Báo cáo Khoa học Ứng dụng công nghệ enzyme để thu nhận đường chức năng fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mía

Bỏo cỏo khoa học: ứng dụng cụng nghệ enzyme để thu nhận đ-ờng chức năng fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mớa Tạp chí KHKT Nông nghiệp 2006: Tập IV, Số 6: 105-111 Đại học Nông nghiệp I ứng dụng công nghệ enzyme để thu nhận đ−ờng chức năng fructooligosaccharide (FOS) từ dịch mía Application of enzyme technology for fructooligosaccharides (FOS) production from sugarcane juice Ngô Xuân Mạnh1 và cộng sự Summary The aim of the present research was to study the use β – D fructofuranosidase (EC: 3.2.1.26) in enzyme preparation Pectinex Ultra SP-L (Novozymes) for Fructooligosaccharide (FOS) production. Enzyme preparation Pectinex Ultra SP-L (Novozymes) contains β – D fructofuranosidase with the activity 58.1 U/ml. Optimal conditions were selected: Temperature = 40oC, pH 5.6, 240 mn and ratio enzyme: sugarcane juice of 2 : 100 (v/v). The FOS syrup obtained using Pectinex Ultra SP-L has following composition: 50,4% FOS; 10.4% saccharose; 3.9% fructose and 35.3% glucose. Key words: Fructooligosaccharide (FOS), β – D fructofuranosidase, optimal temperature and pH, sugarcane juice 1. Đặt vấn đề Tr−ớc đây, con ng−ời th−ờng quan tâm nghiên cứu và sử dụng những sản phẩm thực phẩm giàu dinh d−ỡng và giá trị năng l−ợng cao. Trong những năm gần đây ngoài những sản phẩm thực phẩm trên, ng−ời ta còn tập trung vào những sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh d−ỡng và mức năng l−ợng thấp; nh−ng lại chứa các hoạt chất có tác dụng tốt đối với sức khỏe của con ng−ời - những thực phẩm chức năng (functional foods), trong số đó đ−ờng chức năng là một nhóm thực phẩm chức năng quan trọng (Gibson và William, 2000). Có nhiều loại đ−ờng chức năng nh−: đ−ờng panatinose, maltitol, sorbitol, lactitol, fructoolygosaccharide (FOS), xyloolygosaccharide, isomaltoolygosaccharide... Trong số đó, đ−ờng FOS đ−ợc nghiên cứu nhiều hơn cả không phải chỉ bởi công nghệ sản xuất đơn giản, vị ngọt thấp nh−ng vẫn giữ đ−ợc h−ơng thơm và vị ngọt đặc tr−ng của đ−ờng saccharose, quan trọng hơn là FOS có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe con ng−ời: có khả năng kích thích tiêu hóa, chống bệnh tiểu đ−ờng, là thành phần trong chế độ ăn kiêng phòng chống bệnh béo phì. Đặc biệt FOS còn giúp tăng khả năng hấp thu Fe, Mg, Ca, Cr... ngăn ngừa bệnh thiếu máu, thiếu sắt, cân bằng ion Mg2+, Ca2+ trong cơ thể, chống bệnh lo[ng x−ơng và bệnh sâu răng ở trẻ em (Gibson và William, 2000; Mazza, 1998). Đ−ờng FOS đ−ợc tìm thấy trong tự nhiên ở một số loại rau quả nh−: chuối, quất, mận, đào, cà chua, hành, tỏi, actiso... Đi liền với sự phát triển đó, công nghệ enzyme ngày càng đ−ợc sử dụng