Báo cáo Môn Sinh học phân tử

Môn học:Sinh học phân tử Siminar :Microarrays Thành viên nhóm: Phan Minh Tiến Nguyễn Minh Thiện Nguyễn Thị Phưởng Phan Thị Phương Thanh Đặng Thành Sang Võ Đình Trung Trừ một vài ngoại lệ thì mọi tế bào trong cơ thể đều chứa hệ gen đồng nhất và bộ nhiễm sắc thể đầy đủ.Chỉ một phần nhỏ những gen này được bật,tuy nhiên,nó biểu thị những thuộc tính đặc trưng của mỗi loại tế bào.Sự biểu hiện gen là một quá trình chặt chẽ và phức tạp cho phép tế bào trả lời những kích thích của môi trường và những nhu cầu thay đổi của chính mình.Cơ chế này đóng cả hai vai trò bật và tắt của sự chuyển đổi để kiểm soát thông tin của những gen nào được biểu hiện trong một tế bào để có thể tăng cường hoặc giảm bớt sư biểu hiện của các gen.Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. NỘI DUNG: GIỚI THIỆU LỊCH SỬ CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROARRAYS. KHÁI NIỆM VỀ MICROARRAYS. CẤU TẠO ,PHÂN LOẠI MICROARRAY. KỸ THUẬT CHẾ TẠO MICROARRAY. NGUYÊN LÝ CÁCH TIẾN HÀNH. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT MICROARRAYS TRIỂN VỌNG CỦA KỸ THUẬT MICROARRAYS I .GIỚI THIỆU LỊCH SỬ CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROARRAYS : Hình 1: lịch sử phát triển mỉcoarray Kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên phải kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy DNA có thể bị biến tính, phân tách thành hai mạch đơn khi xử lý bằng nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. Điều này gợi ra cách phân tích mối liên hệ trình tự của axit nucleic và các phương pháp phân tích dựa trên lai phân tử phát triển nhanh chóng. Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson đã tìm ra phương pháp lai in situ có sử dụng mẫu dò đánh dấu huỳnh quang, FISH. Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính (sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò) ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Với kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên vật đỡ và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu. Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể. Phương pháp tự động hoá này làm tăng tốc độ quá trình, giảm các sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí, tăng tính đồng hình của các spot mẫu. Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Người ta đánh giá rằng, kỹ thuật này có thể sẽ phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay II/.KHÁI NIỆM VỀ MICROARRAYS: Microarrays cho phép các nhà khoa học xác định được trình tự của nhiều gen trong một thí nghiệm giản đơn và hiệu quả.Các nhà khoa học sử dụng phương pháp microarrays để hiểu rõ hơn về những khía cạnh của sự sinh trưởng và phát triển đồng thời tìm hiểu sâu về những nguyên nhân di truyền học ở nhiều bệnh của con người. Nói về microarray, hiện nay đa số ai cũng liên tưởng đến DNA microarray vì kỹ thuật này đã được biết đến từ cuối thập niên 80, do nhóm khoa học dưới sự chủ trì của tiến sĩ Stephen P.A. Fodor phát minh. Sau đó được hãng Affymetrix (Mỹ) phát triển và phổ biến rộng khắp ở Mỹ và thế giới. Protein microarray mới chỉ bắt đầu được để ý trong khoảng vài năm trở lại đây và chưa phổ biến như DNA microarray. III.CẤU TẠO,PHÂN LOẠI MICROARRAY: 1.Cấu tạo: DNA microarray hay còn gọi là DNA chip, được chế tạo trên bề mặt thủy tinh hoặc nylon hoặc silicon, trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . bằng kĩ thuật tự độâng tốc độ cao, gồm vô số các probe (đoạn dò) đã biết trước trình tự. Probe để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng, có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) các chấm trên microarray thường có đường kính 200 µm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner). Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 µm. Hình 2: cấu tạo microarray 2.Phân loại Theo mật độ mẫu dò (mật độ thấp,cao ,vừa vừa.) Theo loại mẫu dò (cell array, glycan array,DNA array,protein array….) IV. KỸ THUẬT CHẾ TẠO MICROARRAY:  1.     Chế tạo mảng: Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao . Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon , trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất . Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò .  Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) . Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: (i) cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide). Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ.  - In kim (Contact-tip deposition printing): Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình 3). Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc .▲Hình 3: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing  Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch. Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2 .  - In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing): Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 4). Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao . ▲Hình 4: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing . - In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network):  µFN là kỹ thuật µCP cải tiến. Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thuỷ tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide. Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản (Hình 5). ▲Hình 5: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN. Giống như µCP, tính khả thi của µFN để sản xuất các DNA array đang được chứng minh.  - In mạ (Electro capture): Các array này giống như một con chip silicon. Giá thể ở đây là silicon có lớp bề mặt bị ôxi hoá bởi nhiệt. Ở những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực platin dày 500 nm. Sau đó tiến hành một loạt các biến đổi hoá học có thứ tự để tạo ra chip gồm nhiều lớp. Toàn bộ chip trừ phần không gian của điện cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2 mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4. Trên cùng của chip là lớp streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hoá (Hình 6). ▲Hình 6: In mạ . Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin hoá . Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 7). Hiện tại, chip với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền . ▲Hình 7: Sơ đồ chip electric silicon. (A) Sơ đồ chip có 25 điện cực platin, chiều dài mỗi cạnh 1 cm. Phần ngoại biên của chip có các điện cực platin (ô vuông màu sáng) để nối chip với nguồn điện. Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng chạy giữa điện cực ngoại biên và điện cực nhỏ hơn ở trung tâm. (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm. Vùng này chứa điện cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông. (C) Vùng điện cực.  - In quang hoạt (Photolithography): Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in situ trên giá thể rắn . Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn . nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 8). Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại những vị trí xác định trên cơ chất . Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm . - In áp điện (Piezoelectric printing); In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường . Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu phân phối (hình 9). Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2.  Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 10) . ▲Hình 8: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt .▲Hình 9: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp. ▲Hình 10: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ tục nhiều ống phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá. - In vi lỏng (µWP - Micro wet printing); Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng. Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thuỷ tinh tạo thành hệ thống kênh. Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực. Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ. Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu kỳ (hình 10). Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất. Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể. ▲Hình 10: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng . 4.NGUYÊN LÝ CỦA PHƯƠNG PHÁP MICROARRAYS: Hình 11: phương pháp phát hiện mẫu lai Gen được gắn vào lam kính hiển vi (đĩa microarray) cho biến tính để được DNA ở dạng mạch đơn .Mỗi đĩa microarray được gắn từ hàng ngàn đến hàng chục ngàn gen .Tách mRNA ở các mô,tế bào đặc thù và được đánh dấu bằng các chất có khả năng phát huỳnh quang.Tiến hành lai giữa hỗn hợp mRNA trên với các gen trên đĩa microarray. Sau phản ứng lai ,tiến hành rửa sạch các mRNA không lai ,quan sát vị trí lai nhờ sự phát hiện huỳnh quang dưới kính hiển vi huỳnh quang. Dựa vào kết quả lai sẽ phát hiện được mRNA của gen đang hoạt động và những gen ở trạng thái không hoạt động. 5.: CÁCH TIẾN HÀNH: Gắn các gen lên đĩa microaarray có phủ lớp polylisine để gắn chặt gen. Cho DNA biến tính để tách DNA thành mạh đơn. Tách mRNA ở các mẫu nghiên cúư khác nhau .Đánh dấu màu phát quang cho các mRNA .Có thể mỗi loại mRNA đánh dấu một màu riêng biệt, hoặc cùng loại mẫu theo mục đích nghiên cứu. Trộn chung các mRNA của các loại mẫu và cho tiến hành lai acid nucleic trên đĩa microarray. Phát hiện phản ứng lai nhờ phản ứng huỳnh quang và ghi lại trên phim ảnh. Sử dụng các chương trình phần mềm chuyên dụng để xác định sự biểu hiện của các gen ở các mẫu phân tích. Hình 12: các bước tiến hành microarray Mẫu để lai (đích) có thể là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai. Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và nhuộm vàng/bạc. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất Xác định và phân tích tín hiệu lai: Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra. Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 13). Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác.  Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng. ▲Hình 13: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng. Mảng chứa mẫu dò cDNA: Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau. Mỗi mẫu được đánh dấu một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 14). Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu. Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối chứng cho mỗi phiến kính. (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra hiện tượng lai chéo . (iii) Không phân biệt được các gene liên quan gần và các gene khác nhau một nucleotide. (iv) Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu. Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ). Do đó, cần phải chuẩn hoá dữ liệu. (v) Không có khả năng định lượng. (vi) Cần lượng lớn đích . Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo. (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự . (iii) Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu. (iv) Tính đặc hiệu cao . ▲Hình 14: Thủ tục lai sử dụng mẫu dò cDNA. Mảng chứa mẫu dò oligonucleotide:  Các chip tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gene khác nhau, mỗi gene được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 “cặp mẫu dò” khác nhau .Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính xác và loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã nghĩ ra mô mẫu dò bắt cặp không hoàn hảo/hoàn hảo (MM/PM). Oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ một base chính giữa (hình 15). So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu gắn. Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau nên không được dùng để đánh giá. Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì cường độ tín hiệu lai MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu. Tất cả các vùng khác có kết quả lai đặc hiệu và là đối tượng phân tích.  Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng nhất và có thể so sánh hiệu quả. (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần. (iii) Có khả năng định lượng. (iv) Cần lượng nhỏ đích . (v) Mật độ mẫu dò lớn cho phép phân tích nhiều gen hơn trên một array. (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng… do đó tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot. ▲Hình 15: Thủ tục lai dùng mẫu dò tổng hợp in situ. Nhược điểm: (i) Các trình tự được chọn dựa ngân hàng gene nên có thể phải chỉnh sửa. (ii) Mẫu dò ngắn làm giảm độ nhạy và tính đặc hiệu. (iii) Không thể so sánh đồng thời sự biểu hiện gene của hai mẫu thí nghiệm liên quan trên cùng một mảng . ▲Hình 16: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM . VII.ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT MICROARRAYS: 1.Ứng dụng của microarray trong quản lý môi trường: a. Xác định vi sinh vật : Các microarray này chứa hàng trăm mẫu dò oligonucleotide, mỗi mẫu dò đại diện cho các chủng/loài/giống vi sinh vật khác nhau cho phép phát hiện nhanh với hiệu suất cao nhiều vi sinh vật từ hầu như bất cứ loại mẫu nào. Khả năng sử dụng các mảng chuẩn đoán vi sinh vật bao phủ hầu như toàn bộ các lĩnh vực khoa học sự sống bao gồm các chuẩn đoán người, thú y, thực vật và động vật, vi sinh môi trường, kiểm tra chất lượng nước…Có thể xác định vi sinh vật gây bệnh cho người từ các mẫu thử nghiệm một cách hoàn hảo với khả năng thiết kế mảng xác định nhanh, không qua nuôi cấy, chỉ trong vài giờ và hầu như bảo trì được thông tin tự nhiên của nó. (chẳng hạn:Với một giọt máu của người bệnh, bác sĩ chỉ cần 6 đến 8 tiếng đồng hồ là có thể xác định được 80% của 55 loại vi trùng. Hiện nay muốn tìm vi trùng gây bệnh người ta lấy nước tiểu, phân hay máu của bệnh nhân và gởi đến các phòng xác nghiệm. Bệnh nhân thường phải đợi nhiều ngày cho đến khi nhận được thuốc hay các biện pháp chữa trị) Cũng có thể dùng microarray để phát hiện thực phẩm nhiễm khuẩn, vi sinh vật gây bệnh cho động, thực vật trên quy mô lớn. Ngoài ra còn có thể sử dụng để nghiên cứu mức đa dạng vi sinh vật đất đối với tính chống chịu và độ màu mỡ của đất cũng như biến thiên độ đa dạng theo hoạt động nông nghiệp Bảng 1: Các ứng dụng nổi bất nhất của microarray trong xác định vi sinh vật  b. Đánh giá phân bố gene chức năng trong môi trường tự nhiên. Gene mã hoá các enzyme chức năng trong chu trình sinh địa hoá học (như C, S, N, các kim loại) là dấu hiệu rất hữu ích để giám sát trạng thái sinh lý và hoạt tính chức năng của các quần thể và quần xã vi sinh vật trong môi trường tự nhiên. Bảng 2: Ứng dụng microarray để xác định các tập hợp gene chức năng trong môi trường. Hầu hết các nghiên cứu đều hướng tới việc giải quyết độ nhạy và tính đặc hiệu của microarray để áp dụng trực tiếp với mẫu môi trường. Một vấn đề khác là khả năng di động của thiết bị để có thể mang tới hiện trường phân tích. Các mối quan tâm này đặc biệt quan trọng trong các ứng dụng quản lý, giám sát (theo thời gian thực) hoạt tính vi sinh vật trong môi trường cũng như động học quần xã của quá trình phân huỷ sinh học. 2.Ứng dụng trong y khoa: a. Chẩn đoán bệnh: đây là lĩnh vực mà ai cũng mong muốn sử dụng để tìm được câu trả lời nhanh chóng và chính xác nhất. Như chúng ta đã biết, một bệnh có liên quan đến không chỉ một gen mà có thể rất nhiều gen (như ung thư vú, hiện nay người ta đã phát hiện 129 gen liên quan đến bệnh này). Có thể kể một số bệnh đã được chẩn đoán thành công bằng phương pháp microarray là: đa bội hay thiểu bội nhiễm sắc thể, đột biến nhiễm sắc thể (ung thư tiền liệt tuyến, Thalassemia, ung thư ruột, ung thư gan...). Thí dụ:chẩn đoán ung thư vú Cứ mỗi 10 phụ nữ tại Ðức có một người bị bệnh ung thư vú. Hằng năm tại Ðức có thêm khoảng 45.000 phụ nữ bị bệnh Theo giáo sư Cornelius Knabbe của bệnh viện Robert Koch (Stuttgart) 70 % bệnh nhân mà tế bào ung thư chưa vào hạch, có thể sống ít nhất 10 năm nữa, nếu được chữa trị kịp thời. Với các phương pháp dùng „phóng xạ“ (Xạ trị) hay „hóa học“ (Hoá trị) thì khả năng sống còn của bệnh nhân tăng do di truyền (ung thư, rối loạn chuyển hóa, bệnh hệ thống...; Do đột biến lên 76%. Tuy nhiên, không phải bệnh nhân nào cũng phải áp dụng được những phương pháp hại sức khoẻ như trên để chữa trị và nhiều khi không đạt được kết quả. Ðể chẩn đoán và phân loại bệnh trạng của từng bịnh nhân công ty Eppendorf ở Hamburg (Ðức) sản xuất một loại Chip sinh học DualChipTM với 160 Gene để phân biệt các bệnh ung thư (BRCA1 und BRCA2) và qua đó người ta hy vọng có thể tìm được các gen gây các bênh ung thư khó trị. Dr. Sven Buelow của công ty Eppendorf cho biết, công