Báo cáo Khoa học Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa, cám gạo, bột đậu tương và urê để các chủng nấm mốc

ĐÀO THỊ TUYẾT – Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa .. 1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CÁC THÀNH PHẦN XƠ DỪA, CÁM GẠO, BỘT ĐẬU TƯƠNG VÀ URÊ ĐỂ CÁC CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus awamori VTCC-F296, A.niger VTCC-F128 VÀ A. oryzae MN SINH TỔNG HỢP NHIỀU MANNANASE Đào Thị Tuyết1*, Vũ Thị Thu Hằng1, Lã Văn Kính2 và Quyền Đình Thi1 1 Viện Công nghệ sinh học; 2 Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam *Tác giả liên hệ: Quyền Đình Thi - Viện Công nghệ sinh học - Hà Nội Tel. (04) 37.568.260; Fax: 04.38.363.144; E-mail: quyen@ibt.ac.vn ABSTRACT Determination of culture component concentration of coconut fiber, rice bran, soya powder and urê for filamentous strains Aspergillus awamori VTCC-F296, A. niger VTCC-F128 AND A. oryzae MN producing high level of mannanase Three strains A. niger VTCC-F128, A. oryzea MN02 and A. awamori VTCC-F296 screened from 131 filamentous strains Aspergillus, grew and produced a high level of mannanase on carbon and nitrogen sources as agricultural by-product. The strain A. niger VTCC-F128 produces mannanase of 62.4 U/ml in the mineral culturê medium Czapek (0,1% K2HPO4; 0.2% NaNO3; 0.05% MgSO4, 0.05% KCl) supplemented with 2% coconut fiber and 0.1% soya powder. In the replaced culturê medium using 4% rice bran as the carbon source and 0.1% urê as nitrogen, mannanase activity of the strain A. oryzae MN riched 63.7 U/ml; the strain A. awamori VTCC-F296 produced 186.5 U/ml with 3% rice bran and 0.4% urê. In the replaced culturê medium, the strain A. awamori VTCC-F296 produced mannanase three times higher than in the basic culture medium. Key words: coconut fiber, rice bran, soya powder; Aspergillus niger VTCC-F128, Aspergillus oryzae MN, Aspergillus awamori VTCC-F296, culture condition, mannanase. ĐẶT VẤN ĐỀ Endo--1,4-mannanase (EC 3.2.1.78) là enzyme xúc tác thủy phân ngẫu nhiên các liên kết - 1,4-mannopyranosyl trong chuỗi mannan và rất nhiều polysaccharide khác có thành phần chủ yếu là mannose, sản phẩm thủy phân của mannanase là các mannobiose, mannotriose và các oligosaccharide khác. Mannanase đã được sản xuất trên qui mô công nghiệp và được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy (Kansoh, Nagieb, 2004), thực phẩm, chế biến thức ăn gia súc (Wu và cs, 2005), dược phẩm cho đến dầu khí. Hiện nay, với khả năng thủy phân bã cơm dừa, mannanase cũng được sử dụng để phân hủy nguồn thải của các nhà máy chế biến thực phẩm từ dừa, sản xuất các oligosaccharide ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, các loại thực phẩm chức năng. Hiện nay việc sử dụng mannanase để chuyển hóa các nguyên liệu không có giá trị dinh dưỡng thành sản phẩm có giá trị hoặc cải thiện một số đặc tính kĩ thuật của nguyên liệu đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. -mannosidase và -mannanase được sản xuất từ chủng A. awamori K4 trong môi trường lỏng với bã cà phê 40% và 60% cám lúa mì, tối ưu pH 5 (Kurakake và Komaki, (2001). Tại Việt Nam, Đặng Thị Thu và cs, (2003) đã phân lập và đánh giá tính chất endo--1,4-mannanase từ A. awamori BK. Chủng này sinh tổng hợp mannanase cao sau 120 giờ nuôi ở môi trường lỏng có thành phần khoáng czapek, bã cà phê (21,3 g/l), guargum (10 g/l), cao nấm men (22 g/l) (Đặng Thị Thu và cs, 2003). Trong một nghiên cứu trước, tối ưu điều kiện nuôi cấy ban đầu cho thấy thời