rộng r[i trong nhiều lĩnh vực. 1Khoa Công nghệ thực phẩm, Đại học Nông nghiệp I N−ớc ta là n−ớc có ngành công nghiệp mía đ−ờng khá phát triển, các vùng nguyên liệu mía phân bố khá rộng r[i (5 vùng sinh thái) trải rộng từ Bắc vào Nam. Do đó chúng ta sản xuất đ−ờng FOS từ nguyên liệu ban đầu là mía khá thuận lợi. Trong bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme pectinex để thu nhận đ−ờng chức năng FOS từ dịch mía. 2. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Vật liệu Dịch mía của giống mía chín trung bình F156 trồng trong vụ 2005 - 2006 đ−ợc sử dụng để nghiên cứu. Đ−ờng saccharose là loại đ−ờng trắng tinh luyện có hàm l−ợng 99,62%, có độ ẩm 0,05% và đ−ờng khử: < 0,05%. Chế phẩm enzyme pectinex Ultra SP-L (h[ng Novozymes, Đan Mạch) là chế phẩm dạng lỏng, màu nâu đen, đặc sánh, có mùi thơm đặc tr−ng, trong đó có chứa enzyme β-D- Fructofuranosidase đ−ợc sản xuất từ chủng aspergillus niger. 2.2. Ph−ơng pháp Tiến hành 4 đợt lấy mẫu mía ở 4 giai đoạn (thời điểm) khác nhau để kiểm tra thành phần đ−ờng trong dịch mía. Mỗi đợt tiến hành kiểm tra 3 mẫu để lấy kết quả trung bình. Hoạt tính của enzyme β-D Fructofuranosidase đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp do Seikagaku đề xuất (tham khảo tài liệu của Whitaker &cs, 2004), hàm l−ợng đ−ờng khử theo ph−ơng pháp Lane - Eynone (tham khảo tài liệu của Đặng Thị Thu & cs, 1997), hàm l−ợng đ−ờng theo ph−ơng pháp đ−ợc Nguyễn Văn Mùi mô tả (2001) và thành phần và hàm l−ợng đ−ờng trong sản phẩm FOS thu đ−ợc bằng ph−ơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống sắc ký HP 1100 (h[ng Aligence, Mỹ) tại Phòng phân tích và kiểm định chất l−ợng thực phẩm, Viện Công Nghiệp Thực Phẩm. Các loại đ−ờng trong mẫu chuẩn (Trung Quốc) và mẫu nghiên cứu đ−ợc phân chia trên cột sắc ký supelco Ca 30cm x 7,8mm ID (h[ng Supelco, Mỹ), tốc độ dòng chảy 1ml/min, Detector là Detector đo chỉ số khúc xạ - RI. 3. KếT QUả NGHIÊN CứU Và THảO LUậN 3.1 Xác định hoạt tính của enzyme β-D fructofuranosidase trong chế phẩm pectinex Ultra SP-L và hàm l−ợng đ−ờng saccharose trong dịch mía Để có định h−ớng sử dụng chế phẩm enzyme pectinex-Ultra SP-L, hoạt tính của enzyme β-D frutofuranosidase đ[ đ−ợc xác định. Số đơn vị hoạt tính trong 1ml dung dịch chế phẩm enzyme là 58,1 U/ml. Do chế phảm pectin ex Ultra SP-L chứa enzyme β-D frutofuranosidase, do đó có thể sử dụng chế phẩm này để thu nhận các fructooligosaccharide (FOS) từ đ−ờng saccharose. Hàm l−ợng 3 loại đ−ờng chính trong dịch mía thu đ−ợc trình bày ở bảng 1 Bảng 1. Thành phần đ−ờng trong dịch mía Đợt kiểm tra Saccharose (%w/w) Glucose (%w/w) Fructose (%w/w) 1 90,6 6,2 3,2 2 91,6 6,3 2,1 3 90,6 6,2 3,2 4 90,6 6,2 3,2 Trung bình 90,9 6,2 2,9 Số liệu của bảng 1 cho thấy thành phần đ−ờng trong n−ớc mía t−ơng đối đồng đều trên 4 mẫu n−ớc mía phân tích. Trong số 3 loại đ−ờng xác định, dịch mía chứa hàm l−ợng đ−ờng saccharose là chủ yếu (~ 90%). Ngoài ra dịch mía còn chứa đ−ờng glucose (~6%) và đ−ờng fructose (~3%). 