ty của ông đã làm nhiều thí nghiệm chẩn đoán, so sánh „chip sinh học“ và các phương pháp cổ điển mà kết quả phù hợp rất khả quan. Hiện nay chip sinh học còn đang được áp dụng thực nghiệm cho 750 bênh nhân ở các nước châu Âu và Bắc phi. Cũng theo Buelow, chip sinh học của công ty Eppendorf sẽ được tung ra thị trường y học vào năm tới. b. Khám phá gen: chủ yếu để chẩn đoán các bệnh có liên quan đến những bất thường về trình tự nucleic acid như các bệnh nhiễm sắc thể (hội chứng Down, Thalassemia, Glaucoma, ung thư thứ phát...), hoặc phát hiện các chủng loại của những tác nhân gây bệnh cho người như HIV, HBV... 3. Ứng dụng trong công nghệ sinh học a. Xác định xem gene có biểu hiện (nghĩa là được phiên mã) ở trong một mẫu mô nào đó không (ví dụ như từ một khối u). Người ta chiết mRNA từ mô rồi dùng nó làm bản khuôn để tạo thành các đoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung. Sau đó đoạn này được đem lai trên phiến kính với các oligonucleotide đại diện cho nhiều loại gene khác nhau. Tín hiệu lai dương tính ở tại vị trí nào đó trên phiến kính chứng tỏ gene đó được biểu hiện trên mẫu mô. b.Xác định trình tự gen hoặc đột biến. Các oligonucleotide đóng vai trò của các đoạn dò (probe) được máy cài lên một phiến kính nhỏ. Mỗi phiến kính như vậy với diện tích khoảng 1cm2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide khác nhau. Các oligonucleotide này gồm các DNA có trình tự bình thường và các DNA có trình tự mang các đột biến gây bệnh đã biết. DNA của một đối tượng nào đó được gắn huỳnh quang và cho lai với các oligonucleotide trên phiến kính để xác định xem chúng lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến. Mẫu lai được phân tích trên máy vi tính để xác định DNA của đối tượng là bình thường hay mang loại đột biến cụ thể nào Hình 17:Sơ đồ minh hoạ một chip DNA. Các oligonucleotide được đặt trên con chip, sau đó cho tiếp xúc với DNA được gắn huỳnh quang của một đối tượng. Quá trình lai xảy ra nếu có một oligonucleotide có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA của đối tượng. Ví trí phát huỳnh quang trên chip sẽ đánh dấu vị trí của đoạn oligonucleotide trên chip 4. Ứng dụng trong nông nghiệp (nuôi trồng thủy sản): Với đặc tính có thể nhận biết được sự biểu hiện của các gen,microarray được dùng để phát hiện các bệnh trên tôm, cá, từ đó đưa ra phương pháp chữa trị tốt nhất Hình 18: Các vuông tôm đầy triển vọng cần nguồn tôm giống sạch bệnh thật sự và nguồn nước tốt có nhiều vi sinh vật có lợi. Các nhà khoa học đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử DNA chip vào việc theo dõi sức khỏe của cá nuôi. Những chuyên gia từ ba trường đại học của Anh Quốc đang phát triển một mẫu DNA chip cho phép họ có thể theo dõi sức khỏe và cải thiện việc nuôi cá Atlantic salmon và Salmo salar, đây là công cụ giúp bảo vệ hàng ngàn ao nuôi cá Hồi công nghiệp và bảo tồn nguồn giống đang suy giảm của loài này. Theo cách thông thường, người nuôi cá phải kiểm tra tình trạng sức khỏe cá nhờ việc quan sát tập tính cá và kiểm tra các dấu hiệu bệnh thể hiện bên ngoài thông qua dịch nhờn. Tuy nhiên, kỹ thuật DNA chip mới này có thể cho phép người nuôi và các nhà bảo tồn xác định tình trạng sức khỏe của cá giống với mức độ đánh giá tốt hơn.  Việc nghiên cứu DNA chip, nằm trong một dự án nghiên cứu bốn năm về sự biểu hiện các gene liên quan đến những tính trạng quan trọng ở cá Hồi (TRAITS) đang được thực hiện tại ba trường đại học ở Anh Quốc: Đại học Stirling, Aberdeen và Cardiff đồng thời kết hợp với viện nghiên cứu Roslin và các nhà nghiên cứu thuộc trường Khoa Học Thú Y Norwegian Nghiên cứu đã phát hiện ra một số gene chức năng tham gia trong vòng đời của cá Hồi như sự đáp ứng miễn dịch, nhờ đó có thể theo dõi sức khỏe của cá nuôi thông sự biểu hiện của gen này VIII. Triển vọng của phương pháp Microarray: Công nghệ sinh học đóng vai trò cực kì quan trọng trong thế kỉ XXI như vai trò của công nghệ thông tin cuối thế kỉ XX .MICROARRAY sẽ thay đổi toàn bộ các phương pháp nghiên cứu hiện nay trong một số lĩnh vực như : Tìm kiếm các loại thuốc trị bệnh. Xác định sự hoạt động của gene. Tìm vi trùng gây hại. Chẩn đoán ung thư vú. Tìm kiếm các loại thuốc trị bệnh: Kinh nghiệm trong mấy mươi năm qua cho thấy, để tìm ra một loại thuốc mới người ta phải mất từ 12 đến 15 năm với một chi phí khổng lồ, khoảng 800 triệu . Với chip sinh học các công ty cố thể giảm thời gian và phát triển từ hai đến ba năm và như vậy chi phí sẽ giảm đi hang trăm triệu EURO. Một hướng khác của việc ứng dụng chip sinh học để tìm thuốc trị bệnh trong tưong lai là tìm kiếm thuốc trị bệnh phù hợp với từng bệnh nhân. Vì theo nghiên cứu thì cùng một loại thuốc trị cho cùng một bệnh nhưng cho các bệnh nhân khác nhau thì kết quả khác nhau, nên trong tưong lai không thể sử dụng thuốc trị bệnh đại trà như hiện nay. Tuy nhiên để thực hiện được việc nghiên cứu và chế tạo các loại chip sinh học tương ứng, con người cần biết thêm nhiều thông tin chính xác về bộ gene người và qua đó mới có thể tạo ra các chip sinh học tương ứng. vì vậy việc giải mã bộ gene người thành công năm 2003 đóng vai trò rất quan trọng trong việc chế tạo các chip sinh học. Xác định sự hoạt động của gene: Cho đến nay, sau khi đã giải xong trình tự bộ gene người nhưng con ngừoi vẫn chưa hiểu hết về nó. Hiên nay việc xác định sự hoạt động của của một gene còn rất khó khăn (xác định sự biểu hiện gene là xác các enzyme hay một protein). Các nhà khoa học hy vọng trong tưong lai vói