViÖc biÕn n¹p mét plasmid mang gen metA vµo chñng C.acetoglutamicum ®· lµm t¨ng ho¹t tÝnh enzym vµ kh¶ n¨ng biÓu hiÖn s¶n phÈm protein lªn 10 lÇn[26]. Khi s¶n l−îng axit amin thÊp, viÖc khuyÕch ®¹i c¸c gen sinh tæng hîp axit amin nhê ph−¬ng ph¸p ADN t¸i tæ hîp sÏ cho s¶n phÈm cã s¶n l−îng cao h¬n vµ hoµn thiÖn chñng gièng. Kü thuËt nµy ®−îc sö dông ®Ó thiÕt kÕ chñng siªu s¶n xuÊt. ë n−íc ta , vÊn ®Ò nghiªn cøu vÒ L-methionin lµ rÊt míi mÎ. V× vËy viÖc nghiªn cøu c«ng nghÖ s¶n xuÊt L-methionin ë ViÖt nam lµ rÊt cÇn thiÕt. 3.1.3. Tæng quan vÒ enzym phytaza Nh÷ng nghiªn cøu vÒ axit phytic: Axit phytic lµ mét axit h÷u c¬ trong ph©n tö cã chøa c¸c gèc phosphat. Nã cã mÆt chñ yÕu trong h¹t cña c¸c lo¹i ngò cèc, ®Ëu ®ç vµ h¹t cã dÇu. Ng−êi ta ®· x¸c ®Þnh ®−îc r»ng axit 20 phytic gi÷ vai trß nhÊt ®Þnh vµ cã nh÷ng t¸c ®éng ¶nh h−ëng ®Õn tÝnh chÊt dinh d−ìng cña c¸c lo¹i h¹t trªn. Axit phytic cã c«ng thøc ph©n tö C6H18O24P6 vµ ph©n tö l−îng lµ 660,04. Danh ph¸p quèc tÕ cña axit phytic ®−îc gäi lµ myo-inositol 1,2,3,4,5,6 – hexakisdihydrogen phosphate (IUPAC- IUB, 1977) [94]. Thùc tÕ, axit phytic th−êng tån t¹i d−íi d¹ng muèi cña c¸c kim lo¹i ho¸ trÞ I, II (th−êng lµ Kali- Magiª- Canxi). C¸c muèi nµy ®−îc gäi lµ phytat vµ chóng ®−îc xem nh− lµ kho dù tr÷ photpho lín trong c¸c h¹t thùc vËt. Cã nhiÒu nghiªn cøu vÒ m« h×nh cÊu tróc ph©n tö cña axit phytic nh−ng c¸c nghiªn cøu nµy l¹i ®−a ®Õn nh÷ng kÕt luËn rÊt kh¸c nhau. Trong sè c¸c nghiªn cøu ®ã cã hai nghiªn cøu tiªu biÓu cña hai nhãm chuyªn gia kh¸c nhau ®−îc biÕt ®Õn nhiÒu h¬n c¶. §ã lµ nghiªn cøu cña Johnson vµ Tate (1969) b»ng ph−¬ng ph¸p céng h−ëng ®iÖn tõ h¹t nh©n 31P (31P- NMR) vµ nghiªn cøu cña Blank vµ cs (1971) b»ng ph−¬ng ph¸p nhiÔu x¹ tia X. Tuy nhiªn hai nhãm nghiªn cøu nµy l¹i ®−a ra hai kÕt luËn tr¸i ng−îc nhau. Theo Johnson vµ Tate th× trong cÊu tróc cña ph©n tö axit phytic cã mét gèc phosphat ë vÞ trÝ sè 2 (gèc phosphat g¾n víi nguyªn tö C sè 2) n»m theo h−íng trôc th¼ng ®øng cßn c¸c gèc phosphat ë vÞ trÝ kh¸c th× cã h−íng nghiªng mét gãc so víi ph−¬ng th¼ng ®øng. Ng−îc l¹i, kÕt luËn cña Blank l¹i cho r»ng c¸c gèc phosphat 1,3,4,5 vµ 6 n»m theo h−íng trôc th¼ng ®øng cßn gèc phosphat n»m ë vÞ trÝ sè 2 l¹i nghiªng theo gãc 1/4. Tuy nhiªn, kÕt luËn vÒ cÊu tróc ph©n tö cña axit phytic theo ph−¬ng ph¸p Johnson vµ Tate ®−îc nhiÒu sù t¸n ®ång h¬n. M« h×nh theo kÕt luËn nµy ®−îc m« t¶ ë H×nh 1 1 4 6 2 3 21 H×nh 1: M« h×nh cÊu tróc ph©n tö axit phytic (myo- inositol hexakisphosphate). C¸c vßng trßn biÓu diÔn c¸c gèc phosphate, c¸c nguyªn tö c¸cbon ®−îc ®¸nh sè tõ 1 ®Õn 6 C¸c gèc phosphat trong ph©n tö axit phytic cã thÓ bÞ t¸ch ra ë c¸c pH nhÊt ®Þnh. B»ng ph−¬ng ph¸p céng h−ëng ®iÖn tõ h¹t nh©n 31P(31P- NMR) vµ ph−¬ng ph¸p ®Þnh ph©n pH, c¸c nhµ khoa häc ®· kÕt luËn r»ng sè gèc phosphat bÞ ra t¸ch tuú thuéc vµo kho¶ng pH cña m«i tr−êng. Hä ®· x¸c ®Þnh ®−îc gi¸ trÞ cña h»ng sè axit pKa khi c¸c gèc phosphat cña ph©n tö axit phytic ®−îc t¸ch ra nh− sau: trong m«i tr−êng axit m¹nh mµ pKa = 1,1- 2,1 toµn bé 6 gèc phosphat cña ph©n tö axit phytic ®Òu bÞ t¸ch ra; trong m«i tr−êng axit yÕu h¬n mµ pKa = 5,7 th× chØ cã mét gèc phosphat bÞ t¸ch ra; trong m«i tr−êng axit yÕu mµ pKa = 6,8- 7,6 th× cã 2 gèc phosphat bÞ t¸ch ra; cßn khi trong m«i tr−êng axit rÊt yÕu, pKa = 10- 12 sÏ cã 3 gèc phosphat bÞ t¸ch ra. §iÒu nµy cho thÊy, axit phytic cã nhiÒu kh¶ n¨ng h×nh thµnh hîp chÊt víi c¸c ion d−¬ng ®a ho¸ trÞ vµ c¸c protein trong c¬ thÓ v× chóng cã rÊt nhiÒu kh¶ n¨ng tån t¹i ë c¸c d¹ng ph©n tö mang ®iÖn tÝch ©m trong mét d¶i pH réng. Chøc n¨ng sinh lý cña axit phytic: Axit phytic ®−îc t×m thÊy nhiÒu trong c¸c h¹t thùc vËt, ®Æc biÖt lµ h¹t c¸c lo¹i ngò cèc vµ h¹t c¸c lo¹i ®Ëu ®ç. V× trong thµnh phÇn cÊu t¹o nªn ph©n tö axit phytic cã chøa mét l−îng phospho t−¬ng ®èi lín nªn axit phytic vµ c¸c muèi cña chóng trong c¸c h¹t thùc vËt lµ mét nguån dù tr÷ phospho kh¸ dåi dµo cã thÓ tËn dông nh»m cung cÊp kho¸ng chÊt cho c¬ thÓ. Axit phytic cßn lµ mét nguån dù tr÷ n¨ng l−îng, nguån myo-inositol (thµnh phÇn cÊu t¹o nÒn vá ngoµi cña thµnh tÕ bµo) t−¬ng ®èi lín. Axit phytic trong c¸c h¹t thùc vËt cã nh÷ng ¶nh h−ëng nhÊt ®Þnh ®Õn ®Æc tÝnh sinh lý cña h¹t. Nã t¸c ®éng ®Õn tr¹ng th¸i ngñ nghØ cña h¹t do nã chèng l¹i sù oxy ho¸ tù nhiªn trong qu¸ tr×nh ngñ nghØ(chèng l¹i sù h« hÊp) cña c¸c h¹t thùc vËt, v× vËy lµm chËm sù ph¸t triÓn vµ cã thÓ lµm mÊt kh¶ n¨ng n¶y mÇm cña c¸c h¹t nµy. §èi víi ®éng vËt, axit phytic còng cã nh÷ng vai trß tÝch cùc nhÊt ®Þnh. Trong nh÷ng vai trß ®· ®−îc biÕt ®Õn nh− lµ nguån cung cÊp phospho vµ myo- inositol th× nã cßn ®−îc coi nh− lµ mét t¸c nh©n chèng ung th− ®−êng ruét vµ ung th− vó ë ®éng vËt. Sù cã mÆt cña 22 axit phytic kh«ng tiªu ho¸ trong ®−êng ruét cã thÓ b¶o vÖ c¬ thÓ nhê kh¶ n¨ng chèng l¹i sù ph¸t triÓn cña c¸c khèi u ë trong ruét. Vµo cuèi thËp kû 80, ®Çu thËp kû 90 ng−êi ta ®· chøng minh ®−îc vai trß gi¸n tiÕp cña inositol phosphate trong qu¸ tr×nh vËn chuyÓn vËt chÊt trong tÕ bµo, ®Æc biÖt lµ vai trß cña inositol - triphosphate. Chóng lµ dÊu hiÖu cña sù di truyÒn tÝnh tr¹ng vµ cã liªn quan rÊt lín ®Õn sù biÕn ®æi chøc n¨ng cña tÕ bµo ®èi víi c¶ tÕ bµo ®éng vËt vµ thùc vËt. Ngoµi nh÷ng t¸c ®éng sinh lý nªu trªn, ng−êi ta dù ®o¸n r»ng axit phytic cßn cã thÓ cã nh÷ng chøc n¨ng ch−a biÕt kh¸c. HiÖu øng kh¸ng dinh d−ìng cña axit phytic Mét ®Æc tÝnh bÊt lîi næi bËt nhÊt cña axit phytic ®èi víi c¬ thÓ ®éng vËt lµ hiÖu øng kh¸ng dinh d−ìng. HiÖu øng nµy t¹o nªn do nguyªn nh©n cÊu tróc bÊt th−êng cña axit phytic. Khi ph©n tö axit phytic ë d¹ng ph©n ly hoµn toµn, 6 nhãm phosphate cña chóng sÏ mang tæng ®iÖn tÝch –12. V× vËy, chóng cã nhiÒu kh¶ n¨ng kÕt hîp víi c¸c ion d−¬ng ho¸ trÞ 1, 2, 3 hoÆc hçn hîp cña c¸c ion ®ã, h×nh thµnh nªn c¸c hîp chÊt kh«ng hoµ tan, nªn rÊt khã tiªu ho¸. Sù h×nh thµnh c¸c hîp chÊt v« c¬ kh«ng tan trong ®−êng ruét ®· ng¨n c¶n sù hÊp thô c¸c kho¸ng chÊt cña c¬ thÓ ®éng vËt. Bëi v× axit phytic khi kÕt hîp víi c¸c ion kim lo¹i nh− Fe3+, Mg2+, Ca2+, Zn+ ...sÏ ng¨n c¶n kh¶ n¨ng kÕt hîp cña c¸c ion kim lo¹i nµy víi c¸c axit bÐo kh«ng no lµm gi¶m kh¶ n¨ng tiªu ho¸ thøc ¨n cña ®éng vËt. Nh− vËy, yÕu tè nµy ®· lµm gi¶m l−îng kho¸ng cÇn thiÕt ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ®éng vËt qua con ®−êng thøc ¨n mµ lÏ ra c¬ thÓ ®éng vËt cã thÓ hÊp thô ®−îc, do ®ã lµm gi¶m gi¸ trÞ dinh d−ìng cña nguån thøc ¨n. V× vËy mµ axit phytic ®−îc coi lµ mét yÕu tè kh¸ng dinh d−ìng ë ®éng vËt, ®Æc biÖt lµ c¸c ®éng vËt cã d¹ dµy ®¬n ng¨n nh− gia cÇm, lîn. Víi mét sè nguyªn tè vi l−îng, vÝ dô nh− kÏm (Zn) th× gi¸ trÞ dinh d−ìng cña nã chÞu ¶nh h−ëng rÊt lín bëi axit phytic. Mét vµi thÝ nghiÖm ®· cho thÊy viÖc bæ sung dÇn dÇn axit phytic vµo trong khÈu phÇn thøc ¨n cña vËt nu«i ®· ¶nh h−ëng ©m tÝnh ®Õn sù hÊp thô Zn2+ cña c¬ thÓ (c¬ thÓ kh«ng hÊp thô ®−îc Zn2+) vµ tèc ®é t¨ng tr−ëng träng l−îng cña ®éng vËt thÝ nghiÖm mét c¸ch râ rÖt. 23 Axit phytic cã kh¶ n¨ng kÕt hîp víi protein t¹o thµnh phøc chÊt phytat- protein trong mét kho¶ng pH rÊt réng. ë pH rÊt thÊp, axit phytic mang ®iÖn tÝch ©m lín do sù ph©n ly cña toµn bé c¸c gèc phosphat trong ph©n tö. Trong ®iÒu kiÖn nµy, axit phytic cã thÓ lµm h¹n chÕ kh¶ n¨ng hoµ tan cña c¸c protein bëi v× cã sù liªn kÕt ion gi÷a c¸c gèc phosphat c¬ b¶n víi c¸c gèc tù do cña amino axit (L-lysin, histidin, arginin). Trong m«i tr−êng cã tÝnh axit, axit phytic liªn kÕt chÆt chÏ víi c¸c protein thùc vËt do ®ã ®iÓm ®¼ng ®iÖn (pI) cña c¸c protein thùc vËt lóc nµy n»m trong kho¶ng pH = 4 - 5. ë kho¶ng pH = 6 - 8, c¶ axit phytic vµ protein thùc vËt ®Òu mang ®iÖn tÝch ©m. Tuy nhiªn, ë ®iÒu kiÖn nµy vÉn cã thÓ h×nh thµnh phøc chÊt gi÷a axit phytic vµ c¸c protein. C¬ chÕ x¶y ra cã thÓ lµ sù liªn kÕt trùc tiÕp cña axit phytic víi proton ë c¸c nhãm cuèi cïng α-NH2 vµ ε- NH2 cña gèc L-lysine tù do hoÆc liªn kÕt qua nh©n tè trung gian lµ mét cation ®a ho¸ trÞ. Còng bëi liªn kÕt víi protein thùc vËt nªn axit phytic lµm gi¶m kh¶ n¨ng hoµ tan vµ kh¶ n¨ng tiªu ho¸ cña c¸c protein nµy do ®ã lµm gi¶m gi¸ trÞ dinh d−ìng cña chóng. Ngoµi viÖc t¹o phøc chÊt víi c¸c kho¸ng chÊt vµ c¸c protein, axit phytic cßn t¸c ®éng ®Õn c¸c enzym nh− trypsin, pepsin, α- amilaza, β- galactosidaza vµ kÕt qu¶ lµ lµm gi¶m ho¹t tÝnh cña c¸c enzym tiªu ho¸ quan träng nµy. Nguån gèc vµ sù ph©n bè cña axit phytic trong tù nhiªn Axit phytic th−êng tån t¹i ë d¹ng tiÒn khëi lµ muèi cña c¸c ion kim lo¹i cã ho¸ trÞ mét hay nhiÒu hoÆc cã thÓ lµ hçn hîp cña chóng, ch¼ng h¹n nh− hçn hîp muèi Kali – Magiª trong g¹o, hçn hîp Canxi – Magiª - Kali trong c¸c h¹t cã dÇu. C¸c muèi nµy th−êng