3.2. Xác định điều kiện tối −u cho enzyme hoạt động ảnh h−ởng của nhiệt độ, pH và thời gian phản ứng đến hoạt tính của enzyme và khả năng vận chuyển đ−ờng fructose để tạo thành đ−ờng FOS đ[ đ−ợc nghiên cứu. Hình 1 cho thấy hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tạo FOS tăng dần từ nhiệt độ 25o- 400C và đạt cực đại tại giá trị nhiệt độ 400C với hàm l−ợng là 6,9%. Sau đó hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển giảm dần từ nhiệt độ 45- 500C. Điều đó chứng tỏ khả năng phản ứng thể hiện hoạt tính transferase của enzyme đạt cực đại tại giá trị nhiệt độ 400C. Hình 2 cho thấy khi giá trị pH tăng từ 4,5- 5,5, hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tạo FOS cũng tăng lên và đạt cực đại tại giá trị pH 5,5 với hàm l−ợng fructose chuyển hóa đạt 6,9%. Sau đó, khi tiếp tục tăng từ pH 5,5-7, hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển lại giảm xuống. Tại giá trị pH = 7 hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển chỉ bằng 09%. Tại giá trị pH 5,5 hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tạo FOS đạt giá trị cao nhất. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 25 30 35 40 45 50 H àm l− ợn g (% ) Fructose vận chuyển Nhiệt độ (0C) Hình 1. ảnh h−ởng của nhiệt độ đến khả năng vận chuyển Fructose 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 4,5 5 5,5 6 6,5 7 pH H àm l− ợ n g ( % ) Fructose vận chuyển Hình 2. ảnh h−ởng của pH đến khả năng vận chuyển Fructose 0 1 2 3 4 5 6 7 8 30 60 120 180 240 300 Thời gian (phút) H àm l− ợn g (% ) Fructose vận chuyển Hình 3. ảnh h−ởng của thời gian đến khả năng vận chuyển Fructose Hình 3 cho ta thấy thời gian phản ứng càng tăng thì hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tạo FOS càng tăng. Thời gian phản ứng tăng từ 30 đến 240 phút thì hàm l−ợng fuctose đ−ợc vận chuyển tạo FOS tăng cao trên 1%. Hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển ở mức thấp nhất là 0.3% ở 30 phút. Với thời gian từ 240 phút đến 300 phút thì hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tăng lên không đáng kể. Vì vậy, thời gian phản ứng của chế phẩm enzyme đ−ợc chọn là 240 phút. Lúc này, hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tạo FOS đạt 7,0%. Trên cơ sở các kết quả thu đ−ợc nhiệt độ 40oC, pH 5,5 và thời gian phản ứng 240 phút đ[ đ−ợc chọn cho phản ứng thu nhận đ−ờng FOS từ dịch mía. 3.2 ảnh h−ởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đ−ờng L−ợng chế phẩm enzyme bổ sung là một yếu tố rất quan trọng nhằm tăng khả năng thủy phân và vận chuyển, chất