chip sinh học thì việc này sẽ dễ dàng hơn. Tìm vi trùng gây hại : Hiện nay côn trùng gây bệnh xác định chủ yếu bằng phưong pháp cổ điển nhưng cho kết quả chậm . gần đây ở trường đại học ETH ở Thụy Sỹ các nhà khoa học vừa sang chế ra một loại chip sinh học có thể xác định nhanh chóng các loại vi trùng gây bệnh trong cơ thể (chỉ với một giọt máu trong thời gian 6-8 tiếng có thể xác định 80% của 55 loại vi trùng). Nhưng tiến sỹ Schrenzel, trưởng nhóm nghiên cứu phát triển chip này muốn tăng them độ chính xác của của chip này lên đến 97% trước khi đưa ra thị trường. Chẩn đoán ung thư vú : Theo giáo sư Cornelius Knabbe của bệnh viện Robert Koch 70% bệnh nhân ung thư chưa vào hạch thì có thể sống ít nhất 10 năm nữa, nếu chữa trị kịp thời . với phương pháp dùng phóng xạ hay hóa học thì khả năng sống của bệnh nhân tăng lên 76%. Tuy nhiên, không phải bệnh nhân nào cũng áp dụng phương pháp có hại để chữa trị mà mà nhiều khi không đạt hiệu quả. Để chuẩn đoán và phân loại bệnh trạng của từng bệnh nhân, công ty Eppendorf ở Hamburg sản xuất một loại chip sinh học DualChipTM với 160 gene để phân biệt các bệnh ung thư và qua đó hy vọng tìm được các gene gây bệnh ung thư khó trị. Tiến sĩ Sven Buelow của công ty Eppendorf cho biết, công ty của ông đã và đang làm nhiều thí nghiệm chẩn đoán, so sánh “chip sinh học" và các phương pháp cổ điển mà kết quả phù hợp rất khả quan. Hiện nay chip sinh học còn đang được áp dụng thực nghiệm cho 750 bệnh nhân ở châu Âu và Bắc Phi. Cũng theo Buelow, chip sinh học của công ty Eppendorfseex sớm tung ra thị trường.  Hầu hết các nghiên cứu đều hướng tới việc giải quyết độ nhạy và tính đặc hiệu của microarray để áp dụng trực tiếp với mẫu môi trường. Một vấn đề khác là khả năng di động của thiết bị để có thể mang tới hiện trường phân tích . Các mối quan tâm này đặc biệt quan trọng trong các ứng dụng quản lý, giám sát (theo thời gian thực) hoạt tính vi sinh vật trong môi trường cũng như động học quần xã của quá trình phân huỷ sinh học.  Các nhà khoa học khắp nơi trên thế giới đã phát triển rất nhiều kỹ thuật khác nhau nhằm giải quyết những hạn chế này. Trong đó những phát kiến về thiết bị hiện ảnh , cải tiến thiết bị in mẫu dò, cải tiến phân tích, chuẩn hoá dữ liệu, phát triển các loại chất phát huỳnh quang mới. Thứ nhất là phát triển các phương pháp thực nghiệm mới nhưng vẫn dựa trên mảng cDNA hoặc oligonucleotide (cải tiến loại một). Thứ hai là phát triển các loại array mới, ở đó mẫu dò không phải DNA hay RNA mà là protein, hoá chất, peptide, glycan và PNA (cải tiến loại hai). a. Các cải tiến loại một: a.1 Cải tiến mẫu dò: Sử dụng mẫu dò phụ trợ ▲Hình 19: Phương pháp ứng dụng mẫu dò phát hiện chaperone . Mẫu dò phát hiện ngăn chặn việc tạo thành các cấu trúc nội phân tử giúp tăng hiệu quả lai. Chúng được thiết kế dựa trên đoạn trình tự 16S rRNA đặc trưng loài còn mẫu dò bắt giữ đại diện cho các trình tự bảo thủ giữa các loài. Mỗi mẫu dò phát hiện không lai chéo với RNA không phải đích cũng như không lai với mẫu dò bắt giữ trên mảng (Hình 19). Kết quả cho thấy, bằng cách sử dụng mẫu dò phát hiện đánh dấu biotin gắn với RNA ngay gần mẫu dò bắt giữ cố định trên mảng, Small và cộng sự (2001) có thể xác định trực tiếp (không PCR cũng như làm giàu) 16S rRNA của G.chapellei từ dịch chiết đất có ít nhất 0,5 µg rRNA tổng số (tương đương với 7,5 x 106 tế bào). Như vậy, phương pháp này có độ nhạy cao, và có thể ứng dụng trực tiếp với các mẫu môi trường mà không cần các bước khuếch đại, làm giàu hay đánh dấu đích. - Kết hợp đánh dấu phát huỳnh quang và đánh dấu phóng xạ (Isotope array): Adamczyk và cộng sự (2003) đã kết hợp hai phương pháp đánh dấu phát huỳnh quang và đánh dấu phóng xạ để nghiên cứu đồng thời sự phân bố về mặt chức năng cũng như hoạt tính vi sinh vật trong các mẫu bùn hoạt tính mà không sử dụng phương pháp PCR cũng như nuôi cấy .  a.2 Cải tiến mảng: - Flow-Thru ChipTM (FTC): Kỹ thuật này tạo ra mảng 3 chiều nhằm tăng cường bề mặt tiếp xúc giữa đích và mẫu dò, do đó tăng cường tốc độ lai. Các cơ chất xốp như mao quản thuỷ tinh, silicon có lỗ thủng do ăn mòn điện hoá (electrochemically etched porous silicon) và màng lọc bằng oxit kim loại thường được sử dụng. Các phân tử mẫu dò gắn trên thành trong của vi kênh (microchanel). Một chấm trên mảng có thể chứa nhiều vi kênh nhưng chỉ có một loại mẫu dò cố định tại đây (Hình 20). ▲Hình 20: Sơ đồ chế tạo Flow-ThruChipTM []. Kessler và cộng sự (2004) đã tạo ra một FTC chứa trên 700.000 vi kênh đồng nhất/1cm2. Mỗi vi kênh có đường kính 10 µm, dài 450 µm. Mỗi chấm chứa một loại mẫu dò gồm 100 vi kênh. Như vậy, khả năng gắn lớn gấp 100 lần so với phương pháp array truyền thống. Hơn nữa, phản ứng lai được tăng cường do hiệu quả gắn trong vi kênh lớn hơn so với mảng hai chiều. Trong vi kênh, mẫu dò khuếch tán tới đích nhanh hơn, khoảng vài giây trong vi kênh dài 10 µm, trong khi khoảng cách khuếch tán trên chip phẳng khoảng vài mm. Do đó, công nghệ FTC mang lại khả năng gắn lớn hơn, giảm thời gian lai và giảm lượng mẫu cần cho thí nghiệm. Bằng kỹ thuật này, Kessler và cộng sự (2004) đã xác các virus cúm gồm influenza A virus (H1N1, H3N2, H1N2 và H5N1) và influenza B virus với độ nhạy cao (1x102 đến 5x102 hạt virus), trong vòng chưa tới 5h (từ khi nhỏ mẫu vào chip đến khi phân tích kết quả) . - MAGIChip (Micro Arrays of Gel-Immobilized Compounds on a Chip): MAGIChip (hay còn gọi là gel array) là microarray dùng phiến kính thuỷ tinh làm giá thể, bên trên gắn các miếng đệm gel