tËp trung ë mét sè vïng nhÊt ®Þnh trong c¸c h¹t thùc vËt. Axit phytic ®−îc tÝch luü dÇn trong h¹t tõ khi h¹t non ®Õn khi h¹t tr−ëng thµnh trong suèt qu¸ tr×nh chÝn cïng víi c¸c chÊt dù tr÷ kh¸c trong h¹t nh− tinh bét, lipÝt.. Tuy nhiªn, møc ®é tËp trung cña axit phytic trong c¸c h¹t thùc vËt kh¸c nhau lµ kh«ng gièng nhau. VÝ dô nh− trong c¸c lo¹i ngò cèc, axit phytic ®−îc tÝch luü nhiÒu trong h¹t phÊn cßn ®èi víi c¸c lo¹i ®Ëu th× axit phytic ®−îc tÝch luü nhiÒu trong c¸c h¹t tinh thÓ cña chóng. NhiÒu nghiªn cøu cho thÊy r»ng, ë c©y mét l¸ mÇm nh− lóa, lóa m×... th× trong néi nhò vµ nh©n cña h¹t hÇu nh− kh«ng chøa phytat mµ l−îng phytat l¹i ®−îc t×m thÊy chñ yÕu trong ph«i vµ trong líp tÕ bµo h¹t phÊn. 24 Ng−îc l¹i, ë c©y hai l¸ mÇm th× l−îng phytat chñ yÕu l¹i n»m trong thµnh phÇn néi nhò (chiÕm 99%) vµ chØ cã kho¶ng 1% lµ ë trong ph«i (hay mÇm) cña h¹t. Nh÷ng nghiªn cøu vÒ phytase Kh¸i niÖm vÒ phytase Phytase lµ mét enzym xóc t¸c cho ph¶n øng thuû ph©n axit phytic (myo - inositol hexakisphosphate) thµnh c¸c myo - inositol phosphate ph©n tö thÊp h¬n vµ c¸c monophosphate v« c¬. Trong mét sè tr−êng hîp, ph¶n øng thuû ph©n cã thÓ x¶y ra hoµn toµn, gi¶i phãng toµn bé c¸c gèc phosphat trong ph©n tö axit phytic (hay phytat) vµ h×nh thµnh nªn c¸c myo - inositol tù do. Phytase cã tªn gäi ®Çy ®ñ, theo quy −íc quèc tÕ lµ: myo - inositol hexakisphosphat phosphohydrolase. D¹ng phytat lµ mét phøc chÊt cña phospho víi c¸c muèi kho¸ng, protein vµ c¸c enzym trong c¸c h¹t thùc vËt. C¸c d¹ng chÊt nµy ®−îc coi lµ yÕu tè phi dinh d−ìng. Enzym phytase sÏ gi¶i phãng photpho chøa trong c¸c h¹t ngò cèc, h¹t ®Ëu vµ h¹t cã dÇu b»ng c¸ch ph¸ vì cÊu tróc phytat ®ång thêi gi¶i phãng c¸c muèi kho¸ng nh− Ca, Mg,...c¸c axit amin kÕt dÝnh trong ph©n tö phytat. Ho¹t ®é phytase cña chÕ phÈm enzym ®Æc tr−ng cho kh¶ n¨ng xóc t¸c ph©n gi¶i hîp chÊt phytat (myo- inositol hexakis phosphate) thµnh c¸c myo- inositol phosphat ph©n tö thÊp h¬n vµ c¸c gèc phosphat v« c¬. Ho¹t ®é phytase ®−îc biÓu thÞ b»ng sè ®¬n vÞ ho¹t ®é trong 1ml (hay 1g) chÕ phÈm. §Þnh nghÜa ®¬n vÞ ho¹t ®é: Mét ®¬n vÞ ho¹t ®é phytase lµ l−îng enzym xóc t¸c ph¶n øng thuû ph©n ®Ó gi¶i phãng ra 1µmol phosphat v« c¬ trong thêi gian mét phót tõ dung dÞch natri - phytat ë 370C, pH = 5,5 vµ trong c¸c ®iÒu kiÖn cña ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch. Ph©n lo¹i phytase Tæ chøc ®Þnh tªn enzym thuéc Héi Ho¸ sinh Quèc tÕ ®· ph©n lo¹i phytase thµnh 2 lo¹i lµ 3- phytase (EC 3.1.3.8) vµ 6- phytase (EC 3.1.3.26). C¸ch ®Þnh tªn nµy ®−îc dùa trªn c¬ së xuÊt ph¸t tõ nhãm phosphat ®Çu tiªn ®−îc gi¶i phãng ra tõ ph©n tö phytat khi enzym xóc t¸c ph¶n øng thuû ph©n. Ng−êi ta thÊy r»ng lo¹i 3- phytase (tøc enzym xóc t¸c ph¶n øng thuû ph©n hîp chÊt phytat vµ gi¶i phãng ra gèc phosphat ®Çu tiªn ë vÞ trÝ sè 3) 25 th−êng cã ë vi sinh vËt cßn 6- phytase (lµ enzym xóc t¸c ph¶n øng thuû ph©n hîp chÊt phytat vµ gi¶i phãng ra gèc phosphat ®Çu tiªn ë vÞ trÝ sè 6) cã mÆt chñ yÕu ë trong thùc vËt. §Æc ®iÓm cÊu t¹o vµ tÝnh chÊt cña enzym phytase §Æc ®iÓm cÊu t¹o cña phytase Phytase còng gièng nh− mäi enzym kh¸c cã b¶n chÊt lµ protein. Chóng lµ nh÷ng ph©n tö cã khèi l−îng tõ 20000 ®Õn 1000000 dalton. KÝch th−íc ph©n tö protein cña enzym phytase s¶n sinh tõ c¸c nguån kh¸c nhau th× kh¸c nhau. Ng−êi ta ®· tÝnh to¸n vµ tiÕn hµnh thÝ nghiÖm x¸c ®Þnh khèi l−îng ph©n tö cña protein phytase thu ®−îc tõ mét sè nguån kh¸c nhau. C¸c nghiªn cøu ®· cho thÊy r»ng hÇu hÕt c¸c phytase thu ®−îc tõ c¸c chñng vi sinh vËt cho ®Õn nay ®Òu lµ c¸c enzym ®−îc cÊu t¹o chØ gåm mét ph©n tö. Nh−ng phytase ë mét sè ®éng vËt vµ thùc vËt th× protein cña chóng l¹i ®−îc cÊu t¹o bëi nhiÒu phÇn nhá, c¸c phÇn ®ã ®−îc gäi lµ c¸c tiÓu ®¬n vÞ. VÝ dô nh− phytase tÝch luü trong c¸c h¹t ng« ®ang n¶y mÇm lµ enzym mµ ph©n tö protein cña chóng bao gåm 2 tiÓu ®¬n vÞ cã träng l−îng ph©n tö b»ng nhau lµ 38 kDa. Cßn phytase ®−îc t¸ch chiÕt tõ ruét cña mét loµi chuét l¹i ®−îc cÊu t¹o bëi 2 tiÓu ®¬n vÞ lµ 2 b¨ng protein cã khèi l−îng ®−îc x¸c ®Þnh b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel polyacrylamid (SDS- PAGE) −íc tÝnh kho¶ng 70 vµ 90 kDa. Tuy nhiªn ng−êi ta ®· x¸c ®Þnh ®−îc r»ng chØ cã tiÓu ®¬n vÞ cã kÝch th−íc 90 kDa lµ cã kh¶ n¨ng thuû ph©n axit phytic v× hai b¨ng protein nµy biÓu hiÖn cho hai lo¹i enzym kh¸c nhau t−¬ng øng lµ phosphataza kiÒm tÝnh vµ phytase.Cã mét tr−êng hîp ®Æc biÖt lµ phytase thu ®−îc tõ chñng Klebsiella aerogenes l¹i gåm hai d¹ng kh¸c nhau. D¹ng thø nhÊt cã thÓ coi lµ d¹ng enzym gèc, cã kÝch th−íc lín mét c¸ch kh¸c th−êng (700 kDa). D¹ng thø hai cã thÓ lµ mét m¶nh nhá cña enzym gèc, cã khèi l−îng ph©n tö rÊt thÊp chØ kho¶ng 10- 13 kDa nh−ng nã l¹i mang ®Çy ®ñ ho¹t tÝnh cña mét enzym. TÝnh chÊt cña phytase C¬ chÕ thuû ph©n axit phytic cña enzym phytase Khi thuû ph©n axit phytic hay phytat, enzym phytase cã t¸c dông c¾t ®øt c¸c liªn kÕt trong ph©n tö axit phytic, phytat. Qu¸ tr×nh c¾t ®øt nµy x¶y ra nhanh hay chËm vµ hoµn 26 toµn hay kh«ng hoµn toµn phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè nh− nhiÖt ®é ph¶n øng, pH ph¶n øng, l−îng c¬ chÊt vµ l−îng enzym. Ngoµi ra, nã cßn bÞ ¶nh h−ëng bëi c¸c ion kim lo¹i. Sau qu¸ tr×nh thuû ph©n, nã sÏ gi¶i phãng c¸c gèc phosphat, c¸c myo- inositol vµ c¸c muèi kho¸ng. C¬ chÕ thuû ph©n nh− H×nh 2 H×nh 2: Sù thuû ph©n axit phytic b»ng enzym phytase NhiÖt ®é tèi −u cho sù ho¹t ®éng cña phytase: Nh×n chung, vËn tèc ph¶n øng do enzym xóc t¸c th−êng t¨ng lªn theo nhiÖt ®é nh−ng chØ t¨ng lªn trong mét giíi h¹n x¸c ®Þnh mµ ë ®ã, phÇn tö enzym vÉn cßn bÒn vµ ch−a bÞ biÕn tÝnh. NhiÖt ®é thÝch hîp cho sù ho¹t ®éng cña mçi enzym th−êng t−¬ng ®èi réng. §èi víi phytase, ng−êi ta ®· nghiªn cøu vµ cho thÊy r»ng chóng cã thÓ ho¹t ®éng trong kho¶ng 45-750C. Nh−ng nhiÖt ®é mµ øng víi ho¹t ®é enzym cao nhÊt th−êng chØ tån t¹i mét ®iÓm vµ nhiÖt ®é ®ã gäi lµ nhiÖt ®é tèi −u cña enzym (topt). NhiÖt ®é tèi −u cña phytase thu ®−îc tõ c¸c nguån kh¸c nhau th× còng rÊt kh¸c nhau, d¶i nhiÖt ®é nµy rÊt réng, tõ 37- 770C. Tuy nhiªn topt cña mét enzym th−êng kh«ng cè ®Þnh mµ cã thÓ thay ®æi tuú theo c¬ chÊt, pH m«i tr−êng, thêi gian ph¶n øng. Khi nhiÖt ®é n»m ngoµi kho¶ng thÝch nghi, enzym cã thÓ bÞ v« ho¹t t¹m thêi hoÆc v« ho¹t hoµn toµn. NhiÖt ®é mµ enzym bÞ mÊt ho¹t tÝnh xóc t¸c OPO3H2 OPO3H2H2O3PO Phytase H2O3PO H2O3PO H2O3PO H2O3PO H2O3PO OPO3H2 H2O3PO HO OPO3H2 + PO43- 27 hoµn toµn gäi lµ nhiÖt ®é tíi h¹n. NhiÖt ®é nµy th−êng vµo kho¶ng trªn 700C. ë nhiÖt ®é tíi h¹n, enzym bÞ biÕn tÝnh, Ýt cã kh¶ n¨ng phôc håi l¹i ho¹t ®é. Ng−îc l¹i, ë nhiÖt ®é d−íi 00C, ho¹t ®é cña enzym tuy bÞ gi¶m nh−ng l¹i cã thÓ t¨ng lªn khi ®−a vÒ nhiÖt ®é b×nh th−êng. pH tèi −u cho sù ho¹t ®éng cña phytase: pH cña m«i tr−êng ¶nh h−ëng râ rÖt ®Õn ph¶n øng enzym v× nã ¶nh h−ëng ®Õn møc ®é ion ho¸ c¬ chÊt, enzym vµ ®é bÒn cña protein enzym. §a sè c¸c enzym bÒn trong giíi h¹n pH gi÷a 5 ®Õn 9. §é bÒn cña enzym ®èi víi pH m«i tr−êng còng cã thÓ t¨ng lªn khi cã c¬ chÊt, coenzym vµ Ca2+... pH tèi −u (pHopt) cho ho¹t ®éng cña phytase thu ®−îc tõ c¸c nguån kh¸c nhau rÊt kh¸c nhau. pH thÝch hîp cho ho¹t ®éng cña chóng th−êng vµo kho¶ng 2,2 ®Õn 8. HÇu hÕt c¸c phytase tõ vi sinh vËt th−êng cã pHopt n»m trong kho¶ng hÑp 4,5- 5,6. Tuy nhiªn phytase tõ nÊm, ®Æc biÖt lµ Aspergillus fumigatus l¹i cã kho¶ng pH tèi −u réng. Cã Ýt nhÊt 80% trong loµi cã ho¹t ®é cùc ®¹i ë pH gi÷a 4 vµ 7,3. Th−êng th× gi¸ trÞ pHopt cu¶ mét enzym còng kh«ng cè ®Þnh mµ phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè kh¸c nh− c¬ chÊt, tÝnh chÊt dung dÞch ®Öm, nhiÖt ®é... Qua c¸c nghiªn cøu cho thÊy, trong cïng mét ®iÒu kiÖn nhÊt ®Þnh th× pHopt cña phytase cña c¸c chñng ®−îc t×m thÊy hÇu nh− chØ ë mét gi¸ trÞ nhÊt ®Þnh, riªng cã hai lo¹i phytase tõ Aspergillus niger NRRL3135 vµ Citrobacter freundii kh¸c víi c¸c phytase kh¸c ë ®iÓm lµ chóng cã hai gi¸ trÞ pHopt kh¸c nhau. Phytase tõ mét sè loµi vi khuÈn thuéc chi Bacillus cã pHopt vµo kho¶ng pH trung tÝnh (6,5-7,5). Cßn phytase thu ®−îc tõ thùc vËt nh− h¹t ®Ëu vµ phÊn hoa (hoa HuÖ t©y) l¹i cã pHopt cao h¬n (th−êng kho¶ng 8,0). Nguån nguyªn liÖu ®Ó thu phytase Phytase tõ nguån thùc vËt Phytase cã mÆt phæ biÕn trong giíi thùc vËt, ®Æc biÖt chóng cã thÓ t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ tõ c¸c lo¹i ngò cèc nh− lóa m×, ng«, lóa m¹ch, g¹o.. vµ c¸c lo¹i ®Ëu nh−: ®Ëu xanh, ®Ëu Ên ®é, ®Ëu lïn, ®Ëu tr¾ng California. Ho¹t tÝnh phytase còng t×m thÊy trong c©y mï t¹c tr¾ng, khoai t©y, cñ c¶i, rau diÕp, rau Bina, phÊn hoa HuÖ t©y (hoa loa kÌn). Phytase tõ nguån ®éng vËt 28 ë ®éng vËt, phytase ®· ®−îc t×m thÊy trong ruét vµ d¹ dµy cña c¸c loµi ®éng vËt cã d¹ dµy ®¬n ng¨n nh− lîn vµ gia cÇm. Tuy nhiªn, c¸c phytase nµy gÇn nh− kh«ng cã ý nghÜa g× ®èi víi viÖc ph©n gi¶i phytate cã trong thøc ¨n ®−îc ®−a vµo d¹ dµy cña ®éng vËt. Qua kiÓm tra, ng−êi ta ®· thÊy r»ng nhiÒu lo¹i inositol polyphosphat phosphatase (MIPP) mang l¹i ho¹t tÝnh phytase ®Òu cã trong hÖ thèng ®−êng ruét cña tÊt c¶ c¸c con chuét ®em lµm thÝ nghiÖm nh−ng chñ yÕu tËp trung nhiÒu ë thËn vµ gan cña loµi ®éng vËt nµy. C¸c nhµ khoa häc ®· t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn ®−îc thµnh phÇn inositol polyphosphatate phosphatase mang ho¹t tÝnh ë gan cña loµi chuét trªn. Mét lo¹i enzym gièng phytase còng ®· ®−îc t×m thÊy ë loµi ®éng vËt nguyªn sinh Paramecium. Phytase tõ nguån vi sinh vËt Chóng ta ®· biÕt r»ng enzym nãi chung cã trong tÊt c¶ c¸c c¬ quan, m« cña ®éng vËt, thùc vËt còng nh− trong tÕ bµo vi sinh vËt. Nguån vi sinh vËt l¹i v« cïng phong phó vµ ®a d¹ng nªn phytase còng nh− c¸c lo¹i enzym kh¸c cã thÓ ®−îc sinh ra tõ rÊt nhiÒu loµi vi sinh vËt kh¸c nhau. Ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn vµ t¸ch ®−îc phytase ë rÊt nhiÒu loµi nÊm mèc, ®Æc biÖt lµ Aspergillus. Cho ®Õn nay ®· ph©n lËp ®−îc trªn 200 loµi vi sinh vËt tõ ®Êt cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase. PhÇn lín c¸c vi sinh vËt nµy cho s¶n phÈm phytase néi bµo, chØ cã kho¶ng 30 loµi trong sè ®ã lµ cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase ngo¹i bµo. TÊt c¶ c¸c vi sinh vËt s¶n sinh phytase ngo¹i bµo thuéc lo¹i nÊm mèc, cã 28 loµi thuéc chñng Aspergillus, chØ cã mét lo¹i tõ Penecillium vµ mét lo¹i tõ Mucor. Trong 28 loµi Aspergillus cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase ngo¹i bµo ®· ph©n lËp ®−îc cã 21 loµi thuéc nhãm Aspergillus niger. C¸c nghiªn cøu cßn kh¼ng ®Þnh r»ng chñng Aspergillus niger lµ nguån thu phytase ngo¹i bµo tèt nhÊt. Phytase còng ®−îc ph¸t hiÖn ra ë nhiÒu loµi vi khuÈn kh¸c nhau nh− Aerobacter aerogenes, Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, Bacillus subtilis natto. Vi khuÈn sinh tæng hîp phytase ngo¹i bµo chØ cã hai loµi ®ã lµ Bacillus vµ Enterobacter. Mét sè nÊm men nh− Sacharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida... còng cã kh¶ n¨ng sinh phytase. MÆc dï phytase rÊt phong phó trong sinh giíi, cã thÓ cã nhiÒu nguån thu kh¸c nhau song viÖc t¸ch vµ thu chóng, nhÊt lµ t¸ch víi quy m« c«ng nghiÖp lîi vÒ kinh tÕ chØ cã thÓ tiÕn hµnh trong nh÷ng tr−êng hîp mµ vËt liÖu cã chøa mét l−îng lín enzym còng nh− cho 29 phÐp thu ®−îc enzym víi hiÖu suÊt cao. Trong tay con ng−êi cã ba nguån nguyªn liÖu sinh häc c¬ b¶n ®Ó t¸ch chiÕt bÊt kú mét lo¹i enzym nµo nãi chung. §ã lµ c¸c m« vµ c¬ quan ®éng vËt, m« vµ c¬ quan thùc vËt, tÕ bµo vi sinh vËt. Trong c¸c nguån nguyªn liÖu sinh häc trªn th× chØ cã nguån nguyªn liÖu vi sinh vËt lµ dåi dµo vµ ®Çy høa hÑn v× viÖc sö dông vi sinh vËt lµm nguån nguyªn liÖu ®Ó s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm enzym sÏ kh¾c phôc ®−îc mäi khã kh¨n vµ h¹n chÕ so víi hai nguån nguyªn liÖu trªn. Thùc tÕ ®· chøng minh tÝnh −u viÖt vµ kh¶ n¨ng to lín cña c¸c nguån nguyªn liÖu vi sinh vËt: - Thø nhÊt, vi sinh vËt lµ nguån nguyªn liÖu v« tËn ®Ó s¶n xuÊt enzym nãi chung vµ phytase nãi riªng víi mét l−îng lín vµ cã thÓ më réng ®Ó s¶n xuÊt tíi quy m« cÇn thiÕt, ®ång thêi viÖc thu chÕ phÈm còng dÔ dµng. - Thø hai, tõ vi sinh vËt kh«ng nh÷ng chØ thu ®−îc mét sè l−îng lín c¸c enzym kh¸c nhau, mµ tõ mét sè rÊt lín c¸c vi sinh vËt ®· biÕt lu«n lu«n cã thÓ t×m ®−îc nh÷ng vi sinh vËt cã phøc hÖ enzym thÝch hîp h¬n nhiÒu víi ®iÒu kiÖn cña s¶n xuÊt. Vi sinh vËt cã thÓ ®ång ho¸ bÊt kú chÊt nµo trong thiªn nhiªn trong khi ®ã cã rÊt nhiÒu chÊt mµ ®éng vËt vµ thùc vËt kh«ng thÓ ®ång ho¸ ®−îc. Tuy nhiªn muèn sö dông c¸c nguån chÊt v« cïng phong phó ®ã th× tÕ bµo vi sinh vËt ph¶i chøa nh÷ng hÖ enzym cÇn thiÕt cho c¸c nhu cÇu kü thuËt kh¸c nhau - Thø ba, phytase cña vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh rÊt m¹nh (®Æc biÖt lµ phytase tõ nÊm mèc), v−ît xa ho¹t tÝnh phytase tõ nguån ®éng vËt vµ thùc vËt. - Thø t−, ho¹t tÝnh cña phytase vµ kh¶ n¨ng sinh tæng hîp phytase cña vi sinh vËt cµng cao khi g©y nh÷ng biÕn chñng. §iÒu nµy cho phÐp ta cã thÓ thu ®−îc l−îng enzym lín víi ho¹t tÝnh vµ ®é thuÇn khiÕt cao. - Thø n¨m, vi sinh vËt sinh s¶n víi tèc ®é nhanh chãng, l¹i cã kÝch th−íc vµ khèi l−îng nhá nh−ng l¹i cã tû lÖ enzym trong tÕ bµo t−¬ng ®èi lín nªn qu¸ tr×nh s¶n xuÊt chÕ phÈm enzym kh¸ dÔ dµng, thao t¸c thuËn tiÖn, hiÖu suÊt thu håi cao. Trong mét thêi gian ng¾n, víi mét quy m« nhá cã thÓ s¶n xuÊt mét l−îng lín chÕ phÈm enzym. - Cuèi cïng, thøc ¨n ®Ó nu«i vi sinh vËt dÔ kiÕm, rÎ tiÒn nªn sÏ gi¶m chi phÝ trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt, ®em l¹i hiÖu qu¶ kinh tÕ lín. 30 ChÝnh v× nh÷ng lý do trªn mµ viÖc ®Ò x−íng vµ hoµn chØnh ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt phytase tõ vi sinh vËt cã mét ý nghÜa rÊt lín. HiÖn nay, trªn thÕ giíi ®· nghiªn cøu s¶n xuÊt trªn quy m« c«ng nghiÖp phytase ë d¹ng ®¬n chÊt còng nh− chÕ phÈm kü thuËt víi møc ®é tinh khiÕt kh¸c nhau, th−êng tõ nÊm mèc vµ vi khuÈn. B¶ng 1: B¶ng tãm t¾t c¸c phytase thu ®−îc tõ mét sè nguån kh¸c nhau Nguån gèc Tªn chñng VÞ trÝ Aspergillus niger NRRL 3135 Ngo¹i bµo Aspergillus flavus Ngo¹i bµo Aspergillus terrus Ngo¹i bµo Aspergillus carneus Ngo¹i bµo Aspergillus oryzae Ngo¹i bµo Aspergillus fumigatus Ngo¹i bµo Mucor sp Ngo¹i bµo Penicillum sp Ngo¹i bµo Penicillium caseoicolum Ngo¹i bµo NÊm mèc Rhizopus oligosporus Ngo¹i bµo vµ néi bµo Saccharomyces cerevisiae Ngo¹i bµo Schwanniomyces castelii Ngo¹i bµo Khyveromyces fragilis Ngo¹i bµo Candida tropicalis Ngo¹i bµo Torulopsis candida Ngo¹i bµo NÊm men Debaryomyces castelii Ngo¹i bµo Bacillus subtilis Ngo¹i bµo B. subtilis (natto) Ngo¹i bµo B. amyloliquefaciens Ngo¹i bµo Echerichia coli Bµo t−¬ng Klebsiella aerogenes Néi bµo K. terrigenes Néi bµo K. oxytoca Néi bµo Pseudomonas sp Ngo¹i bµo Enterobacter sp Ngo¹i bµo Vi khuÈn Citrobacter freundii Néi bµo 31 MÇm ng« Néi bµo H¹t ®Ëu t−¬ng vµ c¸c ®Ëu kh¸c Néi bµo Thùc VËt Typha latifolia pootten Néi bµo C¬ ruét cña chuét Néi bµo §éng vËt Gan chuét TÕ bµo chÊt øng dông cña phytase Nh− chóng ta ®· biÕt enzym lµ nh÷ng chÊt xóc t¸c sinh häc cã tÝnh ®Æc hiÖu cao ®èi víi c¬ chÊt, do tÕ bµo sèng tæng hîp nªn, ®iÒu khiÓn vËn tèc vµ sù chuyÓn ho¸ cña hµng ngh×n ph¶n øng x¶y ra trong sinh chÊt. Enzym rÊt cã Ých cho con ng−êi trong viÖc nghiªn cøu vµ sö dông ®Ó gi¶i quyÕt c¸c vÊn ®Ò quan träng cña khoa häc, c«ng nghiÖp vµ nÒn kinh tÕ quèc d©n. Trong kho¶ng 20 n¨m trë l¹i ®©y, enzym ®· ®−îc øng dông réng r·i trong rÊt nhiÒu ngµnh kh¸c nhau nh− trong ho¸ häc, trong y häc, trong c«ng nghiÖp nhÑ vµ ®Æc biÖt trong c«ng nghiÖp thùc phÈm. Do ®ã ë nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi, viÖc s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm enzym ®· trë thµnh mét ngµnh c«ng nghiÖp lín. NÒn c«ng nghiÖp s¶n xuÊt chÕ phÈm enzym ®· cã nh÷ng b−íc tiÕn lín víi tiÕn ®é ph¸t triÓn kh¸ m¹nh mÏ. Cµng ngµy cµng xuÊt hiÖn nhiÒu nhµ m¸y s¶n xuÊt c¸c lo¹i chÕ phÈm enzym kh¸c nhau. Enzym phytase ®−îc t×m thÊy vµ ®· ®−îc chøng minh r»ng chóng cã thÓ ®em l¹i nh÷ng lîi Ých cùc kú to lín cho nÒn n«ng nghiÖp nãi riªng vµ cho nÒn kinh tÕ nãi chung. ChÝnh v× vËy mµ con ng−êi ®· kh«ng ngõng khai th¸c nguån lîi nµy vµ ®· ¸p dông phytase trong nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau. øng dông trong n«ng nghiÖp ViÖc sö dông chÕ phÈm enzym phytase bæ sung vµo thøc ¨n cho ch¨n nu«i ngµy cµng ®−îc t¨ng c−êng, bëi v× qua c¸c nghiªn cøu ®· cho thÊy r»ng viÖc bæ sung chÕ phÈm sinh häc nãi chung vµ chÕ phÈm enzym nãi riªng vµo thøc ¨n cho gia sóc, gia cÇm ®· ®−a s¶n l−îng lªn rÊt cao víi gi¸ thµnh h¹. Nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ngµnh ch¨n nu«i n−íc ta ®· cã nhiÒu tiÕn bé ®¸ng kÓ. Cïng víi viÖc nghiªn cøu lai t¹o gièng vµ hoµn thiÖn c¸c quy tr×nh ch¨m sãc nu«i d−ìng th× kh©u chÕ biÕn thøc ¨n cho chóng còng lµ mét nh©n tè quyÕt ®Þnh 32 ®Õn hiÖu qu¶ trong ch¨n nu«i. ChÝnh v× vËy, ng−êi ta ®· sö dông chÕ phÈm enzym ®Ó bæ sung vµo thøc ¨n ch¨n nu«i nh»m t¨ng kh¶ n¨ng chuyÓn ho¸ thøc ¨n cña chóng. RÊt nhiÒu nghiªn cøu ®· chøng minh vai trß t¸c ®éng cña phytase ®èi víi c¬ thÓ ®éng vËt, ®Æc biÖt lµ ®éng vËt cã d¹ dµy ®¬n ng¨n nh− gia cÇm, lîn vµ c¸. N¨m 1992, phytase b¾t ®Çu ®−îc th−¬ng m¹i ho¸ d−íi d¹ng chÕ phÈm ®Ó bæ sung vµo thøc ¨n cña chóng. Tõ nh÷ng lîi Ých mµ phytase cã thÓ mang l¹i cho con ng−êi ®· khiÕn ngµy cµng cã nhiÒu øng dông cña