Báo cáo Khoa học Đa hình gen mx và khả năng đáp ứng miễn dịch đặc thù đối với vaxin h5n9 của một số giống gà

VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010 66 ĐA HÌNH GEN Mx VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC THÙ ĐỐI VỚI VAXIN H5N9 CỦA MỘT SỐ GIỐNG GÀ Trần Xuân Hoàn*, Phạm Thị Phương Mai, Nguyễn Thị Quỳnh Châu, Trần Xuân Toàn Nguyễn Thị Nga, Phùng Đức Tiến, Vũ Chí Cương và Jean Charles Maillard Phòng thí nghiệm Trong điểm Tế bào động vật *Tác giả liên hệ: Trần Xuân Hoàn Phòng thí nghiệm trong điểm tế bào động vật Viện Chăn nuôi – Thụy Phương – Từ Liêm Hà nôi Tel: 0986.422.026; Email: hoantranvcn@yahoo.com ABSTRACT Mx gene polymorhisms and specific immune responses to H5N9 vaccination in some chicken breeds A total of 105 chickens of seven breeds: Ri, Ho, Mia, Dong Tao, Tre, H’Mong and Luong Phuong (15 chicken for each breed) was injected with BIOFLU H5N9 vaccine at 30 age days old. After 2; 4 and 8 weeks vaccination, antibody titers were determined by HI and ELISA. H’mong and Ho chickens presented an earlier and better immune response to the vaccination than other chickens. Luong Phuong chicken presented a latest immune response to the vaccination. To study the polymorphisms in the Mx gene, two pairs of primers were used for sequencing this gene in twenty chickens for each breed (15 vaccinated + 5 witnesses). Among 18 detected nucleotide substitutions, it was found that two of them can induce amino acid exchanges at positions 308 (Ile → Val) and 631 (Asp → Ser ).The rates of the resistant Mx allele (R) and sensitive allele (S) were different between chicken breeds. The association between Mx resistant allele and antibody titers was not significant (P > 0.2). However chickens having genotype GG388/RR2032 presented an ealier and better immune response to vaccination than those having genotypes AA388/SS2032 or AG388/SS2032. Key words: Mx gene polymorhisms ĐẶT VẤN ĐỀ Chọn lọc các giống có khả năng kháng bệnh sẽ đóng vai trò quan trọng để nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi, cũng như góp phần đảm bảo cho chăn nuôi bền vững. Vì vậy, nghiên cứu chọn lọc vật nuôi có khả năng kháng bệnh dựa vào chỉ thị ADN ngày càng được quan tâm. Theo Watanabe (2007) gen Mx của chuột có khả năng kháng virus được phát hiện ra khi chuột thí nghiệm được gây nhiễm bởi virus cúm. Các nghiên cứu tiếp theo trên gen Mx của các giống gà khác nhau tác giả cho biết gà mang gen Mx mã hóa Asn tại vị trí 631 có khả năng kháng virus, ngược lại nếu mã hóa Ser mẫn cảm với virus. Ko và cs (2002) cho biết gen Mx của một số giống gà có khả năng kháng được virus influenza và VSV ( vesicular stomatitis virus). Ko và cs (2004) phân tích gen Mx của gà cho thấy khả năng kháng virus phụ thuộc vào sự sai khác trình tự axit amin ở vị trí 631. Gà mang kiểu gen mã hóa axit amin Asn ở vị trí 631 có khả năng kháng virus, nhưng gà mang kiểu gen mã hóa Ser ở vị trí 631 mẫn