gian sinh tổng hợp mannanase cao nhất của chủng A. niger VTCC-F128 là 120 giờ, nhiệt độ 37C, pH 6,0; chủng A. oryzae MN là 96 giờ, nhiệt độ 28C, pH 5,0 và chủng A. awamori VTCC-F296 là 168 giờ, nhiệt độ 37C, pH 7,0 (Đào Thị Tuyết và cs, 2009). Nguồn cơ chất cảm ứng tốt nhất cho sinh tổng hợp mannanase của cả ba chủng là guargum. Cả 3 chủng trên đều là các chủng có khả VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009 2 năng phát triển và sinh tổng hợp mannanase cao trên nguồn cacbon và nitrogen là các sản phẩm hoặc phụ phế liệu của sản xuất chế biến nông sản, chủng A. niger VTCC-F128 (xơ dừa, bã mía và bột đậu tương); A. awamori VTCC-F296 và chủng A. oryzae MN (cám gạo và urê) (Đào Thị Tuyết và cs, 2009). Trong nghiên cứu này, tỷ lệ của các thành phần carbon và nitrogen như xơ dừa, cám gạo, bột đậu tương và urê tiếp tục được khảo sát để xây dựng các công thức môi trường nuôi cấy các chủng Aspergillus awamori VTCC-F296, A. niger VTCC-F128, A. oryzae MN sinh tổng hợp mannanase cao nhằm sản xuất các chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng giống nấm Chủng Aspergillus awamori VTCC-F296 và Aspergillus niger VTCC-F128 do Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học cung cấp; chủng Aspergillus oryzae MN02 do Viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam cung cấp. Môi trường và phương pháp nuôi cấy Môi trường nuôi cấy cơ bản cho sinh tổng hợp mannanase là môi trường khoáng (MTK) Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl); 0,5% cao nấm men, 1% peptone; 0,5% guargum. Để xác định TP môi trường nuôi tối ưu cho các chủng Aspergillus sinh tổng hợp mannanase cao từ các nguồn phụ phế liệu sẵn có trên thị trường, cao nấm men và peptone được thay thế bằng bã mía, bã sắn, xơ dừa và bột đậu tương cho A. niger VTCC- F128; cám gạo và urê cho A. oryzae MN và A. awamori VTCC-F296. Chủng A. awamori VTCC-F296 được nuôi trong môi trường thay thế bổ sung 0,5% guargum, lắc 200 v/ph, ở 37C, pH 7. Chủng A. niger VTCC-F128 được nuôi trong môi trường thay thế bổ sung 0,3% guargum, lắc 200 v/ph, ở 37C, pH 6. Chủng A. oryzae MN02 được nuôi trong môi trường thay thế bổ sung 0,7% guaragum, lắc 200 v/ph, ở 28C, pH 5. Hóa chất: Các hóa chất dùng trong thí nghiệm được cung cấp từ các hãng khác nhau: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, KCl, guargum, locust bean gum (LBG) (Biochemika), peptone (Merck),3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) (Fluka). Cột Microsep 10K Omega (Mexico). Xác định hoạt tính Hoạt tính endo--1,4-mannanase được định tính theo phương pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch đã mô tả trước đây (Nguyễn Sỹ Lê Thanh và cs, 2006) có cải tiến. Thời gian ủ trong tủ lạnh 4C cho enzyme khuếch tán là 12 giờ và thời gian ủ cho phản ứng enzyme cơ chất xảy ra là 6 giờ ở 37C. Hoạt tính endo--1,4-mannanase được định lượng chính xác theo phương pháp quang phổ (Miller, 1959) với nhiệt độ phản ứng là 40C. Một đơn vị hoạt tính mannanase được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1mol mannose trong 1 phút ở điều kiện thích hợp. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Môi trường thay thế nuôi chủng A. awamori VTCC-F296 Chủng A. awamori VTCC-F296 được nuôi trong môi trường MTK; 0,7% guargum; 0,1% ĐÀO THỊ TUYẾT – Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa .. 