l−ợng và giá thành sản phẩm. Nếu bổ sung với l−ợng enzyme thấp thì khả năng thủy phân thấp, thời gian thủy phân kéo dài làm cho sản phẩm biến màu, chất l−ợng và thành phần đ−ờng biến đổi không nh− mong muốn. Ng−ợc lại nếu l−ợng chế phẩm enzyme bổ sung càng cao thì hiệu quả thủy phân cũng càng cao (đạt đến điểm cực đại). Tuy nhiên bổ sung enzyme trong quá trình sản xuất cần phải quan tâm đến giá thành của enzyme. Vì vậy để đảm bảo cả yếu tố kinh tế và yếu tố kỹ thuật phải chọn ra một tỷ lệ thích hợp giữa các yếu tố đó. Khi bổ sung enzyme với các l−ợng khác nhau từ 0,005 đến 0,04 và tiến hành phản ứng ở điều kiện: nhiệt độ: 400C, pH 5,5 và thời gian phản ứng 240 phút, l−ợng enzyme tăng thì hàm l−ợng fructose vận chuyển tạo FOS cũng tăng theo (bảng 2). Điều đó chứng tỏ hoạt tính transferase của enzyme cũng tăng khi nồng độ enzyme tăng. Khi l−ợng enzyme tăng từ 0,005 - 0,02 thì hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tạo FOS tăng từ 0,6% đến 6,9%. Nh−ng khi l−ợng enzyme tăng từ 0,02 đến 0,04 thì hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển chỉ tăng từ 6,9% đến 7,9% (=1%). Nh− vậy là hàm l−ợng fructose đ−ợc vận chuyển tăng rất chậm từ nồng độ ezyme trong khoảng này. Bên cạnh đó hàm l−ợng saccharose +FOS giảm dần theo chiều tăng của l−ợng enzyme, còn ng−ợc lại hàm l−ợng glucose tăng dần theo chiều tăng của l−ợng enzyme. Số liệu cũng cho thấy khả năng thủy phân của enzyme tăng dần khi tăng nồng độ enzyme. Kết quả thu đ−ợc ở bảng 2 cho phép chọn tỷ lệ enzyme/cơ chất: 2ml chế phẩm enzyme cho 100ml dịch mía trong quy trình sản xuất là hợp lý hơn đáp ứng yêu cầu về giá thành cho sản phẩm. Bảng 2. ảnh h−ởng của tỷ lệ chế phẩm Enzyme/cơ chất tới sự biến đổi thành phần đ−ờng Tỷ lệ enzyme/n−ớc mía (v/v) Saccharose+ FOS (%w/w) Glucose (%w/w) Fructose (%w/w) Fructose vận chuyển (%w/w) 0 90,6 6,2 3,2 0 0.005 85,7 9,0 5,3 0,6 0.01 82,2 11,7 6,1 2,6 0.015 80,1 13,9 6,0 4,8 0.02 73,5 18,2 8,2 6,9 0.025 73,4 18,4 8,1 7,2 0.03 71,7 19,5 8,8 7,6 0.035 70,6 20,1 9,3 7,7 0.04 69,7 20,6 9,7 7,9 3.3 Thành phần đ−ờng FOS có trong sản phẩm Thành phần và hàm l−ợng các loại đ−ờng có trong chế phẩm FOS đ[ đ−ợc xác định và định l−ợng (hình 4, 5 và bảng 3). Siro FOS thu nhận đ−ợc theo quy trình sản xuất trình bày ở sơ đồ 1 đ−ợc phân tích thành phần và hàm l−ợng các loại đ−ờng trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu đối chứng là đ−ờng FOS bán trên thị tr−ờng Trung Quốc. Số liệu bảng 3 và sắc ký đồ (hình 4 và 5) cho thấy hàm l−ợng FOS đạt giá trị cao nhất, chiếm 50,4%, hàm l−ợng fructose chiếm tỷ lệ thấp nhất 3,9%. Bên cạnh đó hàm l−ợng saccharose còn lại với tỷ lệ thấp (10,4%) và l−ợng glucose chiếm tỷ lệ khá cao (35,3%). Điều này chứng tỏ hiệu quả thủy phân và khả năng vận chuyển fructose của chế phẩm enzyme pectinex Ultra SP-L đạt tỷ lệ cao. Với hàm l−ợng fructose chiếm 3,9% cho thấy hiệu suất chuyển hóa rất cao. Minutes 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Vo lts 0.000 0.025 0.050 7. 