cảm với virus. Seyama và cs (2006) sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP phân tích đa hình gen Mx của 36 dòng gà từ 17 giống cho thấy tỷ lệ alen Mx kháng virus và mẫn cảm tương ứng là 59,2% và 40,8%. Li và cs (2006) phân tích gen Mx của 15 giống gà địa phương của Trung Quốc và 4 dòng gà thương phẩm đã chọn lọc cho biết tần số alen kháng virus của các giống bản địa từ 0,72 – 0,95. Trong khi đó tần số alen này của 4 dòng gà thương phẩm thấp hơn rõ rệt, dao động từ 0,05 - 0,27. TRẦN XUÂN HOÀN – Đa hình gen Mx và khả năng đáp ứng miễn dịch ... 67 Do đó, nghiên cứu để xác định được mức độ đa hình gen Mx của một số giống gà nội và khả năng đáp ứng miễn dịch của chúng sẽ là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo phục vụ việc chọn lọc và lai tạo các giống gà có khả năng kháng bệnh, góp phần vào việc phát triển chăn nuôi gia cầm bền vững. VÂT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các giống gà: Ri, Hồ, Mía, H’mông, Tre, Đông Tảo, Lương phượng được nuôi riêng biệt từ đời bố mẹ. Sau đó gà con 21 ngày tuổi được lấy máu kiểm tra kháng thể trong huyết thanh và tách ADN làm nguyên liệu để xác định sai khác di truyền. Gà thí nghiệm được tiêm vacxin BIOFLU H5N9 ở 30 ngày tuổi, mỗi giống 15 con. Gà đối chứng không tiêm vacxin, mỗi giống 5 con. Sau khi tiêm vacxin 2, 4 và 8 tuần tuổi lấy huyết thanh của gà thí nghiệm và đối chứng để xác định hiệu giá kháng thể cúm gia cầm. Phương pháp nghiên cứu Hiệu giá kháng thể cúm gia cầm xác định theo phương pháp HI và ELISA tại trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương Phương pháp tách chiết ADN: Tách chiết ADN được thực hiện theo kít AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit của hãng Bioneer. Phương pháp giải trình tự gen Mx: Sử dụng hai cặp mồi Mx1 và Mx2 để nhân đặc hiệu đoạn ADN gen Mx ở gà. Kết quả PCR nhân đoạn ADN từ cặp mồi Mx1 và Mx2 có kích thước tương ứng là 450 bp và 738 bp. Trình tự cặp mồi Mx1 như sau: Mồi xuôi: 5′-GAATAGCAACTCCATACCGTG-3′ Mồi ngược: 5′-GTATTAAAGGTTGCTAATG-3′ Trình tự cặp mồi Mx2 như sau: Mồi xuôi: 5′-TGGCTGCAAAGAGACAATCA-3′ Mồi ngược: 5′-CTGGATTGTGGAGGTGAAGG-3′ Chu trình nhiệt: Giai đoạn 1: Biến tính ADN ở nhiệt độ 95oC trong 15 phút. Giai đoạn 2: Gồm 3 bước và lặp 30 chu kỳ. Nhiệt độ và thời gian tương ứng cho mỗi bước như sau: 94oC trong 45 giây; 60oC trong 90 giây; 72oC trong 90 giây. Giai đoạn 3: Kéo dài chuỗi ở nhiệt độ 72oC trong 15 phút, sau đó chuyển nhiệt độ về 4oC. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR: Sau khi chạy PCR để nhân đặc hiệu đoạn ADN của gen Mx chúng tôi tiến hành kiểm tra kết quả PCR bằng điện di. Sau đó, các mẫu được tinh sạch theo Purelink™ PCR Purification Kit của hãng Invitrogen Phản ứng sequencing: Sản phẩm PCR làm sạch được sử dụng là nguyên liệu cho phản ứng sequencing. Phản ứng sequencing được thực hiện theo BigDye Terminator V.3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng AB (Applied Biosystem). Phương pháp tinh sạch sau phản ứng sequencing: Tinh sạch sau phản ứng sequencing được thực hiện theo BigDye® XTerminator™- Purification Kit của hãng AB. VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010 68 Giải trình tự trên máy giải trình tự tự động: AB- 3130. Các phương pháp phân tích kết quả giải trình tự Sử lý số liệu thống kê theo phương pháp phân tích phương sai (ONE –WAY ANOVA) trên phần mềm MINITAB 14. Sau khi giải trình tự trên máy AB-3130 thu được các file kết quả, được đọc bởi phần mềm phân tích trình tự Sequencing Analysis version 5.2.0. Quá trình đọc trình tự sai khác, được thực hiện nhờ phần mềm Novosnp version 2.0.3 và Stadenpacker- PreGap4 version 1.5. Trình tự đột biến trong gen Mx đồng thời được so sánh trên KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khả năng đáp ứng miễn dịch của một số giống gà Gà sau 2, 4 và 8 tuần tiêm vacxin lấy huyết thanh để xác định kháng thể cúm gia cầm bằng phương pháp HI. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Hiệu giá kháng thể cúm của một số giống gà Giống gà Kháng thể sau khi tiêm vaxin, Log2 (Mean ) n 2 tuần n. 4 tuần n 8 tuần Gà Ri 15 1,87a 15 5,33a 14 6,21a Gà Hồ 15 4,00b 14 5,57a 14 5,50a Gà Mía 15 3,93b 15 5,60a 15 5,20b Gà Đông Tảo 15 2,53a 15 5,53a 15 5,73a Gà Tre 15 2,13a 15 5,07 a,b 14 5,71a Gà H’mông 15 4,07b 14 5,43a 14 5,71a Gà Lương Phượng 15 1,33a 15 3,53b 15 4,13b SEM - 0,42 - 0,39 - 0,36 a,b: P< 0,05 Bảng 1 cho thấy, gà H’mông và gà Hồ có lượng kháng thể sau 2 tuần tiêm vacxin cao hơn đáng kể so với các giống gà khác (P<0,05). Kết quả này cho thấy, gà H’mông và gà Hồ có khả năng đáp ứng miễn dịch sớm nhất trong 7 giống gà. Trong khi đó lượng kháng thể sau khi tiêm vacxin 4 tuần của 6 giống gà nội: Ri, Hồ, Mía, Đông Tảo, Tre, H’Mông đều lớn hơn 4 và cao hơn so với gà Lương Phượng. Hiệu giá kháng thể cúm ở các giống gà sau 4 tuần tiêm vaxin chứng tỏ các giống gà nội đã đáp ứng tốt với vaxin H5N9, nhưng gà Lượng Phượng chưa có khả năng đáp ứng với vacxin. Sau 8 tuần tiêm vacxin hiệu giá kháng thể của cả 7 giống gà đều lớn hơn 4, cho chúng ta thấy cả 7 giống đã đáp ứng tốt với vaxin H5N9. Tuy nhiên hiệu giá kháng thể cúm ở gà Lượng Phượng vẫn thấp nhất, và có sự sai khác đáng kể so với gà: Ri, Hồ, Đông Tảo, Tre và H’mông. Sự khác biệt về khả năng đáp ứng với vacxin BIOFLU H5N9 giữa gà nội và gà Lương Phượng phản ánh lên sự khác biệt di truyền đáp ứng miễn dịch giữa các giống gà. Để so sánh khả năng đáp ứng miễn dịch của 7 giống gà với vaxin H5N9, chúng tôi lập Đồ thị phản ánh sự biến đổi hiệu giá kháng thể theo thời gian. Kết quả trình bày trong Hình1. Hình 1 cho thấy, gà Lương Phượng có khả năng đáp ứng với vaxin H5N9 ở thời điểm khoảng 7,5 tuần sau khi tiêm vaxin. Như vậy 6 giống gà nội: H’Mông, Hồ , Mía, Đông Tảo, Ri và Tre không chỉ đáp ứng tốt với vaxin H5N9 mà còn có khả năng đáp ứng sớm hơn so với gà Lương Phượng. TRẦN XUÂN HOÀN – Đa hình gen Mx và khả năng đáp ứng miễn dịch ... 