3 peptone, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn carbon là cám gạo (1-5%). Sinh tổng hợp mannanase của chủng A. awamori VTCC-F296 tăng lên 20% ở môi trường chứa 3% cám gạo (78,8 U/ml) so với môi trường đối chứng MTK chứa cao nấm men (65,8 U/ml). Trong môi trường bổ sung nhiều cám gạo (5%) khả năng sinh tổng hợp mannanase của chủng này kém đi nhiều chỉ còn 50,1 U/ml (Bảng 1) Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo và urê lên khả năng sinh tổng hợp mannanase của chủng A. awamori VTCC-F296. Hoạt tính Hoạt tính Cám gạo (%) (U/ml) (%) Urê (%) (U/ml) (%) 1 71,5 109 0,1 44,6 85 2 73,3 111 0,2 49,6 94 3 78,8 120 0,3 51,7 98 4 70,2 107 0,4 64,5 123 5 50,1 76 0,5 60,0 114 ĐC 65,8 100 ĐC 52,6 100 Chủng A. awamori VTCC-F296 được nuôi trong môi trường MTK; 0,7% guargum; 3% cám gạo, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn nitrogen là urê (0,1-0,5%). Sinh tổng hợp mannanase của chủng A. awamori VTCC-F296 tăng lên 23% (64,5U/ml) khi bổ sung 0,4% urê (Bảng 1). (Alan và cs,1977) đã nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp mannanase ngoại bào của chủng A. niger và chủng này sinh tổng hợp mannanase cao trong môi trường MTK bổ sung 1,4 g/l urê (Alan và cs, 1977). Như vậy, thành phần môi trường thay thế tối ưu để chủng A. awamori VTCC-F296 sinh tổng hợp mannanase cao là MTK Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl); 3% cám gạo và 0,4% urê). Môi trường thay thế nuôi chủng A. niger VTCC-F128 Khảo sát tỷ lệ (%) bã mía, bã sắn và xơ dừa Bảng 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ (%) bã mía, bã sắn, xơ dừa lên khả năng sinh tổng hợp mannanase của A. niger VTCC-F128. Hoạt tính Hoạt tính Bã mía (%) (U/ml) (%) Xơ dừa (%) (U/ml) (%) 1 53,7 101 0,5 48,4 91 2 69,3 130 1,0 53,3 100 3 61,5 116 1,5 69,8 131 4 49,4 93 2,0 77,1 145 Bã sắn (%) - - 2,5 75,3 142 1 54,0 102 3,0 55,7 105 2 48,5 91 Cao nấm men (%) - - 3 50,4 95 0,5 53,2 100 4 35,9 68 - - - Chủng A. niger VTCC-F128 được nuôi trong môi trường MTK chứa 0,3% guargum và 0,1% peptone, tỷ lệ cấy chuyển giống là 2,5% với các nguồn carbon là bã mía, bã sắn, cao nấm men và xơ dừa. Xơ dừa và bã mía là những nguồn carbon có thể thay thế cao nấm men với mức độ VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009 4 sinh tổng hợp mannanase cao hơn 30% (Đào Thị Tuyết và cs, 2009). Sinh tổng hợp mannanase tăng lên 45% trong môi trường nuôi cấy chứa 2% xơ dừa (77,1 U/ml) và 30% trong môi trường nuôi cấy chứa 2% bã mía (69,3 U/ml) so với môi trường chứa 0,5% cao nấm men (53,2 U/ml) (Bảng 2). Sinh tổng hợp mannanase gần như giữ nguyên trong môi trường chứa 1% bã sắn (54,0 U/ml) so với môi trường chứa 0,5% cao nấm men. Khảo sát tỷ lệ (%) bột đậu tương Mức độ sinh tổng hợp mannanase của chủng A. niger VTCC-F128 tăng lên 33% khi giảm tỷ lệ bột đậu tương từ 1% (57,6 U/ml) xuống 0,1% (77,6 U/ml) và tăng lên 30% so với môi trường đối chứng chứa 0,1% peptone (59,6 U/ml) (Hình 1). Như vậy, thành phần môi trường thay thế phù hợp cho chủng A. niger VTCC-F128 sinh tổng hợp mannanase cao là MTK Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl); 0,3% guargum; 0,1% bột đậu tương; 2% xơ dừa (2% bã mía hoặc 1% bã sắn). Môi trường thay thế nuôi chủng A. oryzae MN02 Chủng A. oryzae MN02 được nuôi trong MTK; 0,7% guargum; 0,1% peptone, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn carbon là cám gạo (1-5%) (Bảng 3). Với nguồn carbon 4% cám gạo sinh tổng hợp mannanase (58 U/ml) tăng lên 16% so với nguồn carbon 0,5% cao nấm men (50 U/ml). Nhưng có thể sử dụng 2% cám gạo (52 U/ml) để thay thế 0,5% cao nấm men (50 U/ml) trong môi trường nuôi cấy chủng A. oryzae MN02. Chủng A. oryzae MN02 được nuôi trong