Báo cáo Cây dừa cạn Catharanthus roseus và nhóm hợp chất Vinca alkaloid

MỤC LỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Tra cứu các bảng Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến sự nuôi cấy huyền phù tế bào 57 Phụ lục 2: Tra cứu các hình Hình 1 : 1. Cành đang nở hoa; 2.Quả; 3.Hạt 8 Hình 2: Hạt của cây C.roseus 9 Hình 3: Ba giống C.roseus 10 Hình 4: Công thức hóa học của leurosidine, vincristine, vinblastine, leurosine, catharine, vinamidine 18 Hình 5: Công thức hóa học của ajmalicin 18 Hình 6: Công thức hóa học của vinflunine 19 Hình 7: Công thức hóa học của vinblastine 19 Hình 8: Công thức hóa học của vincristine 20 Hình 9: Con đường chuyền hóa thành vinblastine và vincristine 22 Hình 10: Con đường sinh tổng hợp Vinblastine 23 Hình 11: Quá trình sinh tổng hợp vincristine từ vinblastine 24 Hình 12: Cơ chế ức chế sự hình thành cấu trúc vi ống của vinca alkaloid 26 Hình 13: Cấu trúc hóa học của vinblastine sulfate 28 Hình 14: Sản phẩm và cấu trúc hóa học của vincristine sulfate 30 Hình 15: Sơ đồ quá trình chiết tách bằng SFE 34 Hình 16: Bình Soxhlet 34 Hình 17: Sơ đồ một bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước 36 Hình 18: Sản phẩm mô sẹo và cây mọc từ hạt nhân tạo 54 Hình 19: Sản phẩm rễ tơ 55 Phụ lục 3: Tra cứu các đồ thị Đồ thị 1: Đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trường có bổ sung các nồng độ đường khác nhau 58 GIỚI THIỆU Dừa cạn Catharanthus roseus. G. Don thuộc họ Trúc đào Apocynaceae là một trong những loại cây cảnh phổ biến đồng thời cũng là một loại dược thảo dân gian. Người ta đã khám phá ra được khả năng chữa bệnh của loại cây này là nhờ nó chứa nhiều loại hợp chất alkaloid. Từ dừa cạn người ta có thể chiết được chất chữa ung thư như vinblastine, vincristine và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin. Hiện nay, nhu cầu về C.roseus trên thế giờ rất cao, nhưng thực tế, trong điều kiện tự nhiên sự nhân giống C.roseus bằng con đường sinh sản hữu tính rất chậm và còn phụ thuộc nhiều vào môi trường. Mặt khác, lượng alkaloid thu được từ tự nhiên là rất thấp nên không đáp ứng được nhu cầu thị trường. Vì vậy em chọn đề tài “Cây dừa cạn Catharanthus roseus và nhóm hợp chất Vinca alkaloid” với mục đích là tìm hiểu về dược tính, cách thu nhận và ứng dụng của nó hiện nay. Nhờ có giá trị dược tính nên C.roseus đã trở thành đối tượng của nhiều nghiên cứu sinh học. Những nghiên cứu này chủ yếu liên quan tới điều kiện nuôi cấy in vitro của những cơ quan, mô và tế bào khác nhau, quá trình tách những indole alkaloid và xác định cấu trúc hóa học của nó cũng như quá trình sinh tổng hợp và hóa tổng hợp của nó. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Catharanthus Giống Catharanthus (thuộc họ trúc đào Apocynaceae) gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm. Trong số đó chỉ có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các loài còn lại có nguồn gốc từ Madagascar. Số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các loài Catharanthus đều là 2n=16. Tám loài thuộc giống này đó là: Catharanthus coriaceus Markgr. Madagascar. Catharanthus lanceus (Bojer ex A.DC.) Pichon. Madagascar. Catharanthus longifolius (Pichon) Pichon. Madagascar. Catharanthus ovalis Markgr. Madagascar. Catharanthus pusillus (Murray) G. Don. India subcontinent. Catharanthus roseus (L) G. Don. Madagascar. Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon. Madagascar. Catharanthus trichophyllus (Baker) pichon. Madagascar Những giống Catharanthus có nguồn gốc từ Madagascar thường được trồng để làm cảnh. Được biết đến nhiều nhất đó là loài Madagascar Periwinkle hay còn gọi là Vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ngoài việc được biết đến như một loại cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loại thuốc chống đái tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau lành, chống viêm mắt, làm se da….và ngày nay người ta còn tìm ra được một công dụng hết sức quan trọng của loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả.[6] Catharanthus roseus (L).G.Don [1] Tên gọi Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea Reich. Tên khác: bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân hoa, phjắc pót đông (Tày), dương giác, Madagascar periwinkle Họ: Trúc đào (Apocynaceae). Đặc điểm thực vật Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc thành bụi dày. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp nhọn, dài 4-6cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt. Hoa trắng hoặc hồng, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn. Quả gồm 2 đại, dài 2-4cm, rộng 2-3cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm. 3 2 1 Hình 1 : 1. Cành đang nở hoa; 2.Quả; 3.Hạt Hình 2: Hạt của cây C.roseus Phân bố Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagascar. Loài dừa cạn được di nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào giữa thế kỷ 18, dừa cạn được trồng ở Paris, sau đó có mặt ở nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên. Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc. Phân loại [6] Catharanthus roseus G.Don. là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole được cô lập từ 3 giống cây khác nhau: ‘roseus’ với hoa màu tím hoặc hồng. ‘albus’ với hoa màu trắng. ‘ocellatus’ với hoa màu trắng nhụy đỏ. Trong đó hoa màu đỏ tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất. Hình 3: Ba giống C.roseus Trồng trọt và thu hoạch Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt, khi được cung cấp đầy đủ điều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên. Cây mọc từ hạt trong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu được xử lý có thể tăng lên 90% [9]. Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4-5 tháng. Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm. Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên. [1] Vào năm 1970, Viện Dược Liệu đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng dừa cạn trên quy mô sản xuất. Cây được nhân giống bằng hạt, mỗi hecta cần gieo 500-700gr hạt trong vườn ươm. Thời vụ gieo hạt vào tháng 9-10 hoặc tháng 1-2. Cần ngâm hạt 3-4 giờ, vớt ra để ráo rồi gieo lên luống vườn ươm đã được chuẩn bị kỹ. Sau đó phủ rơm rồi tưới nước. Sau khoảng một tuần, hạt nảy mầm, cần tháo bỏ rơm rạ. Khi cây có 3-4 đôi lá thật (khoảng 40-45 ngày sau khi gieo) đánh đi trồng. Có thể gieo thẳng nhưng cách này tốn công chăm sóc. [1] Dừa cạn ưa đất pha cát, đất phù sa, hơi chịu hạn nhưng kém chịu úng. Đất cần làm kỹ, lên luống cao 20cm, mặt luống rộng 50-60cm, dung 10-15 tấn phân chuồng hoai mục và 120-150 kg super lân để bón lót. Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau khi trồng cần tưới ngay để cây mau bén rễ. Tưới thúc cho mỗi hecta 100-200kg ure, tưới 2 lần, cách nhau 1 tháng. Mặc dù cây chịu được hạn nhưng phải giữ đủ ẩm thường xuyên. Chú ý thoát nước nhanh sau khi mưa lớn. Khi mới trồng, cây thường bị sâu bám phá hoại. Cây trong vườn có thể bị Phytophthora làm cho chết hàng loạt. Cần tỉa bớt cho đất thoáng và phun phòng bằng Boxdeaux. [1] Sau khi trồng 3-4 tháng, cây cho thu hoạch, cành mang lá dài 10-15cm được cắt về phơi sấy khô. Ở đất thoát nước và chăm bón tốt có thể thu hoạch nhiều lứa. Trung bình 1 hecta thu được 1-1,2 tấn lá khô mỗi lứa. Ta có thể thu rễ để chiết ajmalicin. Một số công dụng chủ yếu Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da. Ở Nam Châu Phi, Ấn Độ, châu Úc, quần đảo Antilles người dân dùng trị bệnh đái tháo đường. Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ. Chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và dẫn đến sự phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 alkaloid khác cũng có tác dụng chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin. Ngoài ra người ta còn phát hiện ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và vindolidin. Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào những năm 1960 ở Mỹ, Pháp và một số nước khác, tuy nhiên có nhiều ý kiến khác nhau. Mặc dù vậy, vì hiện nay chưa có loại thuốc nào khác tốt hơn, nên như cầu về dừa cạn vẫn cứ tăng lên. Cũng vì mục đích chữa các khối u nên khi mua dừa cạn, người ta đặc biệt chú ý tới hàm lượng alkaloid toàn phần, và trong số alkaloid toàn phần ấy có hàm lượng vincaleucoblastin là bao nhiêu.[1][6] CHƯƠNG 2: CÁC HỢP CHẤT ANKALOID TRONG CÂY C.roseus Alkaloid trong loài Catharanthus roseus C.roseus đã thu được rất nhiều sự quan tâm từ công nghiệp dược phẩm, có khoảng 70 loại alkaloid hữu ích đã được phát hiện (G.H.Svobda và cộng sự (1991). Trong đó chiếm nhiều nhất là hai loại alkaloid vinblastine (vincaleukoblastine) và vincristine (leurocristine).[1] Alkaloid 2.1.1.1 Khái niệm Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base. Thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu. Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê.[7] 2.1.1.2 Phân loại Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử. Khi không biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng được gộp nhóm theo tên của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi khi còn được gọi là các “phenanthren”. Hay gọi tên dựa theo nhóm động/thực vật mà từ đó người ta chiết xuất ra các alkaloid ví dụ như các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid. Khi người ta biết nhiều hơn về một alkaloid cụ thể nào đó, thì việc gộp nhóm thường lấy theo tên gọi của amin quan trọng về mặt sinh học và nổi bật nhất trong tiến trình tổng hợp. Các nhóm ankaloid hiện nay gồm có: Nhóm pyridin: piperin, coniin, trigonellin, arecaidin, guvacin, pilocarpin, cytisin, nicotin, spartein, pelletierin. Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin . Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnin, brucin, veratrin, cevadin Nhóm isoquinolin: Các alkaloid gốc thuốc phiện như : morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, sanguinarin, narcein, hydrastin, berberin Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin Nhóm indol: Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin. Các ergolin: Các ancaloit từ ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamin, acid lysergic. Các beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin. Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin. Nhóm purin: Các xanthin ( caffein, theobromin, theophyllin). Nhóm terpenoit: Các alkaloid aconit: aconitin. Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn): muscarin, cholin, neurin. Các vinca alkaloid: Vinblastin, vincristin….. Tính chất của các alkaloid Tính chất vật lý Phân tử lượng: khoảng 100-900. Các alkaloid không chứa các nguyên tử ôxy trong cấu trúc thông thường là chất lỏng ở điều kiện nhiệt độ phòng (ví dụ nicotin, spartein, coniin). Các alkaloid với các nguyên tử ôxy trong cấu trúc nói chung là các chất rắn kết tinh ở điều kiện nhiệt độ phòng (ví dụ: berberin). Hầu hết alkaloid base gần như không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, eter, các alcol dây carbon ngắn. Một số alkaloid do có thêm nhóm phân cực như –OH, nên tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm (Morphin, Cephalin). Ngược lại với base, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và alcol, hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Có một số ngoại lệ như Ephedrin, Colchixin, Ecgovonin các base của chúng tan được trong nước, đồng thời cũng khá tan trong dung môi hữu cơ, còn các muối của chúng thì ngược lại. Alkaloid có N bậc 4 và N- oxid khác tan trong nước và trong kiềm, rất ít tan trong dung môi hữu cơ. Các muối của chúng có độ tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra chúng. Tính chất hóa học Alkaloid là các base yếu, đa số làm xanh giấy quỳ tím. Với acid thường tạo muối tan trong nước và kết tinh. Tính kiềm phụ thuộc vào khả năng sẵn có của các cặp điện tử đơn độc trên nguyên tử nitơ & và kiểu khác (dị) vòng cùng các phần thay thế. Tính base giảm dần theo thứ tự muối amoni bậc 4, amin bậc 1, amin bậc 2, amin bậc 3. Muối của alkaloid rất bền, nhưng chúng bị phân hủy bởi tia sáng mặt trời hoặc tia tử ngoại. Phần đông alkaloid có vị đắng . Tạo tủa với các dung dịch acid phosphotungstic, phosphomolipdic, picric… Ngoài tính base, các alkaloid có phản ứng tương tự nhau như đối với một thuốc thử, gọi tên chung là các thuốc thử alkaloid. Alkaloid trong catharanthus [1] Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0.37-1.15%, thân 0.40%, rễ chính 0.7-2.4%, rễ phụ 0.9-3.7%, hoa 0.14-0.84%, vỏ quả 1.14%, hạt 0.18%. Có khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ Catharanthus roseus. Trong số đó đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric, là những nhóm có hoạt tính chống ung thư, bao gồm vincristine và vinblastine. Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0.013-0.063%, ở bộ phận trên mặt đất 0.0015%, ở rễ 0.23%. Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không có vinblastine. Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0.0003-0.0015%. Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0.7-1.2% alkaloid toàn phần, cao nhất ở Phú Yên (1.21-1.62%). Vinblastine có với hàm lượng 1.6-2 phần vạn ở lá. Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch. Theo Lê Thị Tuyết Anh và cộng sự, hàm lượng alkaloid toàn phần ở cây dừa cạn thu thập hoang dại ở Phú Yên đạt cao nhất là 0.892-0.982% ở lá và 1.38-1.445% ở rễ vào mùa khô. Ngoài hai alkaloid chính là vinblastine và vincristine được chiết xuất, nhiều tác giả đã bán tổng hợp được vinblastine từ cathanthin và vindolin có ở dừa cạn và vincristine (có với hàm lượng thấp) từ vinblastine (có với hàm lượng cao hơn). Mai Ngọc Tâm và cộng sự, 1997 đã chứng minh rễ dừa cạn ở vùng Nha Trang chứa ajmalicin 0,18%, serpentin 0,27%, tetrahydroalstonin, tabersonin, lochnericin, catharanthin và akuamin. Nhiều tác giả khác (Phạm Thanh Kỳ và cộng sự, 1995; Trần Văn Thanh và cộng sự, 1996 và 1999) đã chiết xuất ajmalicin từ rễ dừa cạn. Trần Văn Thanh và cộng sự, 1996 và 1999 đã chiết xuất alkaloid toàn phần từ rễ, làm giàu ajmalicin bằng phương pháp hydro hóa serpentin, sau đó mới chiết xuất ajmalicin, tạo hiệu suất chiết xuất cao hơn gấp 2 lần. Vì những alkaloid này chỉ là thành phần nhỏ của cây (vincristine thu được từ cây thuốc thô chỉ đạt hiệu suất 0,0002%), vì vậy nếu muốn sản xuất thì ta phải cần số lượng rất lớn nguyên liệu thô để trích ly. Hình 4: Công thức hóa học của leurosidine, vincristine, vinblastine, leurosine, catharine, vinamidine Hình 5: Công thức hóa học của ajmalicin Hình 6: Công thức hóa học của vinflunine Các vinca alkaloid chính Vinbastine 2.2.1.1 Công thức Hình 7: Công thức hóa học của vinblastine Công thức phân tử: C48H58N4O9 Tên hóa học: dimethyl (2β,3β,4β,5α,12β,19α)- 15-[(5S,9S)- 5-ethyl- 5-hydroxy- 9-(methoxycarbonyl)- 1,4,5,6,7,8,9,10-octahydro- 2H- 3,7 methanoaza- cycloundecino[5,4-b]indol- 9-yl]- 3-hydroxy- 16-methoxy- 1-methyl- 6,7-didehydroaspidospermidine- 3,4-dicarboxylate Tên gọi khác: vincaleukoblastine Tên thương mại: Cytoblastin Đặc điểm Là tinh thể hình kim (kết tinh từ methanol), điểm chảy 211-2160. Không tan trong nước, ether dầu hỏa, tan trong alcol, aceton, ethyl acetat, chloroform. [1] Hấp thu: Vinblastine hấp thu nhanh chóng theo đường tiêm tĩnh mạch. Phân bố: thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể. Thuốc liên kết nhiều với protein huyết tương. Vinblastine ít qua hàng rào máu não và không đạt nồng độ điều trị trong dịch não tủy. Chuyển hóa: Vinblatine được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan để thành desacetyl vinblastine là chất có hoạt tính mạnh hơn vincristine, tính trên cơ sở khối lượng. Thải trừ: thuốc thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không biến đổi. Vincristine Công thức Hình 8: Công thức hóa học của vincristine Công thức phân tử: C46H56N4O10 Tên hóa học: methyl (1R,9R,10S,11R,12R,19R)- 11-(acetyloxy)- 12-ethyl- 4-[(13S,15S,17S)- 17-ethyl- 17-hydroxy- 13-(methoxycarbonyl)- 1,11 diazatetracyclo [13.3.1.04,12.05,10]nonadeca- 4(12),5,7,9-tetraen- 13-yl]- 8-formyl- 10-hydroxy- 5-methoxy- 8,16-diazapentacyclo [10.6.1.01,9.02,7.016,19] nonadeca- 2,4,6,13-tetraene- 10-carboxylate Tên gọi khác: leurocristine Tên thương mại: Oncovin, Vincasar, Vincrex và cũng có thể gọi là sunlfat vincristine. Đặc điểm Là tinh thể hình phiến, điểm chảy: 218-2200 Phân bố: sau khi tiêm, vincristine nhanh chóng phân bố vào các mô cơ thể và gắn với các yếu tố máu đã hình thành, đặc biệt là hồng cầu và tiểu cầu. Vincristine không xâm nhập hệ thần kinh trung ương với mức độ đáng kể. Chuyển hóa và bài tiết: vincristine được chuyển hóa nhiều ở gan. Con đường thải trừ chính là qua đường mật đi ra phân. Một phần ba liều dùng có thể được phục hồi trong phân trong vòng 24 giờ đầu và hai phần ba trong vòng 72 giờ. Chỉ có 12% liều được bài tiết qua thận. Khoảng một nửa liều được phục hồi trong phân và nước tiểu dưới dạng chất chuyển hóa Sinh tổng hợp [6] Vinblastine và vincristine được tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole), cả hai đều xuất hiện tự do trong cây. Vincristine cũng có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline. Hình 9: Con đường chuyền hóa thành vinblastine và vincristine Những alkaloid này được hình thành bởi sự kết hợp của hai nửa: một nửa là indole và một nửa là dihydroindole. Vì thế, chúng được biết đến với tên gọi là “dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid”. Sự khác nhau của Catharanthus alkaloid phụ thuộc vào loại alkaloid terpenoid indole. Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển hóa riêng biệt- quá trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan; và nửa tryptophan nhận được từ quá trình tryptophan. Cấu trúc phức tạp của những alkaloid này luôn có mặt hai nguyên tử nitơ. Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn từ tryptophan). Và nguyên tử nitơ thứ hai được tạo thành từ sự tách rời của hai carbon tại vị trí β của vòng indole. Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ acid mevalonic và nó là một C10-geraniol (monoterpenoid). Geraniol được tạo thành , thông qua một chuỗi chuyển hóa sẽ chuyển thành dạng loganin và sau đó là secologanin (một monoterpenoid glucoside). Chìa khóa trung gian trong thuyết phát sinh sinh học của những alkaloid monoterpene indole là 3α (S)-strictosidine, tạo thành từ sự ngưng hoạt tính enzyme của trytamine và secologanin. Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng quan trọng này là strictosidine synthase. Strictosidine sau đó sẽ hình thành cấu trúc cathenamine (alkaloid loại coryanthe). Enzyme liên quan ở đây là cathenamine synthase. Cathenamine sao đó phải trải qua một chuỗi các phản ứng để dẫn đến sự hình thành catharanthin (alkaloid loại iboga) và vindoline (alkaloid loại aspidosperma). Catharanthine và vindoline là các alkaloid monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây. 3’,4’-Anhydrovinblastine là chìa khoa trung gian từ sự ghép nối của catharanthine và vindoline và các enzyme liên quan là những peroxidase. Sau đó nó được chuyển thành vinblastine. Hình 10: Con đường sinh tổng hợp Vinblastine Vinblastine được tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole) Mặc dù nhu cầu sử dụng vincristine nhiều hơn so với vinblastine nhưng cây lại sản xuất tỷ lệ vinblastine nhiều hơn. May mắn thay, giờ đây ta có thể biến đổi vinblastine thành vincristine bằng phương pháp hóa học hay thông qua phương pháp vi sinh học “microbiological N-demethylation” sử dụng Streptomyces albogriseolus. Hình 11: Quá trình sinh tổng hợp vincristine từ vinblastine Tác dụng dược lý [1], [5], Vinblastine hay còn gọi là vincaleucoblastine, là một chất ức chế cấu trúc vi ống. Vinblastine được đồng ý đưa vào điều trị bởi tổ chức Food and Drug Administration (FDA) năm 1961 và đã trở thành một thành phần chính của phương pháp hóa trị liệu điều trị các tế bào mầm của tế bào ung thư, khối u ác tính và một số loại lymphoma cấp cao, bao gồm u lymphoma Hodgkin, u lymphoma không Hodgkin, u sùi dạng nấm, tế bào ung thư phổi nhỏ, ung thư vú, ung thư tinh hoàn tiến triển, bướu thịt Kaposi, bệnh mô bào huyết, ung thư nhau, chriocarcinoma (một loại ung thư tử cung),… Theo ghi chú trong lịch sử sử dụng vinblastine thì vinblastine có thể sử dụng một mình hoặc kết hợp với các tác nhân khác để chữa bướu thịt Kaposi và ung thư bàng quang, ung thư vú và một vài loại u ác tính não. Hoạt tính điều trị ung thư của vinblastine cũng hiệu quả như hoạt tính của vincristine, song nó lại là một độc tố thần kinh. Desacetyl vinblastine (vindesine) được xem như là dẫn xuất của vinblastine được bán tổng hợp bởi Potier và cộng sự. Vinorelbine (5’-norhydro Vinblastine), có hoạt tính chống ung thư rộng hơn và giảm phản ứng phụ là gây độc thần kinh. Nó là cấu trúc được sửa đổi trên nhân catharanthine, kết quả là tăng đáng kể lượng lipophilicity (chất có khả năng hòa tan trong chất béo và dung môi không phân cực) hơn so với alkaloid Vinca. Nó có hiệu quả trong sự kết hợp với