polyacry-lamide (gel-pad). Mẫu dò được cố định trên gel pad . Kích thước của miếng đệm này từ 10µm x 10µm x 5µm đến 100µm x 100µm x 20µm với thể tích từ picolit đến nanolit. Mỗi miếng đệm gel đóng vai trò một ống nghiệm chứa mẫu dò DNA vì bề mặt kính kỵ nước xung quanh ngăn cản sự trao đổi dung dịch mẫu giữa các miếng đệm . Việc chế tạo bao gồm các bước sau: tạo mảng với các thành phần gen (pad) trên phiến kính thuỷ tinh, cố định hoá học các mẫu dò trên gel (Hình 21). Các oligonucleotide tổng hợp được tinh chế bằng điện di trước khi cố định trên mảng giúp kiểm soát độ sạch và đảm bảo tính đặc hiệu cao. Gel polyacry-lamide giúp tăng khả năng chứa các oligonucleotide cố định trên mảng. Guschin và cộng sự (1997) đã áp dụng kỹ thuật này để nghiên cứu vi khuẩn nitrat hoá trong các mẫu môi trường. Năm 2001, Mikhailovich và cộng sự dùng MAGI chip với mẫu dò là các oligonucleotide được thiết kế đặc hiệu cho gen rpoB mã hoá tiểu đơn vị β của RNA polymerase để xác định các chủng vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc. Lapa và cộng sự (2002) cũng dùng phương pháp này để xác định các loại virus Orthopoxvirus gây bệnh với độ nhạy 102 đến 103 virion . Trong một nghiên cứu khác, phương pháp này được sử dụng để xác định quần xã vi khuẩn khử sulphate phân huỷ toluene và ethylbenzene mang lại hiệu quả rất cao. ▲Hình 21: Sơ đồ MAGIChip  - Chip răng lược (cantilever chip): Với những phát triển thần kỳ của công nghệ nano gần đây, các loại chip mới với vật liệu nano đang thu hút rất nhiều quan tâm của giới khoa học. Mới đây, McKendry và cộng sự (2002) đã chế tạo một loại array mới, dùng giá thể silicon có hình chiếc lược (cantilever). Bên trên, từng loại mẫu dò đã thiol hoá được gắn với các răng lược qua ống vi mao quản trong dung dịch đệm thích hợp (Hình 22). Khi có tương tác phối tử - thụ thể (đích - mẫu dò) sẽ làm tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm phosphate tích điện âm của DNA mạch kép và tăng mật độ chuỗi gắn trên bề mặt răng lược tạo ra áp lực bề mặt làm răng lược bị cong xuống. Độ cong của răng lược có thể xác định in situ bằng phương pháp quang .  Kỹ thuật này tương thích với cả DNA và protein vì cách phát hiện cơ nano (nanome-chanical) này không cần dấnh dấu, các chất phát quang hay các mẫu dò bổ trợ. Hơn nữa thủ tục tiến hành nhanh, có tính đặc hiệu, độ nhạy và khả năng di động cao. Với công nghệ này, cho phép xác định nhanh và chính xác các phân tử đích không đánh dấu ở nồng độ vài nanomole chỉ trong ít phút. Nếu sử dụng các hạt vàng nano thì có thể phát hiện chúng bằng ánh sáng cộng hưởng (resonance light) ở giới hạn chỉ 10 ng. Tính nhạy còn có thể tăng hơn nữa bằng cách sử dụng các lược mỏng hơn. Đáp ứng cơ nano nhạy với nồng độ oligonucleotide cho phép định lượng các phân tử sinh học tồn tại và có hoạt tính trong dung dịch. Ngoài ra còn có thể nghiên cứu nhiệt động học của các tương tác này. Vì vậy, công nghệ mới này đầy hứa hẹn trong phân tích bộ gen, proteomics, chuẩn đoán sinh học và khám phá thuốc. Với độ nhạy cao như vậy cũng mở ra tiềm năng vô cùng lớn trong quản lý môi trường, ở đó nồng đích rất thấp. Hiện tại, có thể tạo ra chip với trên 1000 răng lược . ▲Hình 22: Sơ đồ chip răng lược . b. Cải tiến loại hai: b.1 PNA array:  Một trong những khía cạnh quan trọng ảnh hưởng đến độ nhạy và tính đặc hiệu của kỹ thuật microarray là khả năng gắn của mẫu dò với đích. Trong các kỹ thuật microarray truyền thống luôn tồn tại mâu thuẫn là: mẫu dò dài thì tính đặc hiệu cao và mẫu dò gắn ổn định với đích nhưng độ nhạy giảm. Còn khi dùng mẫu dò ngắn (oligonucleotide) thì độ nhạy cao nhưng tính đặc hiệu và mức độ ổn định của cấu trúc đích-mẫu dò lại giảm. Như đã biết, mạch khung của axit nucleic là một chuỗi các nhóm phosphate tích điện âm nối với nhau qua liên kết phosphodiester. Vì vậy, khi tạo thành mạch kép hai chuỗi khung luôn có xu hướng đẩy nhau do tích điện cùng dấu làm giảm độ ổn định của cấu trúc đích-mẫu dò. Có thể dùng muối để trung hoà lực đẩy này. Muối làm ổn định cấu trúc xoắn kép nhưng cũng ổn định hoá cấu trúc bậc hai và bậc ba nội phân tử làm giảm hiệu quả lai .  Các vấn đề trên dẫn tới nhu cầu phát triển một loại mẫu dò mới vừa nhạy, vừa đặc hiệu. Các oligomer peptide nucleic acid (PNA) có thể đáp ứng yêu cầu này. PNA có cấu trúc giống như DNA, chỉ khác ở chỗ nhóm phosphate và liên kết phosphodiester của DNA được thay bằng nhóm N-(2-aminoethyl)-glycine và liên kết amide. Các nucleobase gắn với khung bởi liên kết ethylene carbonyl (Hình 23). Chúng ta đã có 50 năm khám phá ra chuỗi xoắn kép DNA, nhưng mới chỉ có 10 năm khám phá ra PNA . Tuy nhiên PNA đã và đang được phát triển cho nhiều ứng dụng khác nhau. Một trong số đó là PNA array. Sử dụng PNA làm mẫu dò có một số thuận lợi lớn. Thứ nhất, bộ khung của PNA không tích điện do đó triệt tiêu lực đẩy giữa hai mạch cấu trúc PNA-DNA. Vì vậy, tính ổn định của các phân tử mạch kép PNA-DNA trong điều kiện sinh lý tăng xấp xỉ 1,5oC so với liên kết DNA-DNA . Thứ hai, có thể tiến hành phản ứng lai trong điều kiện nồng độ muối đệm thấp hoặc thậm chí không cần. Thứ ba, liên kết bổ sung giữa hai mạch PNA và DNA đặc hiệu hơn . Thứ tư, PNA không bị phân cắt bởi protease hoặc nuclease do đó có thể thiết kế mẫu dò ngắn hơn . Cuối cùng, ưu điểm quan trọng nhất là có thể phát triển các phương pháp phát hiện ảnh tốt hơn so các phương pháp truyền thống nhắm vào cấu trúc khác biệt giữa DNA và PNA . ◄Hình 23: Cấu trúc phân tử PNA. Ở đó nhóm phosphate và liên kết phospho-diester của DNA được thay bằng nhóm N-(2-amino-ethyl)-glycine và liên kết amide. Các nucleobase gắn với khung bởi liên kết ethylene carbonyl . Có hai cách chế tạo mảng PNA là tổng hợp in situ và gắn các mẫu dò được tổng hợp từ trước lên mảng . Ngoài việc thay mẫu dò oligonucleotide bằng mẫu dò PNA, các bước khác vẫn tiến hành giống như DNA array truyền thống. Gần đây, bằng cách kết hợp PNA array với phương pháp phát hiện TOF-SIMS (time-of-flight secondary ion mass spectrometry), Brandt và cộng sự (2003) đã tạo ra một phương pháp có độ nhạy cao để phát hiện trực tiếp các đích RNA hoặc DNA không cần đánh dấu. Những tiến bộ về mặt kỹ thuật này đã mở ra hướng ứng dụng vô cùng to lớn của PNA array trong quản lý môi trường . b.2 Nanowire array: Một trong những vấn đề rất quan trọng trong lĩnh vực quản lý môi trường là cần phát hiện nhanh, nhạy và có chọn lọc các loại virus gây bệnh.  Các dây nano silicon được tổng hợp và gắn trên bề mặt giá thể silicon bằng phương pháp in quang hoạt. Sau đó gắn cộng hoá trị các thụ thể kháng thể trên dây nano bằng xử lý hoá học. Mẫu virus được phân phối tới thiết bị qua các kênh dẫn lỏng, kênh polymer dẻo hoặc khe tạo thành giữa lớp thuỷ tinh đặt trên trên bề mặt và chip. ►Hình 24: Sơ đồ thiết bị mảng dây nano dùng để phát hiện các virus đơn lẻ. Bên trái là sơ đồ thiết bị gồm 2 dây nano. Hai dây nano 1 và 2 gắn trên đó các thụ thể kháng thể khác nhau. Sự gắn đặc hiệu của một virus trên các thụ thể của dây nano 2 tạo ra sự biến đổi độ dẫn (bên trái) do điện tích bề mặt của dây nano bị biến đổi. Khi tách virus khỏi bề mặt, độ dẫn trở lại giá trị đường thẳng như ban đầu . Ưu điểm của loại array này là có thể xác định tín hiệu lai bằng hai cách. Cách thứ nhất là đo độ dẫn điện thay đổi qua thời gian thí nghiệm. Khi virus gắn đặc hiệu trên các thụ thể của dây nano làm cường độ dòng điện qua nó biến đổi vì điện tích bề mặt của dây nano đã bị biến đổi. Khi tách virus ra khỏi bề mặt, độ dẫn trở lại đường thẳng như ban đầu (hình 24). Độ dẫn khác nhau khi số lượng cũng như chủng loại virus gắn với thụ thể trên dây nano khác nhau. Cách thứ hai là đo quang. Khi cho dòng điện chạy qua, dây nano phát quang. Có thể dùng thuốc nhuộm phát huỳnh quang để đánh dấu các hạt virus. Dùng hai loại kính hiển vi khác nhau xác định đồng thời tín hiệu phát quang của dây nano và thuốc nhuộm.  Trong thực nghiệm, ảnh phát sáng, phát huỳnh quang cùng dữ liệu độ dẫn được xác định đồng thời. Dữ liệu phát sáng cho biết vị trí của dây nano cùng với màu phát huỳnh quang kết hợp với nhau cho thấy vị trí tương đối của dây nano và sự di động của các hạt virus. Độ dẫn giúp xác định loại virus và định lượng chúng . Bằng cách này Patolsky và cộng sự (2004) đã xác định hai loại virus khác nhau là influenza A (kháng thể của chúng nằm trên dây 1) và adenovirus (kháng thể của chúng nằm trên dây 2). Độ dẫn điện thu được khi hai loại virus gắn với hai dây nano sẽ khác nhau do mật độ điện tích bề mặt của hai virus khác nhau .  Như vậy, có thể xác định trực tiếp các virus với tính đặc hiệu cao bằng mảng dây nano mà không cần bất cứ bước tinh sạch hay khuếch đại nào. Loại mảng này có thể xác định được một virus hoặc nhiều virus đồng thời.  Bằng các phương pháp kết hợp để tạo ra những mảng dây nano lớn hơn, có tính tái sử dụng cao hơn , phương pháp này hứa hẹn nhiều chiển vọng có thể xác định đồng thời trên 100 loại virus khác nhau . b.3 Peptide array: Khái niệm peptide array được đưa ra đầu tiên ngay từ năm 1984 khi các phương pháp tổng hợp hoá học kết hợp phát triển cao . Protein đóng vai trò quan trọng trong tất cả các quá trình của tế bào. Vai trò này của chúng bao gồm các thụ thể bề mặt tế bào, làm trung gian bám dính tế bào, các yếu tố nhận biết phân tử bởi đó protein adaptor xác định hoạt tính hoá sinh và hoạt tính enzyme trải qua chức năng trao đổi chất và chuyển hoá dấu hiệu. Trong một số trường hợp, hoạt tính sinh học của protein có thể khu trú thành các peptide ngắn hơn. Các peptide này có trình tự bậc một (mặc dù thường mất một phần hoạt tính). Hơn nữa, trong khi protein thường bị biến tính và mất hoạt tính sinh học, peptide lại có chức năng tương đối ổn định, chúng có thể giữ hoạt tính dưới hầu hết các điều kiện phản ứng. Do đó peptide được ưu tiên phát triển cho các thí nghiệm sàng lọc, đặc biệt trong các kỹ thuật microarray. Vào thập kỷ trước, các tiến bộ trong hoá học và sinh học phân tử cho phép tổng hợp nhiều loại peptide có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau .Những điều trên là tiền đề ra đời peptide array. Có thể sử dụng peptide array để sàng lọc nhiều tương tác khác nhau như sự gắn của protein, hoạt tính enzyme, bám dính của tế bào, sự gắn của kim loại … ▲Hình 25: Sơ đồ nguyên lý peptide array.  Có nhiều phương pháp được sử dụng để chế tạo peptide array. Trong đó tổng hợp peptide in situ hoặc gắn các peptide chức năng trên chip là hai phương pháp thường dùng nhất .  Hiện nay, hầu hết peptide array được tạo ra để nghiên cứu kinase vì sự phosphoryl hoá protein bởi kinase là một trong những cơ chế điều hoà chức năng tế bào quan trọng nhất. Một ứng dụng quan trọng khác của peptide array là phát hiện cơ chất/sự kìm hãm của các hydrolase bao gồm protease và các loại enzyme thuỷ phân khác như lipase, esterase… . Duburcq và cộng sự (2004) đã sử dụng peptide/protein microarray để xác định kháng thể gắn với mảng qua tín hiệu phát huỳnh quang và ứng dụng phương pháp này để nghiên cứu kháng thể kháng virus viêm gan B/C, virus suy giảm miễn dịch của người, Epstein-Barr virus và các kháng nguyên bệnh giang mai (syphilis antigens) với độ nhạy và tính đặc hiệu cao .Trong một ví dụ thú vị khác, Gao và cộng sự (2003) đã sử dụng peptide array để xác định các phối tử gắn chọn lọc với muối Pb(II), mở ra hướng sử dụng peptide array làm điện cực kiểm soát các kim loại độc trong môi trường .  