MTK; 0,7% guargum; 4% cám gạo, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn nitrogen là urê (0,1-0,5%) (Bảng 3). Bảng 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ (%) cám gạo và urê lên khả năng sinh tổng hợp mannanase của A. oryzae MN02. Hoạt tính Hoạt tính Cám gạo (%) (U/ml) (%) Urê (%) (U/ml) (%) 1 48,9 98 0,1 20,2 40 2 51,6 103 0,2 62,1 124 3 54,4 109 0,3 33,2 66 4 58,0 116 0,4 24,6 49 5 48,0 96 0,5 14,6 29 Đối chứng (0,5% cao nấm men và 0,1% peptone) 50,0 100 Mức độ sinh tổng hợp mannanase của chủng A. oryzae MN02 tăng lên 24% trong môi trường MTK chứa 0,2% urê (62,1 U/ml) và 4% cám gạo so với trong môi trường đối chứng MTK chứa 0,5% cao nấm men và 0,1% peptone (50 U/ml). Như vậy, thành phần môi trường thay thế cho chủng A. oryzae MN02 sinh tổng hợp mannanase cao là MTK Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl); 4% gạo cám và 0,2% urê. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Bột đậu tương (%) H oạ t t ín h (U /m l) Hình 1. Ảnh hưởng của tỉ lệ (%) bột đậu tương lên khả năng sinh tổng hợp mannanase của A. niger VTCC- F128. ĐÀO THỊ TUYẾT – Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa .. 5 Khả năng sinh tổng hợp mannanase theo thời gian trong môi trường thay thế của các chủng nghiên cứu Các kết quả thực nghiệm ở trên cho thấy khả năng sinh tổng hợp mannanase của chủng A. awamori VTCC-F296 (186 U/ml) sau 7 ngày nuôi cấy cao gấp 3 lần so với hoạt tính của chủng này khi nuôi trong môi trường cơ bản (66 U/ml). Chủng A. niger VTCC-F128 và chủng A. oryzae MN sinh tổng hợp mannanase cao nhất lần lượt sau 5 ngày và 4 ngày nuôi cấy (64 U/ml và 62 U/ml) (Hình 2 và Bảng 4). Từ những kết quả ở trên có thể kết luận thành phần môi trường nuôi thích hợp để các chủng nghiên cứu sinh tổng hợp mananase cao (Bảng 4). Bảng 4. Thành phần môi trường thay thế nuôi các chủng nghiên cứu Hoạt tính Tên chủng Thành phần môi trường U/ml U/mg A. awamori VTCC-F296 MTK + 0,5% guargum + 3% cám gạo + 0,4% urê 186,4 453,5 A. niger VTCC-F128 MTK + 0,3% guargum+ 2% xơ dừa +0,1% bột đậu 62,4 148,4 A. oryae MN02 MTK + 0,7% guargum + 4% cám gạo + 0,2 urê 63,7 165,6 Đặng Thị Thu và cs, (2003) đã tối ưu một số điều kiện để sinh tổng hợp mannanase của chủng A. awamori BK phân lập tại Việt Nam trong môi trường lỏng có thành phần khoáng Czapek, bã cà phê (21,3 g/l), guargum (10 g/l), cao nấm men (22 g/l). Chủng A. awamori BK sinh tổng hợp mannanase đạt 120 U/ml sau 4 ngày nuôi cấy. Với môi trường nuôi cấy cơ bản, thay thế cao nấm men và peptone lần lượt bởi 3% cám gạo và 0,4% urê, chủng A. awamori VTCC- F296 sinh tổng hợp mannanase đạt 186,4 U/ml, nếu thay thế bởi 4% cám gạo và 0,2% urê, chủng A. oryzae MN02 sinh tổng hợp mannanase cũng đạt 63,7 U/ml (Bảng 4). Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố của Kurakake và cs. (2001) khi nghiên cứu - mannosidase và -mannanase từ chủng A. awamori K4, chủng này sinh tổng hợp mannanase cao trong môi trường lỏng bổ sung 60% cám lúa mỳ ; Alan và cs. (1977) khi nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp mannanase ngoại bào của chủng A.niger đã sử dụng MTK có bổ sung 1,4 g/l urê. Các nguồn carbon (xơ dừa cho chủng A. niger VTCC-F128; cám gạo cho A. oryzae MN02 và A. awamori VTCC-F296) và nguồn nitrogen (bột đậu tương cho A. niger VTCC-F128; urê cho A. oryzae MN02 và A. awamori VTCC-F296) đều là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có trên thị trường rất thích hợp cho việc sản xuất mannanase trên quy mô công nghiệp phục vụ mục đích tạo ra