lo¹i enzym nµy trªn nhiÒu lÜnh vùc kh¸c nhau. Ng−êi ta ®· kh«ng ngõng nghiªn cøu nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh chÊt −u viÖt cña phytase ®Ó nh÷ng øng dông cña chóng ®¹t hiÖu qu¶ h¬n. ViÖc sö dông chÕ phÈm phytase ®Ó bæ sung vµo khÈu phÇn thøc ¨n cho vËt nu«i kh«ng nh÷ng cho phÐp c¸c vËt nu«i ®ång ho¸ tèt thµnh phÇn phospho s½n cã trong thøc ¨n, t¨ng sù hÊp thu protein vµ c¸c nguyªn tè kho¸ng mµ cßn gi¶m ®−îc sù « nhiÔm m«i tr−êng do h¹n chÕ ®−îc l−îng phosphat khã tiªu ®−îc th¶i ra theo ph©n cña ®éng vËt. HiÖu qu¶ cña viÖc øng dông nµy ®· ®−îc kiÓm ®Þnh . T¹i Mü, ng−êi ta dù tÝnh r»ng nÕu phytase ®−îc sö dông trong thøc ¨n cho tÊt c¶ c¸c loµi ®éng vËt d¹ dµy ®¬n ng¨n th× sÏ gi¶i phãng ®−îc mét l−îng phospho t−¬ng øng víi gi¸ trÞ 168 triÖu USD vµ lo¹i trõ ®−îc 8,23x104 tÊn phosphat th¶i ra m«i tr−êng hµng n¨m. øng dông trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt giÊy ViÖc nghiªn cøu sù chuyÓn ho¸ cña axit phytic rÊt quan träng trong c«ng nghiÖp s¶n xuÊt giÊy. Mét lo¹i phytase chÞu nhiÖt ®· ®−îc t×m thÊy vµ ng−êi ta ®· ph¸t hiÖn r»ng chóng cã tiÒm n¨ng nh− mét t¸c nh©n sinh häc míi ®Ó lµm gi¶m l−îng axit phytic trong s¶n xuÊt giÊy. Sù ph©n huû axit phytic nhê enzym cã ®iÓm lîi lµ kh«ng t¹o ra c¸c chÊt cã kh¶ n¨ng g©y ung th− vµ c¸c s¶n phÈm trung gian cã tÝnh ®éc cao. Bëi vËy, viÖc sö dông phytase trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt giÊy rÊt cã lîi cho m«i tr−êng vµ ®iÒu nµy sÏ gãp phÇn cho sù ph¸t triÓn cña c¸c c«ng nghÖ s¹ch trong t−¬ng lai. 3.1.4. Tæng quan vÒ s¶n xuÊt pectinaza trªn thÞt qu¶ cµ phª. Pectinaza lµ nhãm enzym xóc t¸c sù ph©n c¾t c¸c hîp chÊt pectin thµnh c¸c hîp phÇn kh¸c nhau. Trong hÖ enzym pectinaza ph©n gi¶i pectin gåm nhiÒu nhãm enzym kh¸c 33 nhau, chóng cã khèi l−îng ph©n tö kh¶n 40,4 kDa. Cã nhiÒu c¸c ph©n lo¹i enzym pectinaza : dùa vµo tÝnh ®Æc hiÖu cã thÓ ph©n ra enzym ph©n gi¶i pectin vµ ph©n gi¶i axit pectinic vµ axit pectic. Dùa vµ c¬ chÕ t¸c dông mµ ng−êi ta chia enzym ra thµnh hai lo¹i: enzym ph©n gi¶I c¸c liªn kÕt ë trong néi m¹ch vµ enzym ph©n gi¶ c¸c liªn kÕt á ®Çu m¹ch. Dùa vµ pH tèi −u cã thÓ chia enzym thµnh enzym pH axit vµ pH kiÒm. §Æc ®iÓm cÊu t¹o vµ tÝnh chÊt cña enzym pectinaza Pectinesteraza: Tªn gäi hÖ thèng lµ pectinhydrolaza (m· sè EC3.1.1.11), víi träng l−îng ph©n tö kh¶ng 41kDa. Pectinesteraza lµ c¸c chÊt xóc t¸c thuû ph©n liªn kÕt este trong ph©n tö pectin hoÆc axit pectinic, kÕt qu¶ l¹o thµnh lµ axit pectinic hoÆc axit pectic vµ r−îu metanol. Khi toµn bé c¸c nhãm metoxyl ®Òu bÞ t¸c khái c¬ chÊt th× s¶n phÈm t¹o thµnh lµ metanol vµ axit polygalaturonic. Sù thuû ph©n chØ xÈy ra ë liªn kÕt este kÒ liÒn víi nhãm -COOH tù do. S¬ ®å t¸c dông cña pectinesteraza lªn hîp chÊt pectin pectinesteraza thu ®−îc tõ c¸c nguån kh¸c nhau th× cã pH tèi −u kh¸c nhau. Pectinesteraza cña sinh vËt cã pH tèi −u tõ 4,5-5,5 cßn cña chÕ phÈm ®· lo¹i bá enzym polygalacturonaza cã pH tèi −u tõ 2,0-6,5. Tr¸I l¹i pH tèi −u cña polyesteraza tõ thùc vËt th−îng ®¼ng cao h¬n lµ 5.0-8,0. NhiÖt ®é tèi −u cña pectinesteraza tõ nÊm mèc lµ : 30-45oC vµ bÞ v« ho¹t khi ë nhiÖt ®é 55-62oC, nhiÖt ®é tèi −u cña pectinesteraza tõ thùc vËt th−îng ®¼ng cao h¬n tõ 55-60oC. Pectinesteraza th−êng ®−îc ho¹t ho¸ bëi c¸c ion Na, K, Ca vµ Mg. Tr¸i l¹i c¸c cation ho¸ trÞ 3 vµ 4 nh− Pb(NO3), Al3(SO4), FeCl3 sÏ k×m h·m t¸c dông cña pectinesteraza. COOH COOCH3 34 Polygalacturonaza Polygalacturonaza cã tªn hÖ thèng lµ poly-α 1,4 galacturonitglucanohydrolaza (m· sè EC:3.2.1.15). Lµ c¸c enzym xóc t¸c sù thuû ph©n liªn kÕt 1-4 glucozit trong ph©n tö pectin [28]. Polygalacturonaza Ýt gÆp trong c©y, Polygalacturonaza chñ yÕu cã ë c¸c vi sinh vËt, ®Æc biÖt ë nÊm mèc vµ vi khuÈn, th−êng cã träng l−îng ph©n tö kho¶ng 65kDa. Polygalacturonaza lµ mét phøc hÖ enzym gåm nhiÒu cÊu tö vµ th−êng cã tÝnh ®Æc hiÖu ®èi víi c¬ chÊt. C¸c s¶n phÈm trung gian cña qu¸ tr×nh thuû ph©n pectin Polygalacturonaza chñ yÕu bÒn v÷ng ë trong vïng pH tõ 4,0-6.0. NhiÖt ®é tèi −u cña ®a sè Polygalacturonaza n»m trong kho¶n 40 –45oC. ë trong kho¶ng nhiÖt ®é ®ã chóng th−êng bÒn v÷ng, nh−ng sÏ bÞ v« ho¹t khi nhiÖt ®é lµ 50 ®Õn kho¶ng 55-60oC. Dùa vµo tÝnh ®Æc hiÖu vµ c¬ chÕ t¸c trªn c¬ chÊt H.Deuel vµ E. Stutz (1958) ®· chia bèn kiÓu Polygalacturonaza. Polygalacturonaza Tªn gäi hÖ thèng polyα 1,4 galacturonic metylesteglucanohydrolaza. Polymetyl galacturonaza lµ enzym t¸c song lªn axit polygalacturonic ®· ®−îc metoxy ho¸ (tøc pectin). C¸c enzym nµy ®−îc chia thµnh 2 nhãm nhá tuú theo vÞ trÝ liªn kÕt glucozit bÞ c¾t ®øt d−íi sù xóc t¸c cña enzym ë ®Çu m¹ch hay gi÷a m¹ch nh−: Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I. Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I cßn gäi lµ enzym polygalacturonaza dÞch ho¸. §©y lµ enzym xóc t¸c sù thuû ph©n c¸c liªn kÕt α -1,4 glucozit néi m¹ch cña c¸c ph©n tö axit polygalactrunic ®−îc este ho¸ ë møc ®é cao. Ho¹t tÝnh cña enzym nµy bÞ gi¶m khi cã mÆt cña enzym pectinesteraza trong m«i tr−êng. Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I rÊt phæ biÕn ë trong c¸c vi sinh vËt, ®Æc biÖt lµ ë nÊm mèc A. niger, Botrylis cinerea, A awamori. COOH COOCH3 COOCH3 35 S¬ ®å t¸c dông cña Endo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza I lîp chÊt pectin +Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III. Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III cßn lµ enzym polygalacturonaza ®−êng ho¸. §©y lµ enzym xóc t¸c sù thuû ph©n c¸c kiªn kÕt α 1,4- glucozit ë ®Çu m¹ch ®Ó t¸ch dÇn dÇn tong gèc axit galacturonic ra khái ph©n tö pectin hay axit pectinic, b¾t ®µu tõ ®Çu kh«ng khö. Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III cã ¸I lôc víi gèc axit galacturonic ®· metyl ho¸, nghÜa lµ ph©n c¾t c¸c liªn kÕt α1,4- ë ®Çu m¹ch n»m gi÷a 2 gèc axit galacturonic cã nhãm –COOCH3. S¬ ®å t¸c dông cña Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza III lªn hîp chÊt pectin Polygalacturonaza: Lµ enzym t¸c dông chñ yÕu lªn c¸c axit pectic vµ axit pectinic. §èi víi nhãm enzym nµy sù cã mÆt cña pectinesteraza cã t¸c dông thóc ®Èy sù xóc t¸c t¸c cña chóng. C¸c enzym nµy còng ®−îc chia thµnh 2 nhãm nhê trong vÞ trÝ liªn kÕt glucozit bÞ c¾t ®øt. + Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II Lµ enzym polygalacturonaza dÞch ho¸. Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II. Thuû ph©n liªn kÕt α1,4-glucozit ë gi÷a m¹ch cña c¸c ph©n tö axit pectic hay axit pectinic, c¸c enzym nµy chØ t¸c dông khi cã mÆt nhãm –COOH tù do. VÞ trÝ ®øt m¹ch cña c¬ chÊt ®−îc xö lý s¬ bé b»ng pectinesteraza. §a sè nÊm mèc vµ vi khuÈn lµ nh÷ng vi sinh vËt tæng hîp ®−îc enzym nµy. S¬ ®å t¸c dông cña Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza II lªn hîp chÊt pectin Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza IV. COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOH COOCH3 COOCH3 36 Enzym nµy xóc t¸c sù thuû ph©n c¸c liªn kÕt glucozit ë ®Çu m¹ch cña ph©n tö axit pectic hoÆc axit pectinic. Enzym nµy cã ¸I lùu víi c¸c liªn kÕt glucâit ë ®Çu m¹ch gÇn víi nhãm cacboxyl tù do. S¬ ®å t¸c dông Exo-glucozidaza- polymetyl galacturonaza IV lªn hîp chÊt pectin Transeliminaza Nhãm enzym Transeliminaza xóc t¸c ph©n c¾t phi thuû ph©n c¸c liªn kÕt α1,4- glucozit cña c¸c hîp chÊt pectin, ®ång thêi t¹o ra nèi ®«i ë trong gèc axit galacturonic gi÷a nguyªn tö cacbon thø 4 vµ thø 5 (4- dezoxy-5-xetogalacturonic). Khi ®øt liªn kÕt α- 1,4 bëi Transeliminaza th× hydro tõ nguyªn tö cacbon thø 5 cña gèc axit galacturonic nµy ®−îc chuyÓn ®Õn nguyªn tö cacbon thø 1 cña gèc axit galacturonic kh¸c. Ph¶i øng x¶y ra dÔ dµng trong m«i tr−êng trung tÝnh hoÆc kiÒm yÕu. Transeliminaza t¸c dông ®−îc trªn pectin còng nh− trªn axit pectic, enzym nµy cã tÝnh ®Æc hiÖu cao. Dùa vµo c¬ chÕ t¸c dông vµ tÝnh ®Æc hiÖu ®ã ng−êi ph©n ra thµnh c¸c Transeliminaza sau: + pectin- Transeliminaza: lµ nh÷ng enzym t¸c dông trªn ph©n tö pectin vµ axit pectinic. C¸c enzym nµy cã tªn hÖ thèng lµ poly-α 1,4 galacturonic metyleste glucanoliaza. C¸c enzym cã hai lo¹i: Endo-pectintranseliminaza I Exo- pectintranseliminaza III Polyglacturonat- Transeliminaza: lµ nh÷ng enzym t¸c dông trªn axit pectinic vµ axit pectic. Nh÷ng enzym nµy cã tªn hÖ thèng lµ poly-α 1,4 D-galacturonic-glucanoliaza. C¸c enzym nµy cã hai lo¹i: Endo- polyglacturonat- Transeliminaza II Exo- polyglacturonat- Transeliminaza IV COOH COOCH COOCH3 COOH COOH COOCH3 37 Transeliminaza tõ nh÷ng nguån kh¸c nhau th× cã c¬ chÕ t¸c dông vµ c¸c thuéc tÝnh kh¸c nhau. Transeliminaza tõ nÊm mèc ho¹t ®éng tèi −u ë pH=5,2. Tr¸i l¹i, Transeliminaza tõ vi khuÈn ho¹t ®éng tèi −u ë pH tõ 7,0-8,5. Nguån nguyªn liÖu ®Ó thu nhËn enzym pectinaza Pectinaza cã thÓ ®−îc sinh tæng hîp tõ nÊm mèc, vi khuÈn vµ nÊm men. PhÇn lín c¸c chñng vi sinh vËt dïng ®Ó s¶n s¶n xuÊt enzym pectinaza ®Òu lµ vi sinh vËt hiÕu khÝ. Tuy nhiªn ng−êi ta còng ®· t×m ®−îc nh÷ng vi sinh vËt vèn lµ yÕm khÝ b¾t buéc nh−ung l¹i cã kh¶n n¨ng sinh tæng hîp enzym pectinaza. Trong sè c¸c vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng tæng hîp enzym pectinaza th× nÊm mèc cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp cao nhÊt. C¸c chñng Aspergillus, ®Æc biÖt lµ Aspergillus niger, A. awamori ®· ®−îc øng dông nhiÒu trong s¶n xuÊt. Pectinaza cã thÓ thu nhËn ®−îc tõ nÊm mèc b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy bÒ mÆt hoÆc nu«i cÊy ch×m sôc khÝ. Tuy nhiªn dï nu«i cÊy trªn m«i tr−êng láng hay ®Æc th× ngoµi c¸c thµnh phÇn dinh d−ìng chñ yÕu nh− cacbon, nit¬, phospho... th× chÊt c¶m øng pectin lµ mét thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong m«i tr−êng ®Ó nÊm mèc tæng hîp ®Þnh h−íng pectinaza víi sè l−îng vµ ho¹t ®é lín. Theo t¸c gi¶ Antier P vµ céng sù ®¨ng trªn t¹p chÝ Biotechnol Adv. 1993;11(3): 429-40 chóng ta cã thÓ sö dông nguån nguyªn liÖu cã ®é Èm thÊp nh− thÞt qu¶ cµ phª ®Ó lªn men s¶n xuÊt pectinaza trªn hÖ thèng lªn men r¾n nh−ng ph¶i c¶i thiÖn chñng A. niger thÝch øng víi m«i tr−êng lªn men ®Ó cho ho¹t lùc cao. TÇm quan träng ®Æc biÖt lµ dùa trªn viÖc sö dông 2 hîp chÊt kh¸ng trao ®æi chÊt: 2- deoxy-glucose (DG) vµ 2,4-dinitro-phenol kÕt hîp víi ethylen glycol ®Ó tuyÓn chän chñng kháe chÞu ®−îc møc ®é xö lý bµo tö b»ng tia UV. C¸c d¹ng ®ét biÕn nh¹y c¶m víi DG l¹i lµm t¨ng hµm l−îng pectinasa. §©y lµ mét nh©n tè quan träng cã ý nghÜa trong viÖc tuyÓn chän chñng phï hîp víi hÖ thång lªn men r¾n víi nguån nguyªn liÖu cã ®é Èm thÊp nh− thÞt qu¶ cµ phª. TÝnh chÊt cña pectinaza tõ Aspergillus niger Pectinaza ®−îc s¶n xuÊt tõ nÊm mèc Apergillus niger lµ mét chÕ phÈm enzym th−¬ng m¹i. DÞch enzym th« sau khi t¸ch chiÕt b»ng kÕt tña (NH4)SO4 vµ tinh chÕ b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký cét sÏ thu ®−îc enzym ®ång nhÊt. ChÕ phÈm enzm nµy ho¹t ®éng ë 38 pH tèi −u lµ 5.0, nhiÖt ®é tèi thÝch lµ 36oC, æn ®Þnh d−íi 35oC, KÕt qu¶ ph©n tÝch tr×nh tù axit amin cho thÊy cã 19 lo¹i axit amin trong ph©n tö enzym endo- polygalacturonaza. Träng l−îng ph©n tö cña enzym nµy kho¶ng 40,4 kDa. §©y lµ enzym dÞch ho¸, xóc t¸c sù thuû ph©n c¸c liªn kÕt α1,4- glucozit néi m¹ch cña c¸c ph©n tö axit polygalacturonic. Theo t¸c gi¶ Diaz-Godinez G vµ céng sù ®¨ng trªn J Ind Microbiol Biotechnol. 2001 May;26(5):271-5 viÖc s¶n xuÊt exopectinaza b»ng chñng A. niger ®−îc so s¸nh trong hai hÖ thång lªn men ch×m vµ r¾n. ViÖc thªm sacharoza vµo hÖ thèng lªn men ch×m th× l¹i øc chÕ qu¸ tr×nh sinh tæng hîp pectinaza. Nh− vËy s¶n l−îng pectinaza lµ kh«ng ®¸ng kÓ khi lªn men ch×m cã bæ sung sacharoza. Trong khi ®ã ë hÖ thèng lªn men r¾n víi ®é Èm cao, s¶n l−îng exopectinasa ®¹t ë møc ®é cao khi sö dông sacharoza ®iÒu nµy t−¬ng ®−¬ng víi viÖc t¹o ra nhiÒu sinh khèi vµ kh«ng cã sù øc chÕ qu¸ tr×nh sinh tæng hîp pectinaza. øng dông cña enzym pectinaza Trong hÇu hÕt c¸c chÕ phÈm pectinaza ®Òu gåm c¸c phøc hÖ enzym gièng nhau. C¸c chÕ phÈm nµy chØ kh¸c nhau ë møc ®é ho¹t ®éng tû lÖ c¸c enzym. ChÝnh v× ®iÒu nµy mµ ng−êi ta sÏ cã h−íng sö dông c¸c chÕ phÈm kh¸c nhau tuú theo môc ®Ých c«ng nghÖ vµ tÝnh chÊt cña lo¹i pectin. C¸c enzym cã mÆt trong chÕ phÈm pectinaza phô thuéc vai trß cña chóng trong qu¸ tr×nh c«ng nghÖ mµ ®−îc chia thµnh c¸c nhãm: - Enzym quyÕt ®Þnh hiÖu qu¶ t¸c dông cña chÕ phÈm. - Enzym cã mÆt trong chÕ phÈm còng tèt nh−ng kh«ng b¾t buéc. - Enzym kh«ng cÇn thiÕt nh−ng cã thÓ cho phÐp cã mÆt mét l−îng kh«ng ®¸ng kÓ trong chÕ phÈm. V× vËy ®èi víi mçi qu¸ tr×nh c«ng nghÖ cã thÓ sö dông c¸c nhãm enzym pectinaza kh¸c nhau. T¸c gi¶ Kashyap DR ®· cã bµi viÕt vÒ øng dông cña pectinaza trong lÜnh vùc th−¬ng m¹i ®¨ng trªn t¹p chÝ Bioresour Technol. 2001 May;77 (3):215-27. T¸c gi¶ ®· chØ 39 ra nh÷ng øng dông cña enzym nµy trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn n−íc qu¶, dÖt sîi, s¶n xuÊt giÊy, lªn men thÞt qu¶ cµ phª, chiÕt tinh dÇu vµ xö lý n−íc th¶i. Theo c«ng bè míi ®©y trªn t¹p chÝ Bioresour Technol. 2004 Oct;95 (1):49-52 cña t¸c gi¶ Bai ZH vµ céng sù ®É ®Ò cËp ®Õn mét øng dông rÊt míi cña enzym pectinaza. Sö dông dÞch chiÕt cña enzym nµy trong xö lý n−íc th¶i vµ kh¸ng bÖnh ë thùc vËt cho c©y khoai t©y non vµ d−a chuét. Cñ c¶i ®−êng ®−îc sö dông nh− nguån cacbon vµ n−íc th¶i tõ viÖc s¶n xuÊt glutamate ®−îc sö dông lµm nguån N vµ H2O cho qu¸ tr×nh lªn men sinh tæng hîp pectinaza b»ng chñng A. niger. øng dông pectinaza trong c«ng nghÖ s¶n xuÊt c¸c chÕ phÈm tõ qu¶ Pectinaza th−êng ®−îc sö dông trong c¸c ngµnh c«ng nghiÖp thùc phÈm sau: - S¶n xuÊt r−îu vang - S¶n xuÊt c¸c mÆt hµng tõ qu¶: n−íc qu¶ c« ®Æc, møt nhõ, møt ®«ng. - S¶n xuÊt n−íc qu¶ vµ ®å uèng kh«ng cån - S¶n xuÊt n−íc gi¶i kh¸t - S¶n xuÊt cµ phª vµ cµ phª hoµ tan Trong s¶n xuÊt r−îu, viÖc dïng pectinaza kh«ng nh÷ng cho phÐp t¨ng hiÖu suÊt thu håi n−íc qu¶, tèc ®é läc. Qu¸ tr×nh s¶n xuÊt rót ng¾n mµ r−îu thµnh phÈm cßn cã mïi th¬m h¬n, trong vµ ¸nh h¬n [67]. Víi s¶n xuÊt n−íc qu¶ ng©m r−îu, nhê sö dông pectinaza mµ thêi gian l¾ng cã thÓ gi¶m 10-12 ngµy, hiÖu suÊt t¨ng 10-15%, hao phÝ r−îu gi¶m tõ 7% xuèng 2,5%. Ngoµi c¸c ngµnh nãi trªn, pectinaza cßn ®−îc dïng trong viÖc s¶n xuÊt c¸c gel kh¸c nhau tõ qu¶, cµ phª ®Æc hoÆc pectin cã hµm l−îng metoxy thÊp. øng dông pectinaza trong ch¨n nu«i. KhÈu phÇn thøc ¨n cña ®éng vËt th−êng cã hµm l−îng pectin, xenluloza vµ hemixenlulaza cao. Trong khi ®ã ®éng vËt l¹i chØ cã kh¶ n¨ng tæng hîp rÊt h¹n chÕ c¸c enzym cacbonhydrolaza ph©n gi¶i ®−îc tinh bét vµ disaccarit. Trong dÞch tiªu ho¸ ®éng vËt còng kh«ng cã hemixenlulaza ph©n gi¶i xilan, pectinaza ph©n gi¶i pectin, ligninaza ph©n gi¶I lignin vµ c¸c hîp chÊt phøc t¹p kh¸c. §Ó gióp cho ®éng vËt sö dông triÖt ®Ó thøc 40 ¨n, ng−êi ta thªm vµo khÈu phÇn cña chóng liÒu l−îng thÝch hîp c¸c chÕ phÈm enzym nguån gèc vi sinh vËt cã ho¹t tÝnh pectinaza cao cïng víi xenlulaza vµ hemixenlulaza. øng dông pectinaza trong ngµnh c«ng nghiÖp b«ng sîi Th«ng qua viÖc sö dông enzym lµm ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn qu¸ tr×nh c«ng nghiÖp dÖt c¶ vÒ m«i tr−êng vµ chÊt l−îng s¶n phÈm. Tr−íc khi sîi ®−îc m¾c vµo khung ®Ó dÖt thµnh v¶I nã sÏ ®−îc b«i mét líp t¸c nh©n lµm tr¬n ®Ó chèng x¬ x−íc trong qu¸ tr×nh dÖt. Tr−íc ®©y, c¸c t¸c nh©n nµy (t¸c nh©n lµm tr¬n sîi) th−êng ®−îc sö dông lµ tinh bét bëi v× nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra líp mµng máng rÊt tèt mµ l¹i cã gi¸ thµnh rÎ. Tr−íc khi v¶i ®−îc ®em ®i nhuém th× viÖc lo¹i bá nh÷ng t¸c nh©n kh«ng ph¶i lµ xenluloza lµ viÖc b¾t buéc ph¶i lµm. Tr−íc khi t×m ra amylaza, ng−êi ta chØ cã con ®−êng duy nhÊt ®Ó lo¹i bá c¸c chÊt nµy lµ sö dông dung dÞch x«®a nãng. Xö lý ho¸ häc kh«ng cã hiÖu qu¶ cao trong viÖc lo¹i bá tinh bét (chóng ¶nh h−ëng tíi sù b¾t mµu than ch×) vµ tÊt nhiªn kÕt qu¶ lµ ë mét sè sîi v¶i bÞ mÊt ®i tÝnh xèp tù nhiªn cña sîi v¶i. ViÖc sö dông pectinaza kÕt hîp víi amylaza, xenlulaza hay c¸c enzym hemixenlulaza kh¸c sÏ lo¹i bá c¸c t¸c nh©n trªn mét c¸ch hiÖu qu¶ vµ lµm gi¶m ®¸ng kÓ viÖc sö dông chÊt ho¸ häc trong c«ng nghiÖp dÖt. KÕt qu¶ lµ lµm gi¶m l−îng n−íc th¶i vµo m«i tr−êng, gi¶m c«ng lao ®éng vµ t¨ng chÊt l−îng s¶n phÈm. Trong sîi cotton cã c¸c thµnh phÇn kh«ng mong muèn nh− chÊt bÐo, s¸p, protein, chÊt mµu tù nhiªn. C¸c chÊt nµy lµm gi¶m m¹nh sù hÊp thô n−íc cña sîi lµm gi¶m ®« tr¾ng cña sîi. Trong ®ã pectin ®ãng vai trß nh− mét lo¹i keo sinh häc, phÇn lín n−íc bao quanh muèi cña pectin liªn kÕt víi s¸p, protein t¹o ra mét mµng ch¾n b¶o vÖ sîi cotton. Mµng ch¾n nµy sÏ lµm cho sîi b¾t mµu ®ång bé nh−ng l¹i ph¶i dïng mét l−îng n−íc lín ®Ó röa, tèn n¨ng l−îng vµ c¸c chÊt th¶i ra, ®e do¹ m«i tr−êng sèng. Do vËy trong nÒn kinh tÕ míi ng−êi ta rÊt quan t©m ®Õn gi¸ thµnh vµ lµm gi¶m t¸c ®éng ®Õn m«i tr−êng. Thuû ph©n b»ng enzym pectinaza ph©n c¾t c¸c chÊt b¸m vµo lµm cho sîi ®−îc röa s¹ch b»ng n−íc mµ kh«ng lµm vì hÖ sîi xenlulo. Qu¸ tr×nh nµy gäi lµ “con ®−êng sinh häc”. Con ®−êng sinh häc lµ mét con ®−êng míi dùa trªn lo¹i bá c¸c chÊt bÈn b»ng c¸ch sö dông c¸c enzym. VÝ dô nh− pectinaza c¾t c¸c liªn kÕt pectin, proteaza ph©n c¾t protein. Mét sè chÊt mµu còng ®−îc gi¶i phãng ra trong qu¸ tr×nh nµy lµ 41 tèn Ýt n¨ng l−îng vµ Ýt g©y « nhiÔm m«i tr−êng. Enzym trªn kh«ng lµm ¶nh h−ëng ®Õn søc bÒn cña sîi do hÖ sîi kh«ng bÞ ph¸ vì. Pectinaza