97 5 FO S 8. 60 8 Su cr o se 9. 80 0 G lu co se 11 . 70 8 Fr u ct o se 15 . 15 8 RID Lanhuong SV DHNN 08.5.2006 x20lan Name Retention Time Mẫu kiểm tra Hình 4. Sắc ký đồ của đ−ờng FOS và các loại đ−ờng trong mẫu nghiên cứu Minutes 0 10 20 30 40 50 60 Vo lts 0.00 0.01 0.02 0.03 7. 97 5 Fo s 8. 60 8 su cr o se 9. 81 7 G lu co se 11 . 73 3 Fr u ct o se 15 . 10 0RID Lanhuong FOS 08.5.2006 Name Retention Time Mẫu chuẩn Hình 5. Sắc ký đồ của đ−ờng FOS chuẩn Điều kiện: Detector: RI Tốc độ dòng chảy: 1ml/phút Cột sắc ký: Sulpelco Ca, 30cm x 7.8mm ID Bảng 3. Thành phẩn và hàm l−ợng đ−ờngcó trong sản phẩm FOS Loại đ−ờng Hàm l−ợng (%) FOS 50,4 Saccharose 10,4 Glucose 35,3 Fructose 3,9 Ghi chú: Kết quả trên tính theo tổng các loại đ−ờng có trong mẫu (100%). Với việc sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L cho siro FOS có chất l−ợng t−ơng đ−ơng nh− đ−ờng FOS của Trung Quốc bán trên thị tr−ờng. 3.4. Quy trình sản xuất Trên cơ sở các kết quả thu đ−ợc, chúng tôi đề xuất quy trình sản xuất siro FOS từ n−ớc mía có sử dụng chế phẩm enzyme Pectinex Ultra SP-L nh− ở sơ đồ 1. Sơ đồ1. Quy trình sản xuất siro FOS từ n−ớc mía có sử dụng enzyme Pectinex Ultra SP-L 4. KếT LUậN Hoạt tính của Enzyme β-D fructofuranosidase có trong chế phẩm Pectinex Ultra SP- L là 58,1U/ml. Mía nguyên liệu Dung dịch n−ớc mía - Xử lý enzyme Pectinex Ultra SP-L. (Tỷ lệ enzyme: Dịch mía – 2: 100, T=40oC, pH 5,5, t=240 ph.) - Vô hoạt enzyme. - Lọc trong. Dung dịch Fructoolygosaccharide - Tẩy màu. - Cô đặc đến 700Bx Siro FOS 700Bx - Chọn và làm sạch - ép Các điều kiện cho việc xử lý enzyme Pectinex Ultra SP-L đ[ đ−ợc lựa chọn gồm: - Nhiệt độ thích hợp là 400C. - pH thích hợp là 5,5. - Thời gian phản ứng là 240 phút. - Tỷ lệ enzyme/n−ớc mía (200Bx) là 2ml/100ml dịch mía. Từ đó nghiên cứu đề xuất một quy trình sản xuất siro FOS từ n−ớc mía có sử dụng chế phẩm Pectinex Ultra SP-L với Siro FOS thành phẩm có thành phần và hàm l−ợng các loại đ−ờng là: đ−ờng FOS: 50,4%, saccharose: 10,4%, fructose: 3,9% và glucose: 35,3%. Tài liệu tham khảo Nguyễn Văn Mùi (2001). Thực hành hóa sinh học. Đại Học Quốc Gia Hà Nội. Đặng Thị Thu và CS., (1997). Thực hành hoá sinh công nghiệp. ĐHBK Hà Nội Gibson G.R & William C.M., (2000). Functional foods - Concept to product. Woodhead publishing Ltd. & CRC Press. 9 - 27 p. J.R.Whitaker, A.G.J.Voragen, D.W.S. Wong, (2004). Handbook of food Enzymology, 805 - 822p. Mazza G. Edt., 1998. Functional foods: Biochemical and processing aspects.Agriculture and agrifood, Canada, woodhead publishing Ltd..