một lượng lớn enzyme bổ sung vào thức ăn cho gia súc. 0 40 80 120 160 200 0 2 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) H oạ t t ín h (U /m l) Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sinh tổng hợp mannanase của A. awamori VTCC-F296 (), A. niger VTCC-F128 (); và A. oryzae MN () trong môi trường thay thế. VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009 6 Trong môi trường đã được tối ưu hóa, chủng A. awamori BK sinh tổng hợp mannanase cao gấp 2 lần so với trong môi trường cơ bản ban đầu (Đặng Thị Thu và cs, 2003). Những kết quả trong nghiên cứu này cũng khẳng định các chủng nghiên cứu khi được nuôi trong môi trường thay thế sinh tổng hợp mannanase cao hơn khi nuôi ở môi trường cơ bản, đặc biệt chủng A. awamori VTCC-F296 sinh tổng hợp mannanase (186 U/ml) cao gấp ba lần so với môi trường cơ bản (66 U/ml). KẾT LUẬN Chủng A. awamori VTCC-F296 có khả năng sinh tổng hợp mannanase tốt hơn chủng A. niger VTCC-F128 và chủng A. oryzae MN02. Môi trường thay thế cho các chủng nghiên cứu sinh tổng hợp mannanase cao là MTK (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl), 3% cám gạo, 0,4% urê, 0,5% guargum (chủng A. awamori VTCC-F296); MTK, 2% xơ dừa, 0,1% bột đậu tương, 0,3% guargum (A. niger VTCC-F128); MTK, 4% cám gạo, 0,2% urê, 0,7% guargum (A. oryzae MN02). LỜI CÁM ƠN Công trình có sự hỗ trợ kinh phí của Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực nông nghiệp và PTNT đến năm 2020, của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” 2007-2010. Nhóm tác giả chân thành cảm ơn TS Phạm Văn Hợp(Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc Gia Hà Nội) cung cấp chủng A. awamori VTCC-F296 và A. niger VTCC-F128 ; TS Lã Văn Kính (Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghệp Miền Nam) cung cấp chủng A. oryzae MN02. TÀI LIỆU THAM KHẢO Alan DE, Surekha A and Yuan CL, (1977). Purification and properties of a b-mannosidase from Aspergillus niger. J Biol Chem 6: p.2026 - 2031. Đặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm và Lại Thị Ngọc Hà (2003). Nghiên cứu thu nhận và một số đặc tính của mannanase từ Aspergillus awamori BK. In: Báo cáo KH, Hội nghị CNSH Toàn quốc 2003 Hà Nội 16- 17/12/2003, p 546 - 549. Đào Thị Tuyết, Đỗ Anh Vũ và Quyền Đình Thi, (2009). Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm mốc Aspergillus awamori VTCC-F296, A. niger VTCC-F128 và A. oryzae MN02 sinh tổng hợp mannanase. Tạp chí NN và PTNT (Đã gửi bài) Kansoh Al and Nagieb ZA, (2004). Xylanase and mannanase enzymes from Streptomyces galbus NR and their use in biobleaching of softwood kraft pulp. Antonie Van Leeuwenhoek 85: p.103 - 114. Kurakake M and Komaki T, (2001). Production of b-mannanase and b-mannosidase from Aspergillus awamori K4 and their properties. Cur Microbiol 42: p.377 - 380. Laemmli UK, (1970). Cleavage of structurê proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Naturê 227: p.680 - 685. Miller GL, (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 31: p.426 - 428. Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cường và Đặng Thị Thu, (2006). Endo-b-1,4-mannanse từ B. subtilis G1: Chọn chủng, xác định động thái sinh trưởng, nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa. Tạp chí Công nghệ sinh học 4: p.327 - 334. Wu G, Bryant MM, Voitle RA and Roland DAS, (2005). Effects of beta-mannanase in corn-soy diets on commercial leghorns in second-cycle hens. Poult Sci 84: p.894 - 897. *Người phản biện : GS.TS. Vũ Duy Giảng; GS. TS. Lê Văn Liễn