69 Hình 1: Sự biến đổi hiệu giá kháng thể cúm của các giống gà. Sự sai khác di truyền trong gen Mx của các giống gà So sánh với trình tự gen Mx của 7 giống gà với trình tự gen Mx của gà đã được công bố ( chúng tôi phát hiện ra có 18 điểm đa hình, nhưng trong đó chỉ có hai điểm đa hình tại các nucleotid 1062 và 2032 thuộc vùng ADN mã hoá ( cADN) làm thay đổi trình tự axít amin tương ứng ở vị trí 308 và 631. Hai điểm đa hình này cũng đã được phát hiện trên các giống gà khác nhau trong nghiên cứu của Ko và CS (2002). Tuy nhiên mức độ đa hình ở các giống là khác nhau. Kết quả trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Tần số của một số điểm đa hình trong gen Mx ở một số giống gà Vị trí nucleotide 1062 2032 Trình tự bộ ba mã hoá axít amin đã công bố GTA AGT Axit amin mã hoá Valine Serine Trình tự bộ ba mã hoá axít amin ở một số giống gà ATA AAT Axit amin mã hoá Isoleucine Asparagine Tần số alen A của gà Ri 0,375 0,500 Tần số alen A của gà Hồ 0,200 0,650 Tần số alen A của gà H’Mông 0,200 0,675 Tần số alen A của gà Đông Tảo 0,250 0,550 Tần số alen A của gà Tre 0,125 0,550 Tần số alen A của gà Mía 0,325 0,300 Tần số alen A của gà Lương Phượng 0,395 0,225 Bảng 2 cho thấy, điểm đa hình tại nucleotid 2032 có sự khác biệt đáng kể giữa các giống gà, đặc biệt là giữa gà Lương Phượng với các giống gà nội. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả gà có trình tự nucleotid A ở vị trí 2032 sẽ mã hóa axit amin Asn tại vị trí 631 có khả năng kháng virus (alen R có khả năng kháng virus), nhưng nếu nucleotid G thay thế cho nucleotid A ở vị trí 2032 dẫn đến axit amin Ser thay thế Asn (alen S mẫn cảm với virus) thì gà sẽ mẫn cảm với virus (Ko và cs, (2002, 2004), Seyama và cs, (2006), Watanabe, (2007). VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010 70 Kết quả trình bày trong Bảng 1 cho thấy, sự đáp ứng miễn dịch của các giống gà theo thời gian là khác nhau, và mức độ đa hình nucleotid tại vị trí 2032 cũng khác nhau giữa các giống gà. Tuy nhiên trong số 16 điểm đa hình trong vùng không mã hoá axít amin chúng tôi nhận thấy tần số điểm đa hình tại nucleotid ở vị trí 388 trong intron 5 (Theo Li và cs, (2006) DQ788615) , cũng có sự khác biệt đáng kể giữa gà Lương Phượng và các giống gà nội. Do đó, để đánh giá ảnh hưởng của đa hình nucleotid đến khả năng đáp ứng miễn dịch của các giống gà chúng tôi tiến hành so sánh sự sai khác trình tự của hai nucleotid ở vị trí 388 và 2032 trong số gà đã được tiêm vaxin H5N9 và tìm mối liên quan với hiệu giá kháng thể của chúng. Tần số alen của gen Mx tại hai nucleotid ở vị trí 388 và 2032 được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3. Tần số alen của gen Mx ở một số giống gà được tiêm vacxin Giống gà n Tại nucleotid 388 Tại nucleotid 2032 G A Alen R Alen S Gà Ri 15 0,87 0,13 0,50 0,50 Gà Hồ 15 0,93 0,07 0,60 0,40 Gà H’Mông 15 0,90 0,10 0,60 0,40 Gà Đông Tảo 15 0,97 0.03 0,53 0,47 Gà Tre 15 