hóa trị liệu như anthracycline, fluorouracil và taxol. Nó đã được chấp nhận ở Mỹ trong việc điều trị tế bào ung thư phổi nhỏ, có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với cisplatin, và nó cũng đã được dùng cho bệnh nhân bị ung thư vú. Vincristine hay còn gọi là leurocristine, thường được dùng để điều trị khối u ác tính ở trẻ em, nó có khả năng chống lại sự kết hợp rất nhạy cảm của bệnh khối u ác tính ở trẻ em đối với vincristine và cho tác dụng tốt hơn khi dùng đúng liều lượng dành cho trẻ em. Mặt khác, ở cả người lớn và trẻ em, vincristine là một thành phần cần thiết trong liệu pháp hóa học để chữa viêm bạch cầu cấp tính, sự lên cơn làm vỡ lymphoid của bạch cầu myeloid mãn tính (chronic myeloid leukemia), và hai bệnh lymphoma Hodgkin và lymphoma không Hodgkin. Nó cũng đóng vai trò trong một vài liệu pháp điều trị khối u Wilms, bướu thịt Ewing, u nguyên bào thần kinh và rhabdomyosarcoma, cũng tốt như trong điều trị đa u tủy (multiple myeloma) và tế bào ung thư phổi nhỏ (small-cell lung cancer) ở người lớn. Cơ chế tác dụng: vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein vi ống ở thoi phân bào và ngăn cản sự kết hợp của những cấu trúc hình ống có ở trong nguyên sinh chất của nhiều tế bào di động, ngăn cản sự tăng lên về số lượng trong kỳ giữa gián phân của tế bào. Hình 12: Cơ chế ức chế sự hình thành cấu trúc vi ống của vinca alkaloid Vinblastin có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyển hoá của glutamate và aspartate. Và ở vincristin tác dụng chống ung thư còn do ngăn cản sự tổng hợp RNA và các protein. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào. Vinca alkaloid có tác dụng làm tăng nồng độ các phosphat acid và kiềm trong tinh hoàn và tuyến tiền liệt của chuột cống trắng. Điều này chứng tỏ cao dừa cạn đã làm biến đổi chức năng chuyển hoá và hoạt tính của phosphatase ở các cơ quan này của chuột. Vinca alkaloid còn có tác dụng ức chế mạnh hoạt tính của protease của cả hai chủng T5 và T12 của nấm da Trichophyton rubrum. Tác dụng ức chế hoàn toàn có ý nghĩa ở những nồng độ cao. Ở những nồng độ thấp, hoặc không ức chế, hoặc tác dụng ức chế trên protease. Cơ chế kháng nấm ở đâu là ức chế sự hô hấp của sợi nấm của cả 2 chủng T.rubrum. Những điều này đã được thí nghiệm trên chuột: Khi cho chuột cống trắng cái đã thụ tinh uống cao dừa cạn, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ nhưng có dấu hiệu ngăn cản sự phát triển của thai. Khi cho chuột cống uống liều trung bình vào ngày 6 – 13 của thời kỳ thai nghén thì 50% chuột đẻ bình thường, 15% chuột có cổ tử cung không bình thường, 35% còn lại không có dấu hiệu thụ thai. Trong nghiên cứu, ảnh hưởng của vinblastine chiết từ dừa cạn ở Việt Nam lên bộ nhiễm sắc thể của tế bào tủy xương chuột nhắt thấy có tác dụng gây sai lạc nhiễm sắc thể về số lượng, chủ yếu gây nên những tế bào đa bội thể (tứ bội), gây sai lạc về cấu trúc nhiễm sắc thể, đi đến tiêu nhiễm sắc thể và gây ức chế sự gián phân của tế bào Ứng dụng trong y học Vinblastin [1] Tên biệt dược: DBL Vinblastin Injection Dạng bào chế: dung dịch tiêm. Thành phần: Vinblastine sulfate Hình 13: Cấu trúc hóa học của vinblastine sulfate Là thành phần của một phối hợp 3 thuốc, là thuốc lựa chọn thứ nhất điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn. Nó là 1 thành phần của những phối hợp thuốc là lựa chọn thứ hai để điều trị bệnh Hodgkin, ung thư rau, ung thư biểu mô tế bào có vây ở đầu và cổ, ung thư biểu mô tế bào thận. Nó là một trong những thuốc lựa chọn thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ và ung thư dạng nấm da. Nó cũng được dùng chữa bệnh sacoma limpho, sacoma bạch huyết bào, bệnh da sacoma, chảy máu Kaposi, bệnh sacoma tế bào dưới. Một số công thức sự kết hợp của Vinblastine với các thành phần khác: ABVD (adriamycin, bleomycin, vinblastine, dacarbazine) ChIVPP/EVA (chlorambucil, oncovin, procarbazine, prenisone , etoposide, vinblastine, adriamycin) Stanford-V (adriamycin, mustargen , bleomycin, vinblastine , oncovin , etoposide, prednisone) Không có sự kháng chéo giữa vinblastin và các loại chống ung thư khác. Tác dụng phụ: Vinblastine có thể làm giảm việc sản xuất tế bào bạch cầu của tủy xương, làm cho bệnh nhân dễ bị nhiễm trùng. Điều này có thể có hiệu lực sau 7 ngày dùng thuốc, và khả năng bị nhiễm trùng cao nhất là sau 10-14 ngày sau khi hóa trị. Các tác dụng như buồn nôn, nôn, nhức đầu và cảm xảy ra sau khoảng 4 - 6 giờ và kéo dài trong 2 - 10 giờ. Các hiện tượng tiêu chảy, táo bón, tắc ruột, liệt, chán ăn, viêm miệng cũng có thể xảy ra và thường báo trước những tác dụng độc về thần kinh như nhức đầu nặng, khó chịu, trầm cảm, dị cảm và mất những phản xạ gân sâu. Độc tính thần kinh xảy ra trong 5 - 20% trường hợp, tùy thuộc vào liều lượng. Tổn thương hệ thần kinh trung ương đôi khi có tính lâu dài, khi dùng liều quá cao đã xảy ra mù và tử vong. Chứng rụng tóc có thể xảy ra cho khoảng 30 - 60 % người dùng, nhưng tóc sẽ phát triển trở lại khi phương pháp điều trị được hoàn thành. Sự ức chế nhẹ tủy xương với sự giảm bạch cầu xảy ra ở bệnh nhân với tỷ lệ cao, và cần ngừng dùng thuốc. Dễ bầm tím, chảy máu bất thường (mũi, miệng, âm đạo hoặc trực tràng). Những tiểu cầu ít bị ảnh hưởng, ít xảy ra thiếu máu, cần đếm số lượng huyết cầu hàng tuần. Thận trọng lúc dùng: Thuốc có tác dụng độc hại tại chỗ , cần tránh sự tràn thuốc ra ngoài vì có thể gây nhiễm tĩnh mạch ở nơi tiêm. Nếu vinblastine vô tình dò rỉ vào mô xung quanh, da hoặc cơ bắp có thể bị hỏng nặng. Có thể xảy ra sự tiết bất thường chất nội tiết tố kháng tiết niệu. Thuốc có tác dụng gây quái thai trên động vật, do đó không được dùng ở 3 tháng thứ nhất vào thời kỳ thai nghén. Liều dùng: Người lớn tiêm tĩnh mạch, ngày đầu tiêm 0,1 mg/kg, 7 ngày sau và mỗi tuần sau đó, liều thuốc được tăng mỗi lần 0,05 mg/kg, cho tới khi số lượng bạch cầu giảm xuống tới 3.000 bạch cầu/mm3, ung thư thuyên giảm, hoặc tới khi đạt một liều tối đa 0,5mg/kg (bình thường liều cuối cùng là 0,15 - 0,2mg/kg). Sau đó, liều lượng duy trì tới mức giảm bớt trị số gia tăng so với liều cuối cùng và được tiêm ở những khoảng cáck từ 1 - 2 tuần lễ. Một số chuyên gia dùng một liều duy trì 10mg, 1-2 lần trong 1 tháng. Vinblastin có thể gây độc cho thai, nên chỉ dùng ở thời kỳ mang thai nếu tình trạng bệnh đe dọa tính mạng hoặc bệnh nặng mà các thuốc an toàn hơn không có hiệu lực. Đối với trẻ em, tiêm tĩnh mạch 0,1 - 2 mg/kg, một lần trong một tuần. Điều kiện lưu trữ: tủ lạnh từ 36 – 46 0F (giữa 2,2 – 7,80C). Thuốc có thể được bảo quản trong 30 ngày kể từ ngày sản xuất. Vincristine [1] Tên biệt dược: Vincran Dạng bào chế: dung dịch tiêm Thành phần: Vincristine sulfate Hình 14: Sản phẩm và cấu trúc hóa học của vincristine sulfate Vincristine được sự chấp thuận của Food and Drug Administration (FDA) của Mỹ vào tháng 7/1963 như Oncovin. Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm (một loại u thận phổ biến ở trẻ em), bạch cầu tủy, sarcoma Ewing và sarcoma cơ vân. Phối hợp thuốc chứa vincristine là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mãn tính. Một số chuyên gia ưa dùng vincristine chỉ để làm thuyên giảm và không dùng trong điều trị duy trì vì việc sử dụng kéo dài sẽ gây độc hại thần kinh. Sự kháng vincristine có thể phát triển trong quá trình điều trị. Vincristine gây giảm bạch cầu nên phải đếm số lượng bạch cầu trước mỗi liều. Tác dụng phụ: Thường bắt đầu với buồn nôn, nôn, táo bón, co cứng cơ bụng, sút cân nhưng sẽ phục hồi nhanh. Thuốc cũng có thể gây những phản ứng chậm phục hồi như rụng tóc và bệnh thần kinh ngoại biên. Những tai biến nặng về thần kinh có thể xảy ra như mất những phản xạ gân sâu, viêm đau thần kinh, tê các chi, nhức đầu, mất điều hòa. Những khuyết tật thị giác, liệt nhẹ hoặc bại liệt và teo một số cơ duỗi có thể xảy ra chậm. Liệt những dây thần kinh số 2, 3, 6 và 7 cũng có thể xảy ra. Các tai biến thần kinh có thể kéo dài trong nhiều tháng. Tăng huyết áp nặng, tình trạng kích động hoặc trầm cảm cũng có thể xảy ra nhất thời. Thuốc gây độc tại chỗ, cần tránh sự tràn thuốc ra ngoài, tốt nhất nên cho dùng thuốc bằng cách tiêm truyền tĩnh mạch. Vincristine được nhanh chóng thải trừ khỏi máu, 70% thuốc được thải trong mật. Trong bệnh vàng da tắc mật, độc tính thuốc lớn hơn và cần giảm liều. Khoảng 12% thuốc được thải trừ trong nước tiểu. Vincristine không vào trong não, do đó không dùng cho bệnh bạch cầu hệ thần kinh trung ương. Thận trọng lúc dùng: Vincristine gây độc hại cho thai. Ðối với phụ nữ còn khả năng sinh đẻ, cần dùng các biện pháp tránh thai. Phụ nữ đang điều trị với Vincristine cũng như Vinblastine không được cho con bú. Vinscristine khác với hầu hết các thuốc chống ung thư khác ở chổ sự ức chế tủy xương không xảy ra thường xuyên, do đó  nó được dùng trong các phối hợp thuốc. Tuy vậy có giảm bạch cầu và phải đếm số lượng bạch cầu trước mỗi liều. Việc sử dụng thường bị hạn chế bới tác dụng độc về thần kinh. Liều dùng: Tiêm tĩnh mạch mỗi tuần một lần trong bệnh bạch cầu lymphô cấp tính của trẻ dưới 12 tuổi, bắt đầu 0,03 - 0,075 mg/kg cho trẻ em 10 tuổi và 0,05 - 0,15 mg/kg cho trẻ em 1 tuổi, 1 liều trong tuần đầu,tiếp theo bởi những trị số gia tăng hàng tuần 0,025 mg/kg cho tới 1 liều tối đa 0,15mg/kg. Sau đó dùng 1 thuốc khác để duy trì, ở những bệnh nhân từ 12 – 20 tuổi, tiêm tĩnh mạch 1,5 – 4,5mg/m2 diện tích bề mặt cơ thể một lần trong 1 tuần cùng với prednisone (uống 40mg/m2, 1 lần trong mỗi ngày), cho tới khi đạt sự thuyên giảm bệnh. Dùng những thuốc khác để duy trì. Người lớn: 0,025 – 0,075 mg/kg, mỗi tuần 1 lần, tùy theo những tác dụng phụ và hiệu quả điều trị mà điều chỉnh liều khi cần thiết. Điều kiện lưu trữ: giữ ở 2-80C, bảo quản lạnh, không làm đông, tránh ánh sáng. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH Phương pháp chiết tách dùng chất lưu siêu tới hạn Khái niệm chiết suất siêu tới hạn: Là quá trình phân tách một hay một số chất từ hỗn hợp (dược liệu, hỗn hợp nguyên liệu) bằng cách sử dụng chất lỏng CO2 siêu tới hạn như một dung môi. Khi ở trạng thái này CO2 có đặc tính về độ tan tương tự như một chất lỏng đồng thời có khả năng khuếch tán và  độ nhớt gần với chất khí, nhờ vậy chúng có khả năng khuếch tán và hòa tan nhanh các hoạt chất trong nguyên liệu. Gore (1891) là người đầu tiên phát hiện ra khả năng hòa tan tốt của Naphtalen và Camphor trong CO2 lỏng. Sau đó  Andrews (1875) đã nghiên cứu về đặc tính của CO2 ở trạng thái siêu tới hạn. Tuy nhiên, tới đầu những năm 1970 công nghệ chiết xuất các hợp chất tự nhiên bằng dung môi CO2 siêu tới hạn (SC-CO2) mới thực sự phát triển và đi vào ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm như: loại cafein trong cà phê và chè xanh, chiết xuất dầu vừng đen, chiết polyphenol từ chè xanh, loại bỏ cholesterol trong thực phẩm, loại alcol trong đồ uống, chiết xuất phẩm màu, chiết xuất các hoạt chất chống oxy hóa, chiết xuất tinh dầu, hương liệu từ thực vật sử dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm…  3.1.2 Ưu điểm của SC-CO2 trong chiết xuất hoạt chất tự nhiên: CO2 có điểm tới hạn thấp (nhiệt độ gần như ở nhiệt độ phòng, áp suất thấp) vì vậy các hoạt chất ít bị oxy hoá hay phân huỷ bởi nhiệt độ và oxy hoà tan,  ngoài ra vấn đề thiết kế hệ thống chiết xuất đảm bảo đủ áp lực siêu tới hạn cũng dễ dàng hơn nên khả năng ứng dụng cho quy mô sản xuất công nghiệp cũng thuận lợi. Sản phẩm sau khi chiết không còn tồn dư dung môi vì CO2 dễ dàng chuyển sang trạng thái khí và bay hơi toàn bộ sau khi giảm áp suất, nhiệt độ xuống dưới điểm tới hạn. Vì vậy, chiết xuất theo phương pháp này rất phù hợp đối với các sản phẩm dùng làm thực phẩm, thuốc, mỹ phẩm. Khả năng chiết xuất chọn lọc do: Độ tan của SC-CO2  thay đổi khi áp suất và nhiệt độ đạt siêu tới hạn thay đổi vậy nó sẽ hoà tan chọn lọc các chất khác nhau ở nhiệt độ, áp suất tương ứng. Thông thường các tinh dầu dễ bay hơi có thể được chiết ở áp suất dưới 100bar, trong khi các chất béo được chiết ở áp suất cao hơn.   Dung môi SC-CO2  sẽ phân cực hơn khi được hoà trộn với các dung môi phụ trợ phân cực như: methanol, ethanol vì vậy khả năng hoà tan các hợp chất sẽ đa dạng hơn. Tuy nhiên các dung môi phụ trợ có thể làm thay đổi điểm tới hạn của CO2 do đó trong thực nghiệm cần phải khảo sát tỷ lệ dung môi phụ trợ thích hợp để ít ảnh hưởng đến điểm tới hạn.   Thời gian chiết xuất ngắn: Do chất lỏng siêu giới hạn có hệ số khuếch tán cao hơn chất lỏng, trong khi độ nhớt thấp, sức căng bề mặt nhỏ nên khả năng khuếch tán của dung môi vào trong tế bào nhanh hơn vì vậy thời gian chiết được rút ngắn hơn chất lỏng thông thường. Không thay đổi hoặc mất hương thơm, màu sắc  tự nhiên ban đầu của hoạt chất.  Không tạo ra mùi ,vị lạ do SC-CO2 là chất trơ, không mùi vị và bay hơi hoàn toàn khi thay đổi trạng thái siêu tới hạn. CO2 không ăn mòn thiết bị, không gây cháy nổ trong quá trình vận hành, an toàn, thân thiện với môi trường, giá thành rẻ, dễ kiếm, ngoài ra có thể tái sử dụng trong thời gian dài. Trong trường hợp của vinca alkaloid, vindoline được tách chiết nhờ SFE. Theo như một nghiên cứu nhằm tối ưu hóa trong quá trình thực hiện, một lượng đáng kể vindoline (58% lượng chất khô) đã được tách chiết từ lá của Catharanthus roseus sử dụng SFE dưới điều kiện nhiệt độ là 350C và áp suất 300 bar. [6] Hình 15: Sơ đồ quá trình chiết tách bằng SFE Phương pháp chiết tách dùng bình chiết Soxhlet [6] (Soxhlet extraction) Quá trình chiết các ankaloid được thực hiện trên máy Soxhlet gồm có: bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn và bếp điện. Nguyên liệu được nghiền nhỏ, cho vào túi giấy lọc hoặc dùng ống hình trụ để cho mẫu vào. Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết, lắp trụ chiết vào bình cầu, cho dung môi vào bình chiết đến ngập túi nguyên liệu, lắp ống làm lạnh, ngâm nguyên liệu trong dung môi một vài giờ. Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy. Ta sẽ thu được alkaloid. Hình 16: Bình Soxhlet Phương pháp chiết tách solid – liquid [6] Phương pháp solid-liquid là quá trình loại bỏ một hoặc nhiều chất tan từ một chất rắn bằng cách sử dụng dung môi lỏng. Phương pháp chiết tách này được sử dụng trong công nghiệp hóa chất khi mà các phương pháp cơ học và nhiệt không thể áp dụng. Chất chiết từ cây C.roseus là một hỗn hợp phức tạp của các alkaloid với một phạm vi phân cực rộng. Quy trình của phương pháp chiết tách solid-liquid truyền thống cho Catharanthus alkaloid bắt đầu từ việc ngâm nguyên liệu trong môi trường acid, chủ yếu dựa trên đặc tính tổng hợp của chúng. Các alkaloid sẽ hình thành dạng muối khi ngâm trong môi trường acid để cải thiện độ tan và tăng sự ổn định tại giá trị pH thấp. Thêm vào đó, proton trong dung dịch acid sẽ hỗ trợ trong việc bẻ gãy các liên kết nên sẽ giải phóng analyte dễ dàng hơn. Phương pháp tách chiết bằng nước nóng [6] (hot water extraction-HWE) HWE là một trong những phương pháp dùng để tinh sạch các hợp chất hữu cơ tự nhiên. Phương pháp này đang ngày càng được nghiên cứu và áp dụng. Đó là dùng nước nóng đang ở dạng lỏng, điều kiện nhiệt độ và áp suất có thể khác nhau từ 1000C-3740C và 1 bar -219 bar. Tuy nhiên quá trình thường được thực hiện trong khoảng nhiệt độ 100-1800C trên những áp lực bão hòa tương ứng 2-30bar để các pha lỏng được duy trì. Khi hơi nước đi qua mẫu, nó mang các hợp chất hòa tan được trong nó đi theo, sau đó chúng được ngưng tụ để thu được chất mong muốn. Hình 17: Sơ đồ một bộ chưng cất lôi cuốn hơi nước Sắc ký lỏng cao áp hiệu năng cao [4] Cùng với sự ra đời của các vật liệu hiệu quả cao, cũng như sự tiến bộ về trang thiết bị cho phép thực hiện đầy đủ năng lức của các vật liệu này, kỹ thuật HPLC đã phát triển vô cùng mạnh mẽ và vững chắc hơn so với các phưong pháp sắc ký khác. Định nghĩa: HPLC là kỹ thuật tách hỗn hợp trên cột đựoc nhồi bằng các hạt có kích thứoc ≤ 10 µm. Trong đó, ngừoi ta dùng một bơm có áp suất cao ≈ 300atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lựong mẫu nhỏ khoảng 20µg. Ưu điểm: Trong sắc ký khí, các hỗn hợp đựoc khảo sát trong pha hơi, vì vậy cần phải tạo một chất hơi ổn định từ hỗn hợp cần phân tích, hoặc chuyển các chất trong hỗn hợp thành các dẫn chất bền với nhiệt. Chỉ có khoảng 20% các hợp chất hoá học thích hợp cho sắc kí khí mà không cần phải biến đổi mẫu thành một dạng khác, số còn lại đều không bền với nhiệt và không bay hơi. Hơn nữa, các chất có các nhóm chức rất phân cực hay có thể ion hoá thừong có khuynh hứong kéo đuôi, không thích hợp khi áp dung sắc ký khí. Vì thế HPLC là một kĩ thuật tốt hơn đối với các đại phân tử, các loại chất vô cơ và ion hoá, các hợp chất thiên nhiên không bền, các hỗn hợp thuốc và các chất hoá sinh. Trong sắc kí khí chỉ có một pha (pha tĩnh lỏng hay rắn) là sẵn sàng tưong tác với các phân tử của mẫu. Vì pha động là một chất khí, tất cả hơi của mẫu đều tan trong chất khí này. Trong HPLC, cả pha tĩnh lẫn pha động có thể tương tác một cách chọn lọc với mẫu. Các tương tác như tạo phức hay liên kết hydrogen không có trong pha động của sắc ký khí có thể xảy ra trong pha động của HPLC. Nhiều loại tương tác chọn lọc khác nhau này cũng có thể được gia tăng bởi sự biến đổi hoá học thích hợp của bề mặt silica, vì thế HPLC là một kĩ thuật linh hoạt hơn sắc ký khí và thường có thể thực hiện được trên các phân tử tách khó hơn. Nhược điểm: Xét cả về đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kĩ thuật đắt tiền, hơn cả sắc ký khí. 3.5.2 Cấu tạo và hoạt động của máy sắc ký lỏng cao áp HPLC: Thiết bị cơ bản máy HPLC bao gồm: Bình chứa pha động Bơm tạo áp lực cao và hệ thống tạo ra việc rửa giải đẳng môi hay rửa giải tiệm tiến ( pump + gradient system) Bộ phận tiêm mẫu (injection unit) để đưa mẫu vào cột. Cột đựoc nhồi với pha tĩnh có hiệu quả cao. Cột có thể đựơc đặt trong một bộ phận điều nhiệt. Bộ phận phát hiện và hệ thống xử lý dữ liệu Máy ghi (recorder) hoặc máy vi tính để ghi hoặc lưu giữ sắc kí đồ Pha tĩnh trong HPLC là các phân tử có kích thứoc rất nhỏ, đựoc gọi là chất nhồi vi tiểu phân, chúng thường đồng dạng, có hình cầu hoặc hình dạng bất định, đừong kính 10, 5, hay 3 µm. Cơ chế phân tách có thể đựoc thực hiện bằng các nhóm hoá học liên kết vào bề mặt của các tiểu phân silica để tạo ra các pha liên kết. Hiện nay, pha liên kết thông dụng nhất đựoc sử dụng trong HPLC là ODS, trong đó nhóm ankyl 18 carbon được gắn vào bề mặt của các tiểu phân silica. Khi được nhồi vào cột, kích thước nhỏ của các vi tiểu phân dẫn đến sự đề kháng đáng kể với sự chảy của dung môi, vì thế pha động phải được bơm qua cột bằng một áp lực cao. Cột và toàn bộ hệ thống cột phải chịu được áp suất sử dụng và cũng phải đề kháng về mặt hoá học với các dung môi pha di động, chúng thường phải được chế tạo bằng thép không gỉ. Pha động được bơm qua cột với vận tốc vài ml/phút. Nêu thành phần pha động không đổi, phưong pháp được gọi là rửa giải đẳng môi. Ngược lại, nếu thành phần của pha động có thể được làm thay đổi theo một cách định trước trong lúc phân tách, phương pháp được gọi là rửa giải tiệm tiến. Rửa giải tiệm tiến thích hợp cho các mẫu thử nghiệm chứa các chất có độ phân cực khác nhau nhiều, cần đến sự thay đổi độ phân cực của hỗn hợp dung môi trong quá trình tách. Sau khi qua cột, các chất tan tách ra được ghi nhận bằng một bộ phận phát hiện lắp đặt trong hệ thống. Thông tin đưa ra của bộ phận phát hiện là một tín hiệu điện, sự biến đổi của tín hiệu này được biểu hiện trên một máy đo thế năng, một dụng cụ tích phân vi tính, hoặc một màn hình của máy tính. Phần lớn các bộ phận phát hiện phổ biến trong HPLC là bộ phận phát hiện chọn lọc, chúng không thể đáp ứng với tất cả chất tan có trong hỗn hợp. Do vậy, sẽ có một số chất tan không được phát hiện trong HPLC, chúng cần phải được chuyển thành một dạng khác có thể phát hiện được sau khi ra khỏi cột, phương pháp này gọi là phương pháp tạo dẫn chất sau cột ( post-column derivatisation). CHƯƠNG 4: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN VITRO TẾ BÀO C.roseus Nuôi cấy mô và ý nghĩa của nuôi cấy mô [2] Giới thiệu Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng. Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở lý luận khoa học về tính toàn năng và khả năng phân hóa, phản phân hóa của tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan (sự phát sinh cơ quan) từ các mô như: lá, thân, hoa hoặc rễ Tính ưu việt của nuôi cấy mô tế bào thực vật So với các phương pháp nhân giống tự nhiên khác thì phương pháp nuôi cấy mô đã là một động lực thúc đẩy công nghệ sinh học và nông nghiệp phát triển vì phương pháp này có những ưu điểm sau: Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, quá trình được thực hiện trên diện tích không lớn, ở bất kì địa thế nào, có thể kiểm tra khống chế các hướng nghiên cứu theo ý muốn. Tạo được một số lượng lớn cây con trong một thời gian ngắn với tính đồng nhất cao về mặt di truyền, phù hợp với nhu cầu thị trường. Là phương pháp phục tráng giống cây bị nhiễm bệnh, thoái hóa để tạo giống cây khỏe mạnh. Giúp bảo quản giống cây dễ dàng bằng cách tạo ra các thể phôi hay bảo quản lạnh. Tạo ra các dòng đột biến, các dòng siêu sản xuất, tăng tần số đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao. Nuôi cấy mô dung hợp protoplast có thể kết hợp nhiều tính trạng mong muốn trong chọn giống cây trồng. Giảm chi phí vận chuyển từ nơi này đến nơi khác giúp việc trao đổi giống giữa nơi này đến nơi khác được dễ dàng. Tạo ra các sản phẩm tự nhiên như ở các cây bình thường như dược phẩm, thuốc nhuộm, hương liệu… Một số kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nuôi cấy cơ quan Có thể sử dụng kỹ thuật này để nuôi cấy các bộ phận của cây như lá, rể…Tuy nhiên hướng ứng dụng này không được áp dụng rộng rãi. Kỹ thuật nuôi cấy cơ quan thường được áp dụng trong nước như: cắt lá, cành từ lô ống nghiệm đã tái sinh cây, cấy chuyền sang các lô ống nghiệm tiếp theo. Nuôi cấy mô phân sinh (meristem) Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0.1mm ÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,... Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. Kỹ thuật này được dùng rất nhiều trong công tác phục tráng cây trồng bị nhiễm virus nên còn được gọi là phương pháp tạo cây sạch bệnh. Phương pháp này có từ năm 1937, tuy nhiên đến năm 1949 Linesset và Cornuet mới bắt đầu tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ở cây thuốc lá. Sau đó, Morel và Martin đã nuôi cấy thành công đỉnh sinh trưởng cây thược dược (1952) và Cymbidium (1960). Nuôi cấy mô sẹo (callus) Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt ( vết thương, xử lý với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật…) Để nuôi cấy mô sẹo, người ta có thể sử dụng hầu hết các cơ quan đang còn sống của thực vật như: thân, lá, cuống…Tuy nhiên, người ta thường sử dụng các mẫu cấy còn non để quá trình cảm ứng của mẫu xảy ra dễ dàng hơn. Nuôi cấy mô sẹo được áp dụng trong nhiều trường hợp: Nhân giống in vitro đối với loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng có hiệu quả không cao. Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các hợp chất thứ cấp. Nghiên cứu các quá trình hình thành cơ quan. Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn ( Henshaw và cộng sự, 1965; Torres 1989). Sự tạo huyền phù tế bào có khả năng sinh phôi trong môi trường lỏng được lắc liên tục và sự tái sinh thực vật từ huyền phù tế bào này là hai giai đoạn quan trọng cần thiết cho phép thực hiện sự nhân giống in vitro ở mức độ công nghiệp. Ngoài ra các giai đoạn này cũng cần thiết cho việc sử dụng các tác nhân vật lý, hóa học nhằm tuyển chọn các đặc tính thích hợp để phục vụ cho nhu cầu sống cầu sống của con người mà đặc biệt là các kỹ thuật chuyển gen như bắn DNA, dung hợp tế bào…cũng như mọi thao tác ở mức tế bào. Tạo phôi soma – tạo hạt nhân tạo Trong môi trường nuôi cấy thích hợp thì mô cấy hay tế bào có thể phát triển thành phôi vô tính. Phôi được bọc bằng lớp vỏ bọc chứa nội nhũ nhân tạo thành hạt nhân tạo. Có hai cách tạo phôi vô tính là: phát sinh phôi trực tiếp và phát sinh phôi gián tiếp. Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson (1922) đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocorm. Raghavan (1976, 1980) đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng (tiền phôi) cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng. Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết quả tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nuôi cấy hạt phấn và bao phấn đơn bội Nguyên liệu cho phương pháp này là bao phấn hoặc hạt phấn tách rời, tình trạng vật lý của cây và kiểu gen ảnh hưởng đáng kể đến sự thành công của việc nuôi cấy bao phấn. Ngoài ra, trạng thái của hạt phấn cũng rất quan trọng. Nuôi cấy tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào đã bị loại bỏ vách cứng, chỉ còn lại màng tế bào bao bọc xung quanh. Người ta có thể tiến hành lai, dung hợp giữa các dạng tế bào trần với nhau, sau đó lại tái tạo màng và vách tế bào. Việc dung hợp tế bào trần giúp tạo các cơ thể lai mà phương pháp lai hữu tính không thể tiến hành được. Chất điều hòa sinh trưởng [2] Thuật ngữ chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Plant growth regulator, PGR) đã được dùng rất nhiều bởi các công ty nông dược để chỉ các chất điều hoà sinh trưởng tổng hợp. Định nghĩa của Van Overbreek và cộng tác viên (1954) vẫn còn được dùng đến ngày nay. “Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác với những chất dinh dưỡng, với một hàm lượng nhỏ kích thích, ức chế, hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý nào trong thực vật”. Trong sinh lý thực vật khái niệm về chất kích thích sinh trưởng bao gồm các hợp chất có tác dụng điều tiết các hoạt động sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nhóm hợp chất này bao gồm các hormone tự nhiên (auxin, gibberellin, cytokinin, acid abscicic, ethylene, các hợp chất phenol điều tiết sinh trưởng, hormone ra hoa). Auxin Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là acid indol acetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học như IAA-glucose, IAA-myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn suất khác của indol cũng thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol pyruvate, indol ethanol. Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và chủ yếu ở định chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể thực vật: lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới hàng loạt các quá trình sinh lý: tốc độ sinh trưởng, trạng thái ngủ, sự ra hoa, sự kết trái, sinh trưởng quả, sự chín của quả, sự rụng quả và rụng lá, tạo củ, sự lão hóa…Đương nhiên, do hormone thực vật tác động lên sinh trưởng thông qua mối tương quan nồng độ giữa các loại hocmone khác nhau, nên các quá trình trên đây không chỉ ảnh hưởng của auxin mà còn của các hormone khác. Tùy thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào thông qua tác dụng trực tiếp lên sự giãn nở của vách tế bào. Các chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin gồm một vài hợp chất đã được sử dụng từ rất lâu trong công nghiệp. Chỉ sau một thời gian ngắn sau khi IAA được tìm thấy trong tự nhiên, nó đã được tổng hợp và trở thành một hợp chất có giá trị. Nhưng IAA không có lợi để dùng trong nông nghiệp bởi nó dễ dàng bị phân hủy thành các hợp chất mất hoạt tính dưới ảnh hưởng của ánh sáng và vi sinh vật. Một trong những tác dụng của auxin là kích thích sự hình thành rễ của những lát cắt thân. Một số hợp chất tổng hợp nhân tạo có vai trò tương tự như IAA, trong đó có IBA. IBA là hợp chất có hoạt tính auxin yếu nhưng nó có khả năng ổn định và vô hiệu hệ enzyme làm mất hoạt tính của auxin. Cytokinin Phần lớn cytokinin là dẫn xuất của purine. Loại cytokinin đầu tiên phát hiện được và cũng là dạng phổ biến nhất là zeatin tách từ hạt ngô. Ngoài ra còn có hàng loạt cytokinin khác như kinetin, dihydrozeatin, benzyladenin, chlorephenylurea…, trong đó kinetin không có mặt trong tự nhiên, mà ngừơi ta thu nhận bằng cách xử lý nhiệt ADN. Chứng minh về khả năng ngăn cản sự vàng lá của benzyladenin (BA) là một phát hiện thu hút nhiều nhà sinh lý học từ những năm 1950. Những năm 1960, các nhà nghiên cứu thấy rằng BA có thể kích thích nhiều quá trình, BA được sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các nồng độ khác nhau tùy theo đối tượng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy. Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lượng cao nhất trong phôi và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng được tăng cường khi chúng tương tác với myo-inositol, nhưng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần của các glycoside. Cũng như auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây, đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi acid nucleic và protein. Cytokinin điều chỉnh sinh trưởng bằng nhiều cách: Điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN khi phân chia tế bào. Làm chậm sự lão hóa của lá. Góp phần phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trưởng của quả. Gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, bao gồm mô sẹo trong nuôi cấy mô. Trong cây, cytokinin vận động từ rễ đến chồi thông qua xylem khá dễ dàng, nhưng chúng hầu như không linh động trong lá, ngoại trừ một phần được dẫn truyền định hứơng thông qua cuống lá. Gibberellin Là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane. Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi, loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất. Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa. Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: Các gibberellin đã biết đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự sinh trưởng của nhiều loài cây đặc biệt là những cây lùn. Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA đã được phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng một phần năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại. Các dạng đột biến lùn như đột biến bắp lùn (Zea Mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza Sativa L.) Tan-ginbozu và Waito-C. GA nội sinh kiểm soát hoạt động của bắp và lúa là GA1. Việc xử lý GA ngoại sinh làm cho các cây này cao trở lại bình thường. Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng: Hiện nay GA được biết là những chất có khả năng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng trên nhiều loại cây trồng. GA có thể kích thích hoạt động của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc. GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone của hột ngũ cốc và kích thích sự sản sinh enzyme α-amylase để tác động lên sự phân hủy tinh bột thành đường đơn. Tác động này có tác dụng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng. Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: Gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong nhiều loài thực vật. Đối với những cây cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh trước trổ hoa thì khi xử lý GA trong những điều kiện không cảm ứng chúng sẽ tượng hoa và trổ hoa. Ảnh hưởng này có liên quan đến sự kích thích quá trình phân chia tế bào và vươn dài tế bào. Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, trinh quả sinh, đậu trái và lão hóa: GA có thể làm thay đổi giới tính của hoa tương tự như auxin, cytokinin và ethylene. Tuy nhiên, GA có hiệu quả ngược với auxin và ethylene. GA làm tăng số hoa đực trên dưa leo. GA cũng gây nên hiện tượng trinh quả sinh và tạo nên trái không hột. GA cũng giúp cho trái to và trì hoãn sự lão hóa. Acid abscisic Là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải caroteniod. Acid abscisic được sinh tổng hợp trong các lạp thể (Neill và Horgan, 1984; Milborrow, 1974). Vai trò quan trọng của ABA như là một chất cảm ứng với stress đã được biết trong nhiều năm qua. Xử lý ABA ngoại sinh gây đóng khí khẩu trong điều kiện sáng và duy trì cho đến khi ABA bị chuyển hóa. Trong điều kiện stress do thiếu nước ABA có thể gia tăng lên 20 lần. Hàm lượng ABA gia tăng khi cây bị stress do mặn, lạnh và nóng. Những sự biến đổi này là nguyên nhân của sự thiếu nước. Việc xử lý ABA ngoại sinh có thể làm cho một số loài cây chống lại điều kiện lạnh và mặn. Trong điều kiện ngày ngắn, hàm lượng ABA gia tăng trong lá và mầm chồi đã dẫn đến sự miên trạng. Tuy nhiên cũng có trường hợp trong điều kiện ngày ngắn gây ra sự miên trạng trong vài loài lại không có sự gia tăng ABA nội sinh. Việc xử lý ABA ngoại sinh lên mầm chồi và lên hột đã kích thích miên trạng của chúng. Từ khi mới được phát hiện, ABA được xem là chất gây nên sự rụng lá, trái và hoa. Thật ra điều đó không hoàn toàn đúng và ABA không trực tiếp ảnh hưởng lên sự rụng. ABA có thể tác động gián tiếp lên quá trình lão hóa trước trưởng thành và làm gia tăng sự sản sinh ethylene và ethylene đánh thức một số gene liên quan đến sự rụng. Ngày nay người ta biết rằng ABA có nhiều ảnh hưởng về mặt sinh lý, sinh hóa và phân tử trong hột cũng như có mặt phổ biến trong lúc hột phát triển. Tuy nhiên vai trò trực tiếp của ABA đối với các quá trình này vẫn còn chưa rõ. Ethylene Những người Ai Cập đã không biết rằng ethylene chính là tác nhân gây chín trái khi họ tạo vết thương trên trái. Ngày nay, ethylene đã được biết là hormone điều hoà sự chín trái. Năm 1901, Neljubow chứng minh ethylene ức chế sự vươn dài, kích thích sự phát triển theo chiều ngang. Ngày nay, người ta biết được ethylene có khả năng kích thích hoặc ức chế sự vươn dài của thân, rễ hoặc những cơ quan khác. Ethylene cũng có biểu hiện kích thích sự vươn dài của thân hoặc rễ với tốc độ chậm. Đáp ứng bộ ba kích thích bởi ethylene có thể hoạt động như một cơ chế tồn tại trong cây con. Đáp ứng bộ ba dựa trên tính sinh trưởng ngang, sự phồng lên và ức chế sự phát triển chiều cao thân. Ví dụ: khi một cây đậu Hà Lan gặp phải bề mặt cứng của đất, đá thì nó sẽ đáp ứng với sự sinh trưởng theo kiểu bộ ba, cho phép đâm thủng hoặc đi chung quanh chướng ngại, vươn tới bề mặt đất và tiếp tục phát triển. Ethylene trong vùng móc câu của cây con giúp nó duy trì hình móc câu chặt chẽ, vượt qua áp lực vật lý khi va chạm với đất mà không bị tổn thương. Khi cây con nhận được ánh sáng đỏ, sự sản sinh ethylene sẽ giảm. Kết quả là móc mở. Điều này hoạt động như một cơ chế an toàn, ngăn cản sự mở trước của móc và giảm thương tổn đến cây con trước khi nhô lên khỏi mặt đất. Quá trình rụng rất quan trọng trong nông nghiệp bởi vì nó ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả sản xuất. Ethylene có vai trò tự nhiên trong việc điều hoà tốc độ rụng. Năm 1985, Reid đã đưa ra bằng chứng: ethylene sản sinh gia tăng trước khi rụng trong nhiều cơ quan của cây đang rụng; Xử lý ethylene kích thích sự rụng ở thực vật; Những chất ức chế sự sinh tổng hợp ethylene hoặc ức chế hoạt động của ethylene sẽ ức chế sự rụng. Nhiều năm qua người ta đã quan sát khói từ gỗ thúc đẩy sự trổ hoa trong cây khóm và xoài, thành phần chính của khói là ethylene. Ethylene trong phần lớn trường hợp ức chế quá trình trổ hoa; Ngược lại, đối với cây khóm, xoài và vải, ethylene kích thích trổ hoa. Cây có thể được xử lý trực tiếp với ethylene hoặc gián tiếp thông qua việc sử dụng những chất phóng thích ethylene Lão hoá được đặc trưng bởi sự phân rã diệp lục tố, protein, hoặc RNA. Cả lá và hoa khi được xử lý với ethylene ngoại sinh đều gia tăng quá trình lão hoá và gia tăng sự sản sinh ethylene nội sinh. Cần chú ý rằng có những trường hợp ngoại lệ, ethylene không đơn lẻ liên quan đến quá trình lão hoá: nhiều cây không gia tăng sản sinh ethylen trước khi lão hoá. Ethylene cũng cũng có liên quan đến quang hợp, hô hấp, vận chuyển, miên trạng, sự nảy mầm của hột, nhú chồi, ưu thế chồi ngọn, sinh trưởng tế bào, nuôi cấy mô, thành lập phôi, sự nghiêng, sự khởi sinh rễ, những cơ quan dự trữ, sự thành lập gỗ, sự ức chế mầm hoa, sự phát triển giới tính, địa hướng động, sự rỉ nhựa và sự thành lập nhựa mủ của cây. Môi trường nuôi cấy[2] Đối với kỹ thuật nuôi cấy mô, sự nuôi cấy in vitro đòi hỏi những điều kiện về môi trường nuôi cấy và môi trường xung quanh. Những điều kiện này có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy và điều này cho phép người ta chế ngự kỹ thuật một cách tế nhị nhất. Mặc dù thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loại bộ phận nuôi cấy, sự phát triển phân hóa của mô cấy và tùy theo ta muốn duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ…mà thay đổi ít nhiều nhưng tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ cũng bao gồm 5 thành phần chính sau: Đường làm nguồn carbon. Các muối khoáng đa lượng. Các muối khoáng vi lượng. Các vitamin. Các chất kích thích sinh trưởng. Ngoài ra, các tác giả còn thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định ( amino acid, EDTA…) hoặc không xác định (nước dừa, nước chiết nấm men, nước chiết chuối, nước chiết khoai tây, cà chua…) Đường (nguồn carbohydrate) Trong nuôi cấy nhân tạo, đường được sử dụng như nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của chồi. Hai dạng đường thường được sử dụng nhất hiện nay là saccharose và glucose, nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn. Tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ đường có sự thay đổi. Nhu cầu cacbohydrate trong môi trường nuôi cấy là 2-3% đối với đường saccharose hay thấp hơn đối với đường glucose [10] 4.1.5.2 Các muối khoáng đa lượng Nhu cầu muối khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần thiết là N, P, K, Fe, Ca, Mg. 4.1.5.3 Các muối khoáng vi lượng Nhu cầu muối khoáng vi lượng của mô thực vật trong nuôi cấy còn rất ít được nghiên cứu, mặc dù chúng là thành phần không thể thiếu được cho sự phát triển của mô và tế bào thực vật. Nhưng để an toàn, các tác giả cung cấp hầu hết các yếu tố vi lượng cho mô nuôi cấy. 4.1.5.4 Các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng Để kích thích cho sự sinh trưởng phát triển của mô thực vật nuôi cấy, người ta còn bổ sung thêm một số loại vitamin: myo-inositol, vitamin PP, vitamin B1, B6…và các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin, gibberelin... Các chất bổ sung Agar (thạch) Agar là thành phần quyết định trạng thái vậy lý của môi trường. Hàm lượng agar dùng cho môi trường nuôi cấy dao động từ 0,6-1,0% theo khối lượng. Agar là nguyên liệu phổ biến nhất dùng cho việc pha các môi trường bán rắn hay môi trường rắn. Nếu bổ sung agar với nồng độ cao thì môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng cũng như hấp thụ của mô gặp khó khăn (Bhojwani và Razdan; 1983). Đa số nuôi cấy phôi được thực hiện trên môi trường có agar nhưng phụ thuộc vào cây mà sử dụng cho phù hợp. [11] Than hoạt tính Than hoạt tính được sử dụng trong môi trường nuôi cấy như một chất phụ gia vì than hoạt tính có khả năng hấp phụ các chất tiết ra từ mô cấy, vỏ bao phấn…và làm tăng hiệu suất sinh phôi (Fridborg et al, 1978; Ammirato, 1983). Than hoạt tính không phải là chất điều hòa sinh trưởng nhưng có thể làm thay đổi thành phần của môi trường, hấp thu nhiều hợp chất khác nhau, mà các chất này có thể hình thành trong quá trình hấp môi trường, hấp thu các chất tiết ra từ mẫu cấy cũng như các chất điều hòa sinh trưởng khi bổ sung vào môi trường, ngăn chặn sự phát triển mô sẹo không mong đợi. Ngoài ra than hoạt tính còn góp phần đẩy mạnh sự phát sinh phôi và sự hình thành rễ. [12] Trong một số nghiên cứu về ảnh hưởng của than hoạt tính khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, đã thấy sự hiện diện của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng trong việc làm tăng chiều cao cây, chiều dài rễ, trọng lượng tươi và trọng lượng khô, và làm giảm sự hình thành chồi nách từ mô cấy một cách rõ rệt [10]. Ngoài ra, mẫu cấy được nuôi cấy trong môi trường có than hoạt tính khỏe mạnh, có màu xanh đậm, còn ở môi trường không có than hoạt tính mẫu cấy yếu hơn và lá hơi vàng. [13] Các chất hữu cơ khác Bên cạnh các chất điều hòa sinh trưởng, người ta còn sử dụng nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết chuối xanh, khoai tây, cà chua và dịch chiết nấm men, casein thủy phân…để nhân giống nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô cấy. Hiệu quả thúc đẩy quá trình tăng trưởng này được giải thích bằng những vitamin, amino acid và những chất điều hòa khác chứa trong chúng (Perik, 1987). Nước dừa Năm 1941, Van Ovebeck đã xác nhận tác dụng kích thích của cây dừa trong nuôi cấy phôi họ Cà. Năm 1948, Steward cũng thu được kết quả như vậy ở mô cà rốt. Nước dừa vô trùng đã được Trung tâm Sâm Việt Nam dùng làm một thành phần trong môi trường nuôi cấy mô tạo sinh khối mô Sâm K5 thành công từ năm 1983. Ngoài ra đã sử dụng trong nuôi cấy thành công trong các loài cây khác như đảng sâm di thực, phong lan… Nhiều công trình nghiên cứu xác định trong nước dừa ngoài khối lượng nước chiếm 90% còn có các chất đường, amino acid, lipid, vitamin, các nguyên tố vi và đa lượng, acid hữu cơ, các chất kích thích sinh trưởng. Theo Tuleke, amino acid ở nước dừa xanh chiếm hơn 40% amino acid tổng số là glutamine, ở nước dừa già cũng có một số lượng lớn acid glutamic, glutamine, serin, leucin, acid amino butyric. Ngoài ra trong nước dừa còn có các acid hữu cơ có chứa acid hữu cơ có chứa acid malic, sikimic, quinic và các nguồn hydrate carbon khác như saccharose, glucose, fructose. Theo Vandebelt (1954), trong nước dừa có nhiều vitamin như acid nicotinic, acid pantotenic, biotin, riboflavin, acid folic, thiamin và pyridoxine. Theo Paris, Duhamat (1953) trong nước dừa có chứa IAA. Còn Radiey (1958) phát hiện cả gibberelin trong dịch thực vật này. Dịch chiết chuối Chuối là cây ăn quả lâu đời gắn liền với cuộc sống gia đình hàng triệu dân vùng nhiệt đới nói chung và được phổ biến ở nước ta. Hàm lượng chất dinh dưỡng trong quả chuối rất cao, đặc biệt đường chiếm 10-22% và nhiều loại vitamin khác như vitamin B1, B2, PP, C và đặc biệt vitamin A chiếm từ 250-320 đơn vị. Theo kết quả nghiên cứu của Atwater, thành phần dinh dưỡng trong quả chuối rất cao: protein 1.3%, mỡ 0.6%, bột đường 22%, tro 0.8%. Khoai tây Thành phần của khoai tây bao gồm: magnesium 10%, thyamin 15%, riboflavin 3%, vitamin C 50-70%, Dietary Fibre 10-15%, phosphorus 5%, vitamin B6 13-19%, acid forlic 7%, Fe 6-14%, protein 6.5%, iodine 14%, acid pantothenic 4-7%, calcium 6%, niacin 10%, kẽm 5% [14] Phương pháp nuôi cấy in vitro tế bào C.roseus [8] Trước đây những nguyên liệu thô dùng để sản xuất alkaloid thường được thu nhận hầu hết tại những vùng mà C.roseus xuất hiện tự nhiên hoặc tại những vùng nó được trồng trọt. Điều kiện thời tiết và đặc tính của đất ở một số nước châu Âu thì bất lợi cho việc gieo trồng C.roseus. Vì thế nó chỉ có thể được trồng như là một loại cây hàng năm trong nhà kính và những nhà mái vòng làm bằng nhựa. Mặt khác, trong khi nhu cầu về alkaloid rất lớn và giá của chúng rất cao, nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây trong tự nhiên là rất thấp. Do đó, việc thu nhận indole alkaloid từ mô và cơ quan thực vật, và từ những cây được nhân giống in vitro là những hướng đi mới cần được phát huy. Mô sẹo, huyền phù tế bào và rễ tơ được nuôi trong bioreactor đã được sử dụng trong nhiều thí nghiệm. Những mô được nuôi cấy từ những cơ quan khác nhau tổng hợp rất nhiều hợp chất thứ cấp và có tính di truyền ổn định.Nhiều triển vọng hứa hẹn bao gồm việc sản xuất những indole alkaloid như : ajmalicine trong mô sẹo, catharanthine trong lá được nuôi cấy trong bình lắc và bioreactor có sục khí, và vinblastine từ chồi và rễ tơ. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Nhiều nghiên cứu đã được thử nghiệm trong việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy cho năng suất thu indole alkaloid cao, đặc biệt là vinblastine và vincristine . Phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù được nuôi cấy trong bioreactor đã thành công. Moreno và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên những con đường chuyển hóa khác nhau liên quan đến quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào C.roseus. Dịch trích tế bào nấm Phytium aphanidermatum đã được tiệt trùng được dùng trong nghiên cứu này. Những tế bào C.roseus ngay lập tức biến đổi quá trình chuyển hóa của chúng để phản ứng lại tác động của nấm. Zhao và cộng sự (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào C.roseus. Những kết quả này cho thấy rằng những chất chiết từ nấm khác nhau kích thích tích lũy những indole alkaloid khác nhau, có thể gấp 2 đến 5 lần ở nuôi cấy thường. Zhao và cộng sự (2001) đã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi cấy C.roseus bằng cách kết hợp chất cảm ứng nuôi trong bình lắc và bioreactor. Tác động tổng hợp lên sự tích lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy đã được theo dõi khi chúng được xử lý với một vài sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất. Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillum niger đã cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy catharanthine. Trong khi sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho kết quả hiệu suất catharanthine cao nhất và cũng tích lũy ajmalicine cao trong tế bào nuôi cấy. Các tác giả sau đó đã phát triển quy trình này để nâng cao việc sản xuất catharanthine ở tế bào C.roseus nuôi trong bình lắc và bioreactor. Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25 mg/l, 32 mg/l và 22 mg/l trong bình lắc 500 ml, 1,000 ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít. Tác giả cũng đã quan sát thấy rằng sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng lại, ví dụ như là sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy C.roseus và điều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con đường jasmonate. Nuôi cấy mô sẹo Những mô sẹo có thể là nguồn cung cấp alkaloid chính, phổ biến nhất, cung cấp vật liệu khởi đầu cho sự thiết lập quá trình nuôi cấy huyền phù hoặc cho việc cảm ứng những cơ quan như chồi hoặc rễ. Những khảo sát đầu tiên có liên quan đến sự hình thành của rễ từ mô sẹo C.roseus đã được công bố bởi Dhruva và cộng sự (1977). Việc tái sinh những cây C.roseus khỏe mạnh có thể thực hiện từ những mô sẹo thông qua việc làm lây nhiễm những cây này với mycoplasma-like organisms (MLOs). Mollers và Sarkar (1989) đã làm nhiễm những chỗ cắt ở đốt thân cây C.roseus với 3 loại MLOs khác nhau và nuôi chúng trên môi trường dinh dưỡng MS rắn. Mô sẹo đã được hình thành trên những mô bị nhiễm, rồi được phân vào các cây, sau đó chuyển sang môi trường MS có bổ sung 1-naphthyl acetic acid (NAA) 1.0 mg/l, 6-benzyl aminopurine (BAP) 0.25 mg/l và gentamycin 10.0 ml/l. Những cây này sau đó dễ dàng thích nghi với điều kiện trong nhà kính nơi chúng sẽ được nuôi trong 1 năm. Việc nhuộm màu lá với fluorochoromes DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) và berberine sulfate đã chứng minh sự vắng mặt của MLOs trong cây tái sinh. Ramavat và cộng sự (1978) đã mô tả quá trình hình thành chồi non C.roseus từ mô sẹo. Sự tái sinh cây từ những tế bào mô sẹo đơn bội hay lưỡng bội C.roseus cũng đang được kết hợp với việc sử dụng những chất điều hòa sinh trưởng thực vật như kinetin và β-indolylacetic acid (IAA) đã được thực hiện bởi Abou-Mandour và cộng sự (1979). Phương pháp cho tần số cây C.roseus tái sinh cao bằng cách là tạo phôi soma đã được mô tả bởi Kin và cộng sự (1994). Tác giả thu được những mô sẹo từ bao phấn của cây C.roseus sử dụng môi trường MS rắn bổ sung NAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l (MSNK). Những phôi soma được hình thành sau khi chuyển những mô sẹo này vào môi trường MSNK lỏng. Những cây được trồng như vậy sẽ có cùng số nhiễm sắc thể như là cây trồng từ hạt (2n=16). Pietrosiuk và cộng sự (1999) đã thành lập hai dòng mô sẹo C.roseus trắng và xanh (hình 17d, e) trên môi trường Gamborg rắn bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA. Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây C.roseus giống. Dòng mô sẹo trắng đã được chọn từ những mô xanh phát triển trong pha tĩnh. Trái ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và mềm. Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng chỉ cho thấy các indole alkaloid tồn tại ở dạng vết nhưng không có dược tính. Nuôi hạt nhân tạo Krueger và cộng sự (1982) đã tạo ra được cây có lá nuôi cấy từ hạt C.roseus nảy mầm vô trùng trên môi trường Murashige và Skoogs Revised Tobacco (MS RT) có bổ sung benzyladenine (BA), với đặc điểm là nhân giống nhanh chóng và sản xuất được các alkaloid như vindoline, ajmalicine, sitsiriline, tetrahydroalstonine và serpentine. Quá trình nuôi cấy cho thấy sự phát triển và sản xuất vindole nhanh chóng và rất nhiều hỗn hợp alkaloid khác, bao gồm cả những alkaloid không được tìm thấy ở cây nguyên vẹn. Miura và cộng sự (1988) đã cô lập đựơc vinblastine từ những chồi non C.roseus nuôi cấy được lấy từ những cây con nảy mầm từ hạt. Lượng vinblastine thu đựơc là 15μg/g chất khô và cao hơn trong mô sẹo (Miura et al. 1987). Kết quả này cho thấy rằng là sự sản xuất vinblastine thì liên quan đến sự hình thành chồi. Nuôi cấy mô phân sinh Sự nhân giống cây từ những mô phân sinh hiện nay là một phương pháp hữu ích để sản xuất nhanh sinh khối phục vụ cho y học. Nó cho phép khả năng tái tạo một kiểu gen ổn định và không thay đổi. Alen và cộng sự (1995) đã đề xướng việc nhân giống in vitro C.roseus bằng cách nuôi dưỡng mô phân sinh ngọn và chồi nách từ những cây được nuôi trong nhà kính. Các tác giả đã sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung BA và 2,4-D ở nồng độ thấp. Những chồi nách này sẽ hình thành chồi ngọn sau 4-5 tuần nuôi cấy. Một phần những cành đã nhân giống được chuyển vào nuôi cấy tiếp trong môi trường tự do. Sau đó chúng được cắt và cho tạo rễ in vitro trong môi trường MS được bổ sung với NAA và phát triển trong nhà kính với độ ẩm tương đối 100%. Trong cả 2 trường hợp đều thành công. Furmanowa và cộng sự (1991, 1994) đã thành công trong việc áp dụng phương pháp này cho sự nhân giống cây C.roseus. Tác giả đã tái sinh những cây con từ chồi ngọn và chồi nách. Những chồi ngọn đã được cắt từ những cây con 7 ngày tuổi và nuôi trong môi trường rắn Nitsch và Nitsch (NN) (Nitsch và Nitsch 1969) được bổ sung thêm kinetin, bezyladenine, indole-3-butyric acid (IBA) và IAA kết hợp với nhau. Sau 2 tháng nuôi cấy những cây con có rễ được cắt và chuyển vào môi trường mới. Những cây này phải gồm có chồi ngọn hoặc chồi nách. Khoảng 200 cây con đang mọc rễ (hình 17a, b) đã được thu từ một cây con. Sau đó chúng sẽ phát triển trong nhà mái vòng bằng nhựa và trong nhà kính (hình 1c). Sau 5 tháng sinh trưởng chúng được thu nhận, sấy và cân. Việc phân tích thành phần hóa học của lá được thực hiện. Vindoline và catharanthine chiếm ưu thế trong giai đoạn còn non của cây (trước khi ra hoa). Hàm lượng alkaloid tổng trong lá của những cây được nuôi cấy in vitro rồi mới chuyển sang môi trường đất thì cao hơn những cây trồng chỉ trong đất. Hình 18: Sản phẩm mô sẹo và cây mọc từ hạt nhân tạo Cây C.roseus đã mọc rễ phát triển từ mô phân sinh ngọn trên môi trường NN bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 0.5 mg/l IBA sau 1 tuần nuôi cấy. Cây C.roseus đang ra hoa phát triển từ mô phân sinh ngọn trên môi trường NN bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 0.5 mg/l IBA sau 6 ngày chuyển qua. Cây C.roseus đang ra hoa trong nhà kính được nhân giống in vitro từ mô phân sinh ngọn. Dòng mô sẹo màu trắng nuôi cấy trên môi trường B5 bổ sung với 0.5 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA (sau 96 ngày chuyển qua). Dòng mô sẹo màu xanh nuôi cấy trên môi trường B5 có bổ sung 0.1 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA (sau 96 ngày chuyển qua) 4.2.5 Nuôi cấy rễ tơ Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là rễ tơ của C.roseus đã tăng lên đáng kể hơn cả mong đợi, như là một nguồn tiềm năng của những hợp chất có giá trị chữa bệnh này. Sự phát triển của kỹ thuật vi nhân giống cây và phương pháp để mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro là rất quan trọng và có thể trở thành giải pháp quan trọng để giải quyết việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô. Những yếu tố di truyền của rễ tơ, thu được bằng sự nhiễm với Agrobacterium rhizogenes, sản xuất hợp chất thứ cấp nhiều hơn là những cây tự nhiên. Hàm lượng alkaloid trong rễ tơ có thể tương đương hoặc cao hơn khi đối chiếu với hàm lượng đo được trong nghiên cứu ở rễ tự nhiên. Những alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vidoline và catharanthine, được tìm thấy với hàm lượng cao hơn trong rễ tự nhiên. Hình 19: Sản phẩm rễ tơ Rễ tơ của C.roseus xuất hiện sau 7-10 ngày ở những chỗ được cảm ứng với Agrobacterium rhizogenes chủng ATCC 15843. Rễ tơ của C.roseus nuôi cấy trong môi trường lỏng ½ B5 mà không có chất điều hòa tăng trưởng (11 ngày chuyển qua) Cây C.roseus đã được chuyển gen tái sinh từ rễ tơ trong môi trường lỏng ½ B5 không có chất điều hòa sinh trưởng. Hạt nhân tạo thu được từ đoạn rễ tơ C.roseus chứa trong gel calcium alginate Rễ tơ phát triển từ hạt nhân tạo C.roseus nuôi cấy trong môi trường rắn NN có bổ sung IBA 0.5 mg/l và kinetin 0.1 mg/l Rễ tơ phát triển từ hạt nhân tạo C.roseus nuôi cấy trên môi trường rắn NN bổ sung với IBA 0.5 mg/l và BAP 0.1 mgl/l Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào C.roseus Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng Hirata và cộng sự (1994) đã chứng minh rằng phytohormone (hormone thực vật) rất quan trọng cho sự tăng trưởng và phân chia hình thái của mô, dẫn đến sự hình thành và phát triển của chồi C.roseus, và cũng làm đa dạng hóa các alkaloid và làm tăng hàm lượng của chúng Tất cả chồi non nuôi cấy của C.roseus được cảm ứng hoàn toàn với tần số cao từ những hạt nảy mầm trên môi trường Murashige và Skoog (MS) (Murashige và Skoog 1962) được bổ sung thêm BA 1.1 mg/l (Hirata và cộng sự 1987). Kết quả nuôi cấy mặc dù chỉ gồm có mô sẹo mọc trực tiếp trên môi trường rắn và có một số chồi non với một vài lá nhỏ. Theo thông số thu được từ phương pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) của dịch trích nuôi cấy cho thấy rằng vindoline và catharanthine hiện diện chủ yếu trong cành non, đặc biệt là trong lá, trong khi ajmalicine (0.072 mg/g chất khô) tích lũy chính trong các mô sẹo. Hàm lượng catharanthine (0.370 mg/g chất khô) trong lá cây nuôi cấy cao hơn vài lần trong lá của những cây đối chứng (0.035 mg/g chất khô), trong khi hàm lựơng vindoline thì gần như bằng nhau trong cả hai trường hợp (lần lượt là 1.8 mg/g và 1.2 mg/g chất khô). Khi chuyển quá trình nuôi cấy vào môi trường không có BA đã kích thích sự phát triển của chồi non và dẫn đến sự gia tăng sản xuất vindoline và catharanthine đồng thời với việc ức chế sản xuất ajmalicine. Satdive và cộng sự (2003) nghiên cứu ảnh hưởng những nồng độ IAA và BA khác nhau lên sự sản xuất ajmalicine trong bình lắc (shake flasks) sử dụng chồi C.roseus để nuôi cấy. Những chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung IAA ở nồng độ cao và BA ở nồng độ thấp, đã tích lũy một lượng lớn ajmalicine. Với IAA ở nồng độ thấp và BA ở nồng độ cao thì chồi sẽ giải phóng nhiều ajmalicine vào môi trường. Quá trình sản xuất ajmalicine từ chồi nuôi cấy thì không tương quan với tốc độ tăng trưởng. Vinblastine và vincristine thì không hiện diện trong chồi nuôi cấy. Sự sinh tổng hợp alkaloid xảy ra trong lục lạp. Theo đó, sự hình thành những dimeric alkaloid có thể phụ thuộc vào mức độ khác nhau của lục lạp trong tế bào nuôi cấy in vitro. Loyola-Vargas và cộng sự (1986) đã thử nghiệm những chất điều hòa sinh trưởng khác nhau và ảnh hưởng của chúng lên việc cảm ứng mô sẹo xanh trong một dòng tế bào C.roseus 3 năm tuổi. Các tác giả đã xác định được cả vinblastine và vincristine trong cả hai dòng mô sẹo trắng và xanh. Hàm lượng của những alkaloid này trong dòng màu trắng cao hơn xấp xỉ 2 lần trong dòng màu xanh. Trong môi trường có bổ sung 3 mg/l benzylaminopurine (BAP) mà không có mặt auxin đã sản xuất hàm lượng chất diệp lục cùng với việc gia tăng hàm lượng dimeric alkaloid. Điều kiện nuôi cấy mô sẹo rất quan trọng cho việc sản xuất alkaloid. Morris (1986) đã thiết lập quá trình nuôi cấy mô sẹo từ lá của những cây C.roseus sử dụng 3 loại môi trường: môi trường Gamborg (B5), môi trường MS và Zenk với những thay đổi khác nhau (B5 với 2,4-D 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l; B5 với IAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l; MS với NAA1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l, môi trường Zenk bổ sung IAA 0.175 mg/l và BAP 1,125 mg/l, và chỉ một mình NAA, 2,4-D và zeatin 1.0 mg/l). Các tác giả cũng thử tiến hành nuôi cấy trong 2 điều kiện sáng và tối. Các mô sẹo hình thành có đặc trưng về màu sắc, hình thái và hàm lượng alkaloid. Bốn loại alkaloid: catharanthine, vindoline, ajmalicine và serpentine đã có mặt trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IAA và BAP. Serpentine là alkaloid chính tích lũy trong điều kiện sáng và ajmalicine tích lũy trong điều kiện tối. Miura và cộng sự (1987) đã cô lập vinblastine từ mô sẹo C.roseus hình thành từ những đoạn lá non. Môi trường MS có bổ sung NAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l đã được sử dụng. Các mô sẹo đã được nuôi cấy trong môi trường tối. Sự hiện diện của vinblastine trong mô sẹo của những rễ khác nhau đã được xác định bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) và phép đo phổ khối lượng. Lượng vinblastine (1μg/g chất khô), thấp hơn so với cây mẹ. Marfori và Alejar (1993) đã cho thấy khả năng sản xuất alkaloid của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống C.roseus, trắng và hồng tím. Các tác giả đã thu được tám dòng mô sẹo bằng cách sử dụng môi trường LS bổ sung BA 3.0 mg/l, 2,4-D 0.5 mg/l và nước dừa. Sau khi các mô được hình thành thì được chuyển vào môi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và được nuôi trồng trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng tím và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ. Theo báo cáo của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng đăng trên tạp chí phát triển khoa học và công nghệ thì mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn in vitro được nuôi trong môi trường MS (Murashige và Skoog) lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và cytokinin. Ở nồng độ 1 mgl-1 ∝-naphthaleneacetic acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận được sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu được sinh khối và alkaloid toàn phần thấp. Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến chúng, ví dụ như là cường độ ánh sáng hay bức xạ tử ngoại UV. Hirata và cộng sự (1991, 1992) đã phát hiện ra rằng mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn in vitro được nuôi trong môi trường MS (Murashige và Skoog) lỏng có bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau gồm có auxin và cytokinin. Ở nồng độ 1 mgl-1 ∝-naphthaleneacetic acid (NAA) và 0,5 mgl-1 kinetin (Kin) thu nhận được sinh khối và alkaloid toàn phần cao nhất trong khi cũng ở môi trường này nhưng thay thế NAA bằng 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở cùng nồng độ thu được sinh khối và alkaloid toàn phần thấp. Những kết quả này có thể cho thấy rằng ánh sáng NUV rõ ràng có thể kích thích sự tổng hợp leurosine và cũng tổng hợp vinblastine từ vindoline và catharanthine nhưng với mức độ ít hơn. Ảnh hưởng của nhiệt độ Ten Hoopen và cộng sự (2002) cho thấy rằng nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sản xuất ajmalicine từ huyền phù C.roseus. Nhiệt độ tối ưu cho cả hai quá trình thu sinh khối và sản xuất hợp chất thứ cấp là 27.50 C. Yuan và Hu (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của những sự kết hợp khác nhau của auxin, cytokinin và cường độ chiếu sáng lên sự hình thành của chồi cây C.roseus trong nuôi cấy in vitro. Các tác giả đã chứng minh rằng chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA được thêm vào môi trường MS theo thứ tự là 7.0 mg/l và 1.0 mg/l có tác dụng kích thích sự hình thành chồi non, trong khi 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ức chế sự phân hóa và hình thành của chúng. Cường độ chiếu sáng 550-700lux cho thấy là có ảnh hưởng tốt khi kết hợp đồng thời với môi trường MS bổ sung BA 2 mg/l và NAA 0-1.0 mg/l. Ảnh hưởng của nồng độ đường Theo báo cáo của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng đăng trên tạp chí phát triển khoa học và công nghệ thì mô sẹo đặc được đưa vào môi trường MS có chất điều hòa tăng trưởng thích hợp và bổ sung các nồng độ đường khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như bảng dưới. Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến sự nuôi cấy huyền phù tế bào Đồ thị 1: Đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào trong môi trường có bổ sung các nồng độ đường khác nhau Theo đó ta thấy rằng ở nồng độ đường là 60g/l cho lượng sản phẩm là cao nhất KẾT LUẬN Ứng dụng nuôi cấy tế bào C.roseus để sản xuất các hợp chất thứ cấp có ích đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1]. Viện dược liệu, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1. Nhà xuất bản khoa học & kỹ thuật Hà Nội. [2]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2006. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [3]. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006. Ảnh hường của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lê dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus. Tạp chí phát triển khoa học & công nghệ, tập 9, số 6. [4] Trần Chấn Đại, 2008. Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea để thu nhận hợp chất Flavonoid có hoạt tính sinh học. Luận văn thạc sĩ, đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo tiếng Anh [5]. Fattorusso, E., Taglialatela, O., 2008. Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology. Wiley-VCH, Weinheim, Germany. [6]. Pahwa, D., 2008. Catharanthus alkaloids. B.Pharm Punjab University Chandigarh. [7]. Guggisberg, A., Hesse, M., . Alkaloids. The University of Zurich. [8] Pietrosiuk, A., Furmanowa, M., Lata, B., 2007. Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques. Phytochem Review, 6:459-473. [9] H.Sutarno & Rudjiman, 1999. PROSEA, 12 (1)- Medicinal and Poisionous Plant; 190. [10] Murashige T., 1980. Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In: Skoog F, editor. Plant Growth Substances. Berlin: Springer-Verlag, pp.426-34. [11] Daugaard, H., 2001. Nutritional status of strawberry cultivars in organic production. Journal of Plant Nutrition. Vol 24, Iss 9, pp 1337-1346. [12] Gamborg, O.L., Murashige, T., Thorpe, T.A & Vasil, i.K., 1976. Plant tissue culture media. In Vitro. 12:473-8. [13] Eymar, E., Alegre, J., Toribio, M & Lĩpez-Vela, D., 2000. Effect of activate charcoal and 6-benzyladenin on in vitro nitrogen uptake by Lagerstroemia india. Plant cell, Tissue and Organ Culture. 16:23-37. [14] Bhojwani, S.S & Razdan, M.K., 1996. Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition. Elsevier Science B.V. The Netherlands