sö dông trong con ®−êng sinh häc dùa trªn sù lùa chän vÒ pH, nhiÖt ®é, nhu cÇu n¨ng l−îng vµ thêi gian xö lý. øng dông trong lªn men chÌ vµ cµ phª Sö dông enzym pectinaza trong qu¸ tr×nh chÕ biÕn chÌ sÏ lµm t¨ng tèc ®é lªn men cña chÌ vµ pectinaza còng lµm ph¸ bät trong bét chÌ v× nã cã kh¶ n¨ng ph©n huû pectin. Trong s¶n xuÊt cµ phª, ng−êi ta dïng pectinaza ®Ó t¸ch líp keo trªn bÒ mÆt cña h¹t cµphª. Tr−íc ®©y ng−êi ta dïng ngay vi sinh vËt ®Ó lµm c«ng viÖc nµy, nh−ng th−êng qu¸ tr×nh x¶y ra kh«ng ®ång ®Ò vµ khã kiÓm tra. HiÖn nay ng−êi ta th−êng dïng c¸c chÕ phÈm pectinaza ®Ó c¶i thiÖn chÊt l−îng cµ phª. Mét sè ®Æc ®iÓm cña nÊm mèc Aspergillus niger Apergillus niger ®−îc cho lµ loµi vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp pectinaza tèt. Apergillus niger lµ nÊm mèc cã d¹ng b×nh t−íi hoÆc hoa cóc, cã c¸c tÕ bµo ch©n, cã phÇn cuèi phång lªn thµnh mét bäng, trªn bäng mäc c¸c thÓ b×nh. Trªn thÓ b×nh lµ c¸c chuèi bµo tö. Tuy nhiªn, c¸c loµi kh¸c nhau thuéc chi nµy còng cã nh÷ng ®Æc ®iÓm kh¸c nhau. Loµi Apergillus niger cã nh÷ng ®Æc ®iÓm riªng biÖt sau: Apergillus niger ph¸t triÓn trªn m«i tr−êng Czapek, khi quan s¸t b»ng m¾t th−êng cã mµu ®en nh¸nh. Chóng ph¸t triÓn chËm h¬n mét sè loµi kh¸c cïng chi trªn m«i tr−êng nµy. §−êng kÝnh ®¹t ®−îc sau 10-14 ngµy nu«i cÊy ë nhiÖt ®é phßng (24-260 C) lµ 2,5-3 cm, sîi nÊm mäc rÊt khÝt. Cuèng nang th¼ng ®øng, dµi 1,5-3mm, ®−êng kÝnh 15-20µm. Bäng cã h×nh gÇn nh− h×nh cÇu, ®−êng kÝnh 45-75µm. Chóng cã hai hµng thÓ b×nh. ThÓ b×nh cã hai lo¹i tuú thuéc vµo loµi vµ ®é tuæi cña mò bµo tö. Bµo tö tr−ëng thµnh cã h×nh cÇu, ®−êng kÝnh 4-5µm, xï x×, kh«ng ®Òu nhau, cã gai nhá, kh«ng s¾p xÕp ®Òu ®Æn. Mò bµo tö ph¸t t¸n cã ®−êng kÝnh 700-800µm. S¶n xuÊt pectinaza tõ thÞt qu¶ cµ phª. 42 Theo Ulloa S [ Biological treatment of coffee pulp, Doctor thesis, 2002 ] thÞt qu¶ cµ phª chøa 6 % pectin, ®©y lµ nguån c¬ chÊt to lín cho s¶n xuÊt pectinaza. Boccas, F., Rousos ®· nghiªn cøu s¶n xuÊt pectinaza tõ thÞt qu¶ cµ phª trªn hÖ thèng lªn men r¾n. [ J. Food Sci. Techol. 31: 22-27 ][67]. ë n−íc ta tõ tr−íc ®©y ®· cã mét sè c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ pectinaza tõ vá b−ëi, vá chanh. Tuy nhiªn ch−a cã nghiªn cøu nµo vÒ s¶n xuÊt pectinaza tõ thÞt qu¶ cµ phª. 3.1.5. Tæng quan vÒ mannanaza Mannanase (EC 3.2.1.78) (hay cßn gäi lµ endo-β-1,4- mannanase; 1,4-β-D- mannan-mannanohydrolase) xóc t¸c thuû ph©n liªn kÕt β-1,4-mannosit cña β-1,4-mannan, glucomannan vµ galactomannan, chuyÓn c¸c polyme dÞ thÓ kh¸ phæ biÕn trong tù nhiªn nµy thµnh c¸c mannooligosacharit (MOS) vµ mét l−îng nhá mannose. Mannanase ®−îc øng dông trong nhiÒu ngµnh c«ng nghiÖp kh¸c nhau (giÊy, dÇu khÝ, thùc phÈm, ch¨n nu«i vµ d−îc phÈm...). Trong ®ã øng dông endo-beta-1,4 - mannanase trong s¶n xuÊt mannooligosaccharit (MOS) tõ c¸c phÕ phô phÈm n«ng nghiÖp nh− b· dõa hoÆc konjac ®ang lµ mét trong nh÷ng mèi quan t©m cña c¸c nhµ khoa häc nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi. C¸c mannooligosaccharit ®· ®−îc chøng minh lµ lo¹i prebiotic tèt cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch sù ph¸t triÓn cña c¸c vi sinh vËt cã lîi trong hÖ tiªu ho¸. H¬n h¼n c¸c prebiotic kh¸c, MOS cßn cã kh¶ n¨ng hÊp phô, øc chÕ trùc tiÕp c¸c vi sinh vËt g©y bÖnh ®−êng ruét (Salmonella typhimurium vµ E. Coli), ®ång thêi cßn cã t¸c dông kÝch thÝch hÖ miÔn dÞch cña c¬ thÓ. C¸c enzym ph©n c¾t mannan vµ c¬ chÕ t¸c dông cña mannanase Ph©n hñy sinh häc mannan lµ sù kÕt hîp ho¹t ®éng cña nhiÒu lo¹i enzym trong ®ã mannanase thùc hiÖn nhiÖm vô ph©n c¾t m¹ch chÝnh mannan thµnh c¸c mannobiose, mannotriose vµ hçn hîp c¸c oligosaccarid. C¸c s¶n phÈm nµy sau ®ã l¹i ®−îc ph©n c¾t bëi β-D-mannosidase, β-D-glucosidase vµ acetylesterase. β-mannosidase (β-D-mannosid mannohydrolase, EC 3.2.1.25) thñy ph©n mannan, mannan dÞ thÓ vµ mannooligosaccarit gi¶i phãng β-D-mannose b¾t ®Çu tõ ®Çu kh«ng khö. 43 Mét vµi β-mannosidase thuû ph©n liªn kÕt D-Manp-1,4-β-D-Glup trong m¹ch glucomannan. β-mannosidase cña Tremella fuciformis cã ho¹t lùc lín nhÊt ®èi víi mannobiose vµ vËn tèc thuû ph©n mannooligosaccarid cña enzym nµy gi¶m khi chiÒu dµi m¹ch c¬ chÊt t¨ng. β-mannosidase cña Aspergillus niger chØ xóc t¸c ph©n c¾t mannobiose vµ mannotriose, kh«ng cã t¸c dông ®èi víi mannan. β-mannosidase cña Bacillus sp. cã ho¹t lùc cao nhÊt khi xóc t¸c thuû ph©n mannotetraose. β-glucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC 3.2.1.21) ph©n c¾t liªn kÕt β-D- glucozit cña cellobiose vµ cellooligosaccarit b¾t ®Çu tõ ®Çu kh«ng khö gi¶i phãng β-D- glucose. Trong nhiÒu tr−êng hîp, oligosaccarit chøa mannose vµ glucose (s¶n phÈm thuû ph©n b»ng β-mannanase) lµ c¬ chÊt tèt cña β-glucosidase. α-galactosidase (α-D-galactosid galactohydrolase, EC 3.2.1.22) xóc t¸c thuû ph©n liªn kÕt galactozit cã trong c¸c oligosaccarid chøa galactose còng nh− c¸c polysaccarid phøc t¹p kh¸c: galactomannan hay galactoglucomannan. Kh¶ n¨ng thñy ph©n gi¶i phãng galactose tõ oligosaccarid kh¸c nhau phô thuéc nguån gèc α-galactosidase. Khi chiÒu dµi m¹ch polysaccarit t¨ng, kh¶ n¨ng thuû ph©n cña α-galactosidase tõ Penicillium simplicissimum gi¶m trong khi α-galactosidase tõ A. niger t¨ng. α-galactosidase III cña A. niger cã kh¶ n¨ng thuû ph©n t¸ch galactose tõ galactomannobiose vµ galactomannan trong khi ®ã α-galactosidase I vµ II cña nÊm mèc nµy kh«ng cã kh¶ n¨ng thuû ph©n bÊt kú galactomannan nµo. Acetylesterase (acetylgalactoglucomannanesterase) thuû ph©n liªn kÕt ester gi¶i phãng axit acetic tõ acetyl galactoglucomannan. Acetylesterase cña Trichoderma reesei xóc t¸c thuû ph©n gi¶i phãng axit acetic tõ c¸c oligosaccarid ng¾n hoÆc tõ galactoglucomannan nÕu nã ®−îc sö dông kÕt hîp víi β-mannanase. Acetylesterase sinh tæng hîp bëi A. oryzae xóc t¸c thuû ph©n polysaccarid vµ ho¹t ®éng cña nã bÞ k×m h·m bëi sù cã mÆt cña mannanase. TÝnh ®Æc hiÖu cña acetylesterase ®èi víi acetyl mannan cao gÊp 10 lÇn ®èi víi acetyl xylan. 44 Mannanse (endo-β-mannanase; β-1,4-mannan mannohydrolase, EC 3.2.1.78) ph©n c¾t liªn kÕt β-1,4-mannosid trong m¹ch mannan thµnh mannobiose, mannotriose vµ hçn hîp c¸c oligosaccarit [7]. C¬ chÕ t¸c dông cña mannanase ®−îc minh ho¹ trªn h×nh 2 H×nh 3: C¬ chÕ t¸c dông cña mannanase CÊu t¹o mannanse Mannanase cña vi khuÈn −a nhiÖt Thermotoga neapolitana 5068 lµ enzym mét cÊu tö. Mannanase cña vi khuÈn Pseudomonas cellulose bao gåm 385 axit amin. CÊu tróc kh«ng gian cña mannanase ®−îc chia thµnh 3 vïng : vïng A tõ prolin 44 ®Õn isoleucin 323, vïng B tõ Leucin 32 ®Õn Tryptophan 360 vµ vïng C tõ Threonin 392 ®Õn Threonin 419. C¸c chuçi Arg 39-Lys 43, Arg 324 – Gly 331, Arg 361-Thr 391 vµ Leu 420-Lys 423 cã chøc n¨ng nèi c¸c vïng trªn víi nhau. Toµn bé ph©n tö mannanse cÊu t¹o bëi 8 chuçi xo¾n α vµ 8 chuçi β (h×nh 7A). H×nh 4 : CÊu tróc kh«ng gian (A) vµ t©m ho¹t ®éng (B) cña mannanase 26A Pseudomonas cellulose A B HO O H H HO HO H H H O HO O H H HO HO H HH O O O H H HO HO H HH O HO O H H HO HO H H H OH O H O OH H HO H OH H H OH H O OH H HO H OH H H OH Endo-beta-mannanase 45 Mannanse cña Tricoderma reesei bao gåm 344 axit amin t¹o thµnh 16 chuçi β vµ 14 chuçi α ng¾n víi 4 cÇu disulfit: Cys26 vµ Cys29 n»m trªn chuçi xo¾n α1, Cys172 vµ Cys175 n»m däc theo cuén xo¾n β10-α7, Cys265 vµ Cys272 nèi α11 vµ cuén xo¾n α11- β13, Cys 284 vµ Cys 334 nèi α12 vµ α13. T©m ho¹t ®éng cña mannanase tõ Tricoderma reesei n»m trong mét hèc cña ph©n tö enzym vµ enzym cã Ýt nhÊt n¨m miÒn tiÕp xóc víi c¬ chÊt, mçi miÒn sÏ g¾n víi mét ®¬n vÞ monomer cña chuçi polysaccaritd trong qu¸ tr×nh xóc t¸c ph¶n øng. Glu169 vµ Glu 276 n¾m trªn r·nh däc theo bÒ mÆt enzym cã vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh xóc t¸c. T©m ho¹t ®éng cña mannanase 26A Pseudomonas cellulose ®−îc h×nh thµnh tõ sù kÕt hîp cña c¸c nhãm chøc cña c¸c axit amin n»m ë c¸c chuçi β lµ β4, β5, β7 vµ β8 ( h×nh 3B). §ã lµ Glu-212 vµ Glu-320 lÇn l−ît ë cuèi chuçi β4 vµ cuçi chuçi β7, His-211 vµ Arg- 208 trªn chuçi β4, Asp-283,Tyr- 285 trªn chuçi β5 vµ Trp-360 trªn chuçi β8. C¸c axit amin nµy liªn kÕt víi nhau theo liªn kÕt hydro. Glutamic 212 liªn kÕt víi aspartic 283 qua c¸c nhãm caboxyl. Nhãm cacboxyl cña glutamic 320 liªn kÕt víi vßng imidazol cña histidine 211 bëi liªn kÕt hydro. Glutamic 320 liªn kÕt víi nhãm hydroxyl cña tyrosine 285, vµ nhãm amin cña Arginine 208. Tryptophan 360 cïng liªn kÕt víi glutamic 320. C¸c tÝnh chÊt cña mannanse Mannanase cã nguån gèc kh¸c nhau cã ®Æc tÝnh kh¸c nhau. §Æc tÝnh cña mét sè loµi nÊm mèc ®−îc tãm l−îc trong b¶ng 1. Nh×n chung, mannanase cã pH tèi −u t¹i vïng axit yÕu