1,00 0 0,67 0,33 Gà Mía 15 1,00 0 0,30 0,70 Gà Lương Phượng 15 0,67 0,33 0,17 0,83 Bảng 3 cho thấy, tần số alen R có khả năng kháng virus có sự khác nhau giữa các giống gà. Các giống gà nội đều có tần số alen R cao hơn so với gà Lương Phượng. Trong khi đó tần số nucleotid G tại vị trí 388 của gà Lương phượng là thấp nhất. Có thể sự sai khác di truyền này dẫn đến sự sai khác về khả năng đáp ứng miễn dịch giữa các giống gà. Để đánh giá ảnh hưởng của từng điểm đa hình đến khả năng đáp ứng miễn dịch, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể cúm của gà mang các trình tự nucleotid khác nhau tại hai điểm đa hình. Hiệu giá kháng thể của gà mang alen R và S được trình bày trong Bảng 4. Bảng 4. Hiệu giá kháng thể của gà mang các alen gen Mx khác nhau Alen Kháng thể sau khi tiêm vacxin, Log2 (Mean ) n 2 tuần n 4 tuần n 8 tuần Alen R 66 2,96 64 5,30 62 5,58 Alen S (Đồng hợp) 39 2,64 39 4,90 39 5,23 SEM 0,29 0,32 0,21 P 0,46 0,25 0,26 Bảng 4 cho thấy, hiệu giá kháng thể của gà mang kiểu gen đồng hợp tử SS mẫn cảm với virus ở cả 3 thời điểm 2 tuần, 4 tuần và 8 tuần sau khi tiêm vaxin đều thấp hơn so với gà mang alen R. Tuy nhiên, sự sai khác này không rõ rệt (P>0,05). Kết quả này cho thấy khả năng alen R có mối liên kết với khả năng đáp ứng với vaxin H5N9 của gà. Tần số nucleotid G tại vị trí 388 trong intron 5 của gen Mx của gà Lương Phượng là thấp nhất. Để tìm mối liên két giữa nucleotid G với khả năng đáp ứng với vaxin, chúng tôi tiến hành so sánh hiệu giá kháng thể của gà có kiểu gen Mx khác nhau vị trí 388. Kết quả được trình bày tại Bảng 5. TRẦN XUÂN HOÀN – Đa hình gen Mx và khả năng đáp ứng miễn dịch ... 71 Bảng 5. Hiệu giá kháng thể của gà có các kiểu gen Mx khác nhau Tại nucleotid 388 Kháng thể sau khi tiêm vacxin, Log2 (Mean ) Kiểu gen n 2 tuần n 4 tuần n 8 tuần GG388 88 2,94 86 5,31 85 5,51 (AA+ AG)388 16 2,19 16 4,19 16 5,19 SEM 0,27 0,24 0,19 P 0,189 0,016 0,441 Bảng 5 cho thấy, gà mang kiểu gen GG388 có khă năng đáp ứng với vacxin H5N9 tốt hơn so với gà mang kiểu gen AA388 hoặc AG388, đặc biệt ở thời điểm 4 tuần sau khi tiêm vacxin, sự khác biệt về hiệu giá kháng thể là đáng kể giữa hai nhóm gà. Kết quả trên cho thấy, trong 18 điểm đa hình đã được phát hiện trong gen Mx, có hai điểm đa hình tại các nucleotid 388 trong intron 5 và 2032 trong vùng mã hoá, mang tính đặc thù của gà Lương Phượng, và mỗi điểm đa hình trong hai điểm đa hình này có mức độ ảnh hưởng khác nhau đến hiệu giá kháng thể của gà. Để đánh giá mức độ ảnh hưởng đồng thời của hai điểm đa hình này đến khả năng đáp ứng miễn dịch của gà, chúng tôi so sánh hiệu giá kháng thể của gà có các kiểu gen khác nhau tại hai điểm đa hình. Kết quả trình bày trong Bảng 6. Bảng 6. Hiệu giá kháng thể của gà có các kiểu gen Mx khác nhau Kiểu gen Kháng thể sau khi tiêm vacxin, Log2 (Mean ) Tại nucleotid 388 Tại nucleotid 2032 n 2 tuần N 4 tuần N 8 tuần GG388 RR2032 27 2,48 27 5,22 26 5,31 (AA+AG)388 SS2032 10 1,10 10 3,20 10 4,60 SEM 0,46 1,01 0,32 P 0,091 0,008 0,206 Sau 4 tuần tiêm vaxin gà mang kiểu gen AA388/SS2032 và AG388/SS2032 có hiệu giá kháng thể 3,20 ( dưới ngưỡng 4), chứng tỏ gà chưa có khả năng đáp ứng với vaxin. Bảng 6 cho thấy gà mang kiểu gen GG388/RR2032 có khả năng đáp ứng với vaxin H5N9 sớm hơn và tốt hơn gà mang kiểu gen AA388/SS2032 và AG388/SS2032. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Gà Hồ và gà H’Mông đáp ứng sớm hơn với vaxin H5N9 so với các giống gà Mía, Tre, Ri, Đông Tảo và Lương Phượng. Các giống gà nội đều có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt hơn và sớm hơn so với gà Lương Phượng. Đã phát hiện được 18 điểm đa hình nucleotid khác nhau của gen Mx, trong đó có hai điểm làm thay đổi trình tự axít amin ở các vị trí 308 và 631. Tần số alen R có khả năng kháng và alen S mẫn cảm với virus của gen Mx giữa các giống gà là khác nhau. Hiệu giá kháng thể cúm ở gà mang alen R của gen Mx có khả năng kháng virus cao hơn gà mang alen S dạng đồng hợp tử mẫn cảm với virus ở cả ba thời điểm 2; 4 và 8 tuần sau khi tiêm vaxin, tuy nhiên sự sai khác là không rõ rệt. Gà mang trình tự nucleotid G dạng đồng hợp tử tại vị trí 388 trong intron 5 có khả năng đáp ứng tốt hơn với vaxin H5N9 so với gà mang trình tự A sau 4 tuần tiêm vaxin. Gà mang kiểu gen GG388/RR2032 có khả năng đáp ứng sớm và tốt hơn với vaxin H5N9 so với gà mang kiểu gen AA388/SS2032 và AG388/SS2032. VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 22-Tháng 2 - 2010 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ko J., H. Hee-Kyung Jin., Atsushi Asano., Ayato Takada., Ai Ninomiya., Hiroshi Kida., Hironao Hokiyama., Mutsuo Ohara., Masaoki Tsuzuki., Masahide., Nishibori., Makoto Mizutani and Tomomasa Watanabe (2002): “Polymorphisms and the Differential Antiviral Activity of the Chicken Mx Gene” Genome Res. 12: pp.595-601. Ko J.H., A. Takada., T. Mitsuhashi., T. Agui and T. Watanabe (2004): ” Native antiviral specificity of chicken Mx protein depends on amino acid variation at position 631” . Animal Genetics . 35: pp.119-122. Li X.Y., L. J. Qu., J. F. Yao and N. Yang (2006): ” Skewed Allele Frequencies of an Mx Gene Mutation with Potential Resistance to Avian Influenza Virus in Different Chicken Populations”. Poultry Science 85: pp.1327-1329. Li X.Y., Qu L.J., Yao J. F., Hou Z.C and Yang N (2006): ” Genomic structure and variation of chicken MX gene.” Genbank: DQ788615 Seyama T. J., H. Ko., M. Ohe., N. Sasaoka., A. Okada., H. Gomi., A. Yoneda., J. Ueda., M. Nishibori., S. Okamoto.,Y. Maeda. and T. Watanabe (2006): “Population Research of Genetic Polymorphism at Amino Acid Position 631 in Chicken Mx Protein with Differential Antiviral Activity.”Biochemical Genetics volume 44 ( Nos.9/10): pp.437-447. Watanabe T. (2007):” Polymorphisms of the chicken antiviral MX gene”. Cytogenet Genome Res 117: pp.370– 375. *Người phản biện: TS..Phạm Doãn Lân; Ths. Nguyển Trọng Bình