4 Glycan array: Với trên 50% protein mang các chuỗi glycan (olygosaccharide), glycomics và proteomics cùng nổi lên với vai trò là hai lĩnh vực nghiên cứu phát triển sau kỷ nguyên genomics. Các tương tác carbonhydrate-protein trong oligosaccharide liên kết protein đặc hiệu và các protein gắn bổ sung của chúng thường liên quan trực tiếp đến rất nhiều quá trình sinh học khác nhau. Các tương tác này xảy ra trong tế bào, trên bề mặt tế bào, trong chất nền (matrix) ngoại bào hoặc trong các chất tiết (secrection). Chúng tham gia vào quá trình gấp nếp của protein mới sinh trong lưới nội chất, quá trình enzyme lysosomal mới tổng hợp hướng tới nơi đến chính xác của chúng và quá trình hoạt hoá tế bào trong cơ chế viêm cũng như sự bám dính của vi khuẩn với các tế bào chủ. Chính vì glycan đóng cai trò rất quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như vậy mà người ta đã phát triển một loại mảng mới là glycan array. Ở đó, sử dụng chất sử dụng cơ chất là phiến kính thuỷ tinh bọc nitrocellulose, nhựa plastic, phiến kính phủ vàng , phiến kính thuỷ tinh hoạt hoá thiol-, đĩa silica-gel hay giếng chuẩn nhỏ thuỷ tinh (plastic microtitre well). Mẫu dò có thể là glycoprotein, polysacchride, mono hay oligosaccharide.Dùng các phương pháp hoá học để gắn mẫu dò đã tổng hợp từ trước với với mảng. Sau đó cho dung dịch chứa protein đích đi qua và xác định dấu hiệu lai bằng các phương pháp thích hợp (hình 26). ▲Hình 26: Sơ đồ quá trình chế tạo và sử dụng glycan array.  Blixta và cộng sự (2004) đã sử dụng glyco array để phân tích hầu hết các nhóm GBP (glycan binding protein) quan trọng bao gồm lectin động vật (lectin loại C, galectin, và siglec), lectin thực vật, lectin của vi khuẩn và virus, và các virus nguyên vẹn . Kết quả cho thấy có thể dùng glyco array để xác định virus HIV-1, virus cúm (influenza virus). 5 Protein array: Gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã phát triển protein microarray để phân tích đồng thời nhiều protein. Protein microarray chứa một lượng nhỏ protein tinh khiết trên một mảng với mật độ lớn. Các protein có thể được sàng lọc với hiệu suất cao cho hoạt tính hoá sinh, các tương tác protein-protein, protein-DNA, protein-RNA và protein-phối tử. Trong kỹ thuật protein array, phiến kính thuỷ tinh là cơ chất, trên đó gắn hàng ngàn mẫu dò protein. Sau đó cho mẫu sinh học đi qua chip và đánh giá hiệu quả gắn . Mặc dù kỹ thuật protein chip không phát triển mạnh như DNA array, sự cải thiện của chúng chắc chắn sẽ xảy ra vì protein là trung gian của hầu hết các chức năng của tế bào. Do đó protein chip là các công cụ được dành để xác định các cơ sở phân tử của bệnh, cơ chế cơ bản của hoạt tính thuốc và độc tính . Bảng 3: Các loại protein microarray . Một số thách thức quan trọng của kỹ thuật protein chip là: -     Tìm kiếm bề mặt hoá học thích hợp để cố định các protein có cấu trúc và chức năng khác nhau lớn mà vẫn giữ được cấu trúc bậc hai và bậc ba có hoạt tính sinh học của chúng . -     Xác định và phân lập các chất bắt giữ thích hợp (như kháng thể) của protein quan tâm . -     Phương pháp phát hiện đủ nhạy và sự giám sát đánh giá rộng mức độ gắn protein . -     Khả năng thu lại protein đã phát hiện từ chip và phân tích nó tiếp theo nếu cần .  -     Dải động học phát hiện lớn để bao phủ dải rộng được thể hiện bởi các nồng độ protein khác nhau . -     Không có phương pháp khuếch đại như kiểu PCR để khuếch đại protein  * Gắn protein trên mảng: Giống như DNA microarray, protein array được tạo ra trên cơ chất thuỷ tinh hoặc silicon cái được xử lý với aldehyde hoặc các chất khác để cố định protein bắt giữ như kháng thể bằng các biến đổi hoá học. Một số cách khác dùng để tạo ra mảng protein là sử dụng các lớp nhôm hoặc vàng, các polyme ưa nước và polyacrylamide gel để cố định các chất bắt giữ . - Các chất bắt giữ:Các kháng thể được cố định thường được sử dụng như các chất bắt giữ. Protein chip gồm một mảng chứa các kháng thể (đơn dòng, đa dòng, các đoạn kháng thể). Các chất bắt giữ khác được sử dụng là các aptamer (các axit nucleic mạch đơn tạo phức với protein) và các oligonucleotide gắn đặc hiệu với protein . - Phát hiện: Phương pháp phát hiện huỳnh quang được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên điều này cần đánh dấu các protein bằng fluorochrome. Rủi ro là sự gắn với chất này có thể thay đổi tính ổn định gắn của protein với chất bắt giữ được cố định . ▲Hình 27: Gắn protein lên giá thể. Nettikadan và cộng sự (2003) đã tạo ra ViriChip để xác định bacteriophage fd, các loại canine parvovirus và coxsackievirus B3 Nancy . Trong đó, các miền kháng thể bắt giữ đặc hiệu những vị trí xác định của virus được đặt trên mảng. Phát hiện virus gắn trên mảng bằng kính hiển vi năng lượng nguyên tử (atomic force microscopy, ATM). Kỹ thuật này cho phép xác định nhanh, không cần đánh dấu hay khuếch đại đích. ViriChip có tính đặc hiệu rất cao do dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể, độ nhạy cũng cao với dải nồng độ phát hiện virus là 108 đến 1012 pfu/ml. ViriChip có thể xác định đồng thời 5 loại virus trong thời gian chưa đến 1 giờ.