hoÆc trung tÝnh. NhiÖt ®é tèi −u kh¸ cao, ®é bÒn nhiÖt tèt. Kh¶ n¨ng thuû ph©n cña mannanase lªn c¸c c¬ chÊt kh¸c nhau lµ kh¸c nhau, phô thuéc thµnh phÇn galactose trong ph©n tö. Mannanase thuû ph©n tèt LBG, galactomannan chØ chøa mét l−îng nhá galactose trong ph©n tö. Guargum, galactomannan cã tû lÖ galactose cao h¬n bÞ thñy ph©n bëi mannanase víi vËn tèc chËm h¬n nhiÒu. LBG lµ c¬ chÊt tèt nhÊt cho mannanase cña S. rolfsii, tiÕp ®Õn dõa (mannan) (58% so víi LBG), guar gum (44%) vµ Konjac mannan (22%); trong khi ho¹t tÝnh thuû ph©n α-mannan (nÊm men), xylan vµ CMC chØ xÊp xØ 1% so víi LBG. Møc ®é thñy ph©n cá linh l¨ng (48% galactose), guargum (38% galactose), bét trøng c¸ ®èi (28% galactose) vµ 46 bét carob-bét gièng s« c« la (24% galactose) bëi mannanase tõ A. niger lÇn l−ît lµ 1, 5, 20 vµ 22% . Nhãm bªn galactose cña galactomannan còng nh− nhãm acetyl lµm h¹n chÕ thuû ph©n m¹ch chÝnh. Khi xö lý LBG vµ glucomannan konjac b»ng mannanase cña S. rolfsii, gi¸ trÞ Km lÇn l−ît lµ 1,81 g/l vµ 0,3 g/l. Së dÜ nh− vËy lµ do m¹ch bªn galactose cña LBG ng¨n c¶n sù kÕt hîp gi÷a LBG vµ mannanase, cã nghÜa lµ ¸i lùc cña LBG vµ mannanase thÊp. B¶ng 2. §Æc tÝnh cña mét sè mannanase Nguån pI Khèi l−îng ph©n tö (kDa) pHopt topt (0C) C¬ chÊt S¶n phÈm thuû ph©n Aspergillus niger - 42 3,0; 3,8 - guar gum M2,M3, MxGy Aspergillus niger 3.7 0 3.5 - cïi dõa M2,M3 Aspergillus niger 3,5 - 3,0 0 Aspergillus tamarii IP 1017- 10 - 3 4.5 - LBG M2,M3, GM2 Penecillium kloeckeri NRRL 1017 3,1-3,7 3,2-3,3 8-58 5-32 4.5-5.0 4,5-5,0 LBG M2,M3, MxGy M2,M3, MxGy Penecillium purpurogenum 618 4,1 7 5,0 bét dõa (copra) M, MxGy Tricoderma reesei RUT C30 5,4 4,6 31 3,5-4,0 3,5-4,0 cïi dõa (ivory nut) M2,M3 M2,M3 C¸c enzym bÞ k×m h·m bëi ion kim lo¹i nÆng. Mannanase sinh tæng hîp bëi Vibrio sp. chñng MA 138 bÞ k×m h·m bëi: Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Al3+, Fe3+, vµ N- bromosuccinimid [10]. Mannanase nhuyÔn thÓ Littorina brevicula bÞ k×m h·m bëi Ag+, Hg2+, Cu2+ vµ N-bromosuccinimid 1mM [116]. 47 T−¬ng tù nh− xylanase vµ cellulase, mannanase còng bÞ k×m h·m bëi s¶n phÈm chÝnh cña qu¸ tr×nh thuû ph©n. Ngay ë nång ®é 90 nM, mannotriose lµm gi¶m ho¹t lùc mannanase 50%. Mannobiose còng kh¶ n¨ng k×m h·m ho¹t ®éng cña mannanase. Nguån thu mannanase Nguån thu mannanase rÊt phong phó. Mannanase cã thÓ t×m thÊy trong h¹t cña c¸c thùc vËt trªn c¹n, trong t¶o biÓn, trong c¬ thÓ ®éng vËt kh«ng x−¬ng xèng. Tuy nhiªn, nguån thu mannanase phong phó, dåi dµo vµ ®ang ®−îc quan t©m nghiªn cøu lµ tõ c¸c vi sinh vËt. NhiÒu chung vi sinh vËt có kh¶ n¨ng sinh tæng hîp mannanase. NhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu cho cho kÕt luËn r»ng c¶ vi khuÈn, nÊm men, nÊm mèc ®Òu cã kh¶ n¨ng sinh tæng hîp mannanase. C¸c chñng vi khuÈn cã kh¶ n¨ng tæng hîp mannanase lµ : Aeromonas, Bacillus, Cellulomannan, Enterococcus, Casseliflavus, Pseudomonas, Streptomyces .. C¸c chñng nÊm mèc gåm : Aspergillus niger, A. awamori, Fomes cennosus, Penicillin, Sclerotium, Trichoderma. Chñng nÊm men : Talacromyces. Tuú thuéc vµo lo¹i vi sinh vËt (nÊm men, nÊm mèc hay vi khuÈn), ®iÒu kiÖn nu«i cÊy, thµnh phÇn m«i tr−êng mµ ho¹t lùc enzym thu ®−îc kh¸c nhau. Nh×n chung, vËn tèc sinh tæng hîp mannanase cña vi khuÈn cao h¬n cña nÊm men vµ nÊm mèc nªn thêi gian nu«i ng¾n. Tuy nhiªn, ho¹t lùc mannanase trong canh tr−êng nÊm mèc cao h¬n rÊt nhiÒu so víi canh tr−êng vi khuÈn. Bacillus subtilis 168 sinh tæng hîp mannanase víi vËn tèc 4250 U/ml/giê vµ ®¹t ho¹t lùc lín nhÊt lµ 102 U/ml t¹i giê thø 24. Sclerotium rolfsii CBS 191.92 sinh tæng hîp mannanase víi vËn tèc 3740 U/ml/giê ®¹t ho¹t lùc cao nhÊt 786 U/ml. Tuú thuéc vµo nhiÒu yÕu tè : thµnh phÇn m«i tr−êng nu«i cÊy, nhiÖt ®é, pH vµ chñng vi sinh vËt mµ ho¹t ®é mannanase thu ®−îc lµ kh¸c nhau. Nh×n chung, vËn tèc sinh tæng hîp mannanase tõ vi khuÈn cao h¬n tõ nÊm mèc (vËn tèc sinh tæng hîp mannanase cña vi khuÈn Bacillus subtilis 168 vµ nÊm mèc Sclerotium rolfsii CBS 191 – 92 t−¬ng øng lµ 4250 UI / ml vµ 3740 UI / ml.h). song ®a phÇn c¸c c«ng tr×nh nghiªn cøu ®Òu cho kÕt qu¶ lµ ho¹t ®é cña mannanase thu ®−îc tõ nÊm mèc cao h¬n rÊt nhiÒu so víi ho¹t ®é cña mannanase thu ®−îc tõ vi khuÈn ( 786 U / ml sau 8 ngµy nu«i cÊy nÊm mèc Sclerotium 48 rolfsii CBS 191 – 92 theo ph−¬ng ph¸p lªn men ch×m vµ 102 UI / ml sau 1 ngµy nu«i cÊy vi khuÈn Bacillus subtilis 168). Víi nång ®é mannanase cao trong canh tr−êng nÊm mèc sÏ t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi vµ gi¶m chi phÝ trong qu¸ tr×nh thu nhËn vµ lµm s¹ch enzym. øng dông cña mannanse Enzym thuû ph©n mannan ®−îc dïng trong c«ng nghiÖp thùc phÈm, c«ng nghiÖp s¶n xuÊt thøc ¨n gia sóc, c«ng nghiÖp d−îc, c«ng nghiÖp s¶n xuÊt giÊy vµ bét giÊy, còng nh− trong c«ng nghiÖp khai th¸c dÇu má vµ khÝ ®èt. Trong c«ng nghiÖp d−îc Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, oligosaccarid lµ mãi quan t©m rÊt lín cña c«ng nghiÖp d−îc vµ c«ng nghiÖp thùc phÈm. Oligosaccarid ®Æc biÖt lµ oligosacharid dị thÓ nh− monoologosacharid (MOS) ®ãng vai trß quan träng trong glycoprotein và glycolipid. Chóng lµ thµnh phÇn cña mµng tÕ bµo t¹i ®ã chóng ®ãng vai trß lµ c¸c thô thÓ nhËn biÕt c¸c vËt l¹ nh− virus, vi khuÈn., x©m nhËp vµo c¬ thÓ. Sö dông endomannanase tõ Pellicilium purpurogenum ph©n gi¶i b· c¬m dõa ( phÇn cßn l¹i cña dõa sau khi Ðp t¸ch chÊt bÐo ) ng−êi ta ®· thu nhËn c¸c galactosylmannooligosaccharit. Gi¸ trÞ sö dông cña dõa t¨ng, « nhiÔm m«i tr−êng do phÕ phô phÈm cña viÖc Ðp dÇu dõa ®−îc gi¶m thiÓu. Mannotriose ®−îc s¶n xuÊt hiÖu qu¶ b»ng c¸ch sö dông c¸c enzym tõ Pellicilinum sau ®ã ®−îc t¸ch bá mannobiose vµ mannose th«ng qua qu¸ tr×nh lªn men bëi nÊm men. C¸c nhµ khoa häc kh¸c ®· thu ®−îc c¸c MOS kh¸c nhau (tõ 2-9 gèc ®−êng) bao gåm 63 - α - D – galactosyl - β - D – mannotriose khi dïng mannanase A. niger thñy ph©n galactomannan Ceratonia siliqua. Trong khi dïng mannanase tõ Tyromyces palustris xö lý galactomannan cña gç mÒm thu ®−îc 62 - α - D – galactosyl - β - D – mannobiose, dïng mannanase tõ S.rolfsii lai t¹o 61 - α - D – galactosyl - β - D – mannobiose khi thñy ph©n galactomannan. Trong c«ng nghiÖp thùc phÈm Mannanase ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt cµ phª tan vµ n−íc qu¶ c¸c lo¹i. Trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt cµ phª tan, dÞch cµ phª ®−îc chiÕt tõ h¹t cµ phª bao gåm arabinogalactan, 49 mannan vµ cellulose chiÕm ®Õn 1/2 khèi l−îng chÊt kh« cña h¹t cµ phª trong ®ã mannan chiÕm ®Õn 20 ÷ 30%. PhÇn lín mannan nµy cã mÆt trong dÞch chiÕt cµ phª. Do khèi l−îng phan tö lín, mannan lµm dÞch chiÕt cµ phª rÊt nhít, g©y khã kh¨n vµ tèn n¨ng l−îng cho qu¸ tr×nh läc vµ sÊy phun. ViÖc sö dông mannanase trong s¶n xuÊt cµ phª tan lµm gi¶m ®é nhít cña dÞch chiÕt cµ phª tõ ®ã lµm gi¶m n¨ng l−îng tiªu tèn vµ h¹ gi¸ thµnh s¶n phÈm. MÆt kh¸c, s¶n phÈm thñy ph©n mannan lµ c¸c lo¹i ®−êng vµ oligosaccarid lµm t¨ng vÞ tù nhiªn cña s¶n phẩm cµ phª tan. Trªn thùc tÕ, mannanase tõ S.rolfsii ®· ®−îc sö dông ®Ó thñy ph©n dÞch chiÕt cµ phª Arabica vµ Robusta, hai gièng cµ phª ®−îc trång phæ biÕn hiÖn nay. §é nhít cña dÞch chiÕt gi¶m ®i mét nöa trong hai giê xö lý b»ng chÕ phÈm enzym th«. Cïng víi sù gi¶m ®é nhít, hµm l−îng ®−êng khö t¨ng lªn [67]. Trong c«ng nghiÖp chÕ biÕn c¸c lo¹i rau qu¶, mannanase cã tiÒm n¨ng øng dông rÊt lín nh− pectinase. Mannan lµ thµnh phÇn chñ yÕu cña thµnh tÕ qu¶ do vËy nã th−êng lµm gi¶m n¨ng xuÊt läc vµ lµm t¨ng hµm l−îng cÆn l¬ löng trong s¶n phÈm n−íc qu¶ trong. ViÖc xö lý qu¶ b»ng mannanase trong qu¸ tr×nh s¶n xuÊt mét mÆt lµm t¨ng n¨ng suÊt läc, ®¶m b¶o ®é trong cña dÞch qu¶, mÆt kh¸c lµm t¨ng hiÖu suÊt thu håi qu¶ Mannanase ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt dÇu dõa tinh khiÕt lµm t¨ng hiÖu suÊt vµ chÊt l−îng dÇu dõa. Trong khai th¸c dÇu má vµ khÝ ®èt Mét lo¹i dÞch cã ®é nhít cao th−êng ®−îc cÊp vµo ®Çu mòi khoan. DÞch nµy chøa c¸c h¹t nhá cã nhiÖm vô lÊp ®Çy c¸c kÏ nøt xuÊt hiÖn do ¸p suÊt thñy tÜnh, gi÷ cho mòi khoan kh«ng bÞ gÉy d−íi t¸c dông cña ¸p suÊt lín. C¸c chÊt cã ®é nhít cao th−êng ®−îc sö dông lµ galactomannan. §Ó dÇu vµ khÝ ®èt cã thÓ ra khái giÕng, ®é nhít nµy ph¶i ®−îc lo¹i bá hoÆc lµm gi¶m b»ng c¸ch oxy hãa hoÆc thuû ph©n b»ng enzym. DÞch cã ®é nhít thÊp nµy sau ®ã ®−îc b¬m ra tr−íc khi qu¸ tr×nh dÉn dÇu vµ khÝ ®èt b¾t ®Çu. Mannanase ®−îc sö dông ®Ó lµm gi¶m ®é nhít cña dÞch nµy. Trong xö lý m«i tr−êng vµ s¶n xuÊt thøc ¨n gia sóc C¸c phÕ phô phÈm cña c«ng nghiÖp s¶n xuÊt cµ phª, qu¶ cßn chøa rÊt nhiÒu mannan lµ nguån gèc cacbon rÊt tèt cho s¶n xuÊt mannanase th−¬ng m¹i. ë Mehico, c¸c 50 nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu qu¸ tr×nh s¶n xuÊt mannanase tõ Tricoderma reesei IMI 192656 nh»m tËn dông, biÕn 600 tÊn phÕ th¶i cµ phª cña nøíc nµy thµnh mannanase [67]. Ngoµi viÖc tËn dông b· th¶i cµ phª, c¸c nhµ khoa häc t¹i ®¹i häc Autunoma De Querôtaro s¶n xuÊt mannanase tõ Aspergillus oryzae trªn b· c¬m dõa. C¸c chÕ phÈm mannanase nµy ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt cµ phª tan vµ trong s¶n xuÊt thøc ¨n gia sóc. Mannanase ®−îc sö dông ®Ó ph©n c¾t galactomannan cã trong thµnh phÇn thøc ¨n gia sóc ®Æc biÖt nhiÒu trong c¸c c©y hä ®Ëu nh− ®Ëu t−¬ng, cá linh l¨ng, thÞt guar. ThÞt guar lµ phÕ phô phÈm cña c«ng nghiÖp s¶n xuÊt guar gum, chøa nhiÒu axit amin cÇn thiÕt cho sù ph¸t triÓn cña ®éng vËt. Tuy nhiªn, galactomannan cã trong thÞt qu¶ guar l¹i lµ t¸c nh©n ph¶n dinh d−ìng: guar gum cã trong thøc ¨n tr−¬ng në lªn trong hÖ tiªu hãa cña ®éng vËt, lµm t¨ng ®é nhít cña khèi thøc ¨n trong hÖ tiªu ho¸, do ®ã lµm gi¶m kh¶ n¨ng tiªu hãa vµ hÊp thô thøc ¨n. Theo nghiªn cøu cña c¸c nhµ ch¨n nu«i, chØ cÇn 2 –4% galactomannan cã trong thøc ¨n lµm gi¶m sù t¨ng tr−ëng cña gµ vµ lµm gi¶m hiÖu qu¶ cña viÖc sö dông thøc ¨n. ViÖc xö lý thÞt guar gum b»ng mannanase lo¹i bá t¸c dông ph¶n dinh d−ìng cña galactomannan, gióp tËn dông nguån phÕ th¶i nµy cña c«ng nghiÖp s¶n xuÊt guar gum thµnh nguån thøc ¨n cho gia sóc cã gi¸ trÞ . Mannanase ®· ®−îc s¶n xuÊt thµnh chÕ phÈm th−¬ng m¹i nh»m bæ sung vµo phÕ th¶i c«ng nghiÖp nh− vá ®Ëu t−¬ng, bét ®Ëu t−¬ng, b· c¬m dõa, thÞt qu¶ cä, thÞt qu¶ võng vµ thÞt qu¶ c¶i dÇu lµm thøc ¨n gia sóc. VÝ dô chÕ phÈm cã tªn lµ Hemicell cña ChemGen Corporation (Mü) ®−îc thªm vµo thøc ¨n gia sóc lµm t¨ng hiÖu qu¶ sù dông thøc ¨n, t¨ng l−îng s÷a ®èi víi bß, gi¶m l−îng mì trong lîn, t¨ng sè l−îng vµ chÊt l−îng trøng gµ . H·ng Enzym Development Corporation còng ®· ®−a ra thÞ tr−êng chÕ phÈm ECONASE® MANNANSE cã ho¹t ®é mannanase cao ®−îc s¶n xuÊt tõ Tricoderma longibrachiatum 3.1.6. Tæng quan vÒ bacteriocin Khái niệm về bacteriocin Từ lâu, vi khuẩn lactic được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp sản xuất axit lactic, trong việc chế biến rau quả và thức ăn gia súc. Vi khuẩn lactic và vi khuẩn gây thối cùng phát triển. Sau một thời gian vi khuẩn lactic sẽ tích lũy 51 dần axit lactic và do đó làm ngăn cản sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây thối. Dựa vào mối quan hệ đối kháng đó, các nhà khoa học tìm ra những phương pháp sinh học để bảo quản thực phẩm. Họ đã nghiên cứu các loài vi khuẩn lactic sinh bacteriocin và coi bacteriocin như một tác nhân bảo quản sinh học an toàn. Trong Patent US số 4.883, 9/2/1987 của Carlos Gonzales, người ta sử dụng một bacteriocin sản sinh từ Pediecoccus acidilactici để ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây thối như: Listeria monocytogenes….trong các thực phẩm như trứng, thịt, cá, sữa…. Bacteriocin có thể được sinh ra từ nhiều chủng vi khuẩn lactic khác nhau. Nhưng Streptococcus là giồng cho bacteriocin có hoạt lực cao nhất. Bacteriocin là do vi khuẩn lactic sinh ra có khả năng ức chế mạnh đối với các loại vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thực phẩm như E.Coli, Salmonella… Theo Stephen, A. Morse, 1979, : Bacteriocin là một nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ vi sinh vật, mang tính đặc hiệu, do vi sinh vật sản sinh ra trong môi trường và hình thành trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Những kết quả nghiên cứu về bacteriocin đều cho thấy bacteriocin là một chất bảo quản không độc hại. Năm 1969, tổ chức nông nghiệp và thực phẩm (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WTO) đã khuyến cáo sử dụng bacteriocin như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên không độc hại. Bản chất bacteriocin là những polipeptid có trọng lượng phân tử khác nhau. Bacteriocin có đặc tính kháng sinh, nhưng khác với kháng sinh là bacteriocin có tính đặc hiệu hơn và có tác dụng chọn lọc đối với một số loài hoặc khác loài nhưng có quan hệ chặt chẽ với chúng. Theo Vanglenbergh, A.P., 1993, bacteriocin là polipeptid có trọng lượng phân tử rất nhỏ, có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật có nguồn gốc phân loại gần giống với chủng sinh tổng hợp bacteriocin, có hoạt tính đặc hiệu trong loài có liên quan đến các loài vi khuẩn và sự hấp thụ vào chỗ nhận đặc hiệu trên vi khuẩn có tính nhạy cảm. Cấu tạo của bacteriocin Bacteriocin là một polipeptid mà protein này có trọng lượng phân tử rất khác nhau. Nó có chứa các gốc khác như: cacbonhydrat, phosphat, lipopolysacharit…Bacteriocin là 52 một polypeptid trong môi trường chúng có cấu trúc ngoại bào. Chúng có thể liên kết một bên với chất nhận của những vi sinh vật có thể nhận. Bacteriocin cũng có thể gắn kết chặt chẽ với một bacteriophage khi kiểm tra. Cấu trúc của bacteriocin Bacteriocin là một polipeptid được sinh tổng hợp từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau do đó chúng có cấu trúc khác nhau. Các nhà khoa học đã tìm ra được cấu trúc phân tử bacteriocin được sinh tổng hợp từ Lactococus lactic. Các bacteriocin có cấu trúc khác nhau nhưng chúng chỉ khác nhau về sự sắp xếp các axit amin. Danh pháp của bacteriocin Bacteriocin là một polipeptid do vi sinh vật tạo ra và có cấu trúc riêng cũng như nguồn gốc rất khác nhau. Vì vậy, tại Hội nghị khoa học tại Gralia (Bỉ), các nhà khoa học đã thống nhất phương pháp đặt tên sao cho tên của bacteriocin phải nói rõ nguồn gốc, bản chất hoá học và hoạt chất của chúng. Nên bacteriocin được đặt tên cụ thể dựa theo loài vi khuẩn sinh ra chúng. Ví dụ: Bacteriocin của E.Coli mang thuật ngữ là Colicins Bacteriocin của Lactobacillus plantarum mang thuật ngữ là Plantaricin Ngoài ra, một chủng vi sinh vật có thể sinh ra nhiều bacteriocin như vi khuẩn E.Coli có thể sản sinh ra 20 bacteriocin khác nhau mang tên là Colicins. Vì vậy người ta phải phân loại từ Colicins A, Colicins B…….Sự phân loại này được bắt đầu từ Hội nghị khoa học Gralia, người Bỉ báo cáo rằng chất lỏng từ một số chủng E.Coli có thể kìm hãm sự phát triển của một số chủng cùng loài. Cơ chế tác động của bacteriocin Bacteriocin tác động vào các tế bào thuộc pha sinh trưởng lũy thừa. Khi vi sinh vật trong nuôi cấy được tiếp xúc với thì chúng không thể hợp nhất được C14 leuxin vào protein và H3 thymidin vào ADN. Do đó dẫn đến sự sinh tổng hợp ADN và phân tử protein đều bị ngừng lại. Thời gian cần thiết cho sự ức chế hoàn toàn C14 và H3 vào những chất đồng vị của chúng, dựa vào nồng độ bacteriocin, dựa vào môi trường nuôi cấy. 53 Tính chất của bacteriocin Bacteriocin có phạm vi ức chế giới hạn với vi khuẩn Gram dương, Gram âm và vi khuẩn lactic. Bacteriocin có trọng lượng phân tử khoảng 16.500 Dalton và bị bất hoạt bởi hỗn hợp với proteaza, papain hoặc α- chymotrypxin và không bị tác động bởi phospholipaza, lysozym, D-Naza và R-Naza hay ở 1000C. Bacteriocin là một polipeptid được sinh tổng hợp từ các chủng vi khuẩn lactic, chúng có phổ kháng khuẩn rộng. Trong mấy năm gần đây có hơn 50 loại polipeptid của bacteriocin đã được tìm ra. Polypeptid của bacteriocin chứa 20-60 amino axit. Chúng có tính cation và rất ưa nước. Peptid của bacteriocin sản sinh từ chủng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế ở nồng độ thường, nó gây tính thấm ở màng tế bào và làm thoát ra các chất ở giữa tế bào. 3.1.7. Tæng quan vÒ øng dông c«ng nghÖ sinh häc ®Ó s¶n xuÊt thøc ¨n ch¨n nu«i tõ thÞt qu¶ cµ phª §Æc ®iÓm cña thÞt qu¶ cµ phª. Cµ phª lµ lo¹i c©y c«ng nghiÖp ®−îc trång ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi, nhÊt lµ c¸c n−íc vïng nhiÖt ®íi. Sau khi thu ho¹ch h¹t cµ phª th× thÞt qu¶ cµ phª trë thµnh nguån phÕ phô phÈm, chóng chiÕm 40% tæng khèi l−îng cña qu¶ cµ phª. §Ó xö lý nguån phÕ phô phÈm nµy ®ßi hái rÊt nhiÒu yÕu tè nh− c«ng nghÖ, kinh tÕ vµ vÊn ®Ò m«i tr−êng ThÞt qu¶ cµ phª t−¬i cã ®é Èm tõ 80-85%, ngoµi ra trong thµnh phÇn cña chóng cßn cã saccaroza, protein, pectin vµ nhiÒu chÊt dinh d−ìng kh¸c. Theo Ulloa Rojas [67] c«ng bè trong thÞt qu¶ cµ phª cã c¸c thµnh phÇn chñ yÕu sau: (%khèi l−îng) N−íc: 76,5-85%; ChÊt bÐo: 1,2-4,9%; ChÊt x¬: 12,8-27,6%; ChÊt tro: 5,0-10,5%; Pectin: 6,0-6,5%; Xenluloza: 16,5-32,2%; Lignin:12,2-20,5%; Hemixenluloza: 1,0- 11,6%; Cafein: 0,5-1,6%; Tanin: 0,64 %; Polyphenon: 1, 4 %. §©y lµ ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho vi sinh vËt ph¸t triÓn, lµ nguyªn nh©n g©y thèi r÷a thÞt qu¶ cµ phª. Trong khi ®ã ng−êi ta chØ tËp trung cho viÖc chÕ biÕn vµ b¶o qu¶n phÇn h¹t. Ngµnh c«ng nghiÖp kh«ng thÓ ®¸p øng xö lý mét khèi l−îng