Báo cáo Các phương pháp lai phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI BÁO CÁO CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ NHÓM THỰC HIỆN: LÊ THỊ THÚY DUNG PHẠM MINH DUY DƯƠNG NGỌC KIỀU THI HỒ NAM VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 05/2008 CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ: Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA: Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền 2 mạch. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của pjản ứng. Hiện tượng “cộng hưởng” này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng nhất định thì hoàn toàn không có tác dụng. Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ một nút nhỏ thì toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào. Mạch đôi Hình 1_đường cong Tm. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm. (h.1.1). Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect). Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phần hấp thu ánh sáng ở bước sóng 260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song; cấu trúc đó che lấp 1 phần các base khiến chúng không hấp thu ánh sáng như những đơn vị toàn vẹn, khác với ở DNA mạch đơn. Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA: Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các liên kết hidro. Sự tách rời 2 mạch tương ứng với sự phá vỡ các liên kết ấy. Do đó, số lượng các liên kết và yếu tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử DNA. Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA: Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau (A=T; G C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỷ lệ các base G,C. Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C) Ảnh hưởng của độ dài DNA: Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2 mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn. Điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên. Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch): Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của 1 phân tử lai. Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho mỗi 1% phần trăm bắt cặp sai lệch. Nhưng cũng như thành phần các base, các mismatch chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn. Ảnh hưởng của môi trường phản ứng: Ảnh hưởng của nồng độ muối: Sự giảm lực ion ( nồng độ muồi) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh: nhiệt độ nóng chảy” .Tm sẽ giảm khỏang 150C cho mỗi logarithm nồng độ đối với các ion hóa trị I. Các cation hóa trị II còn có tác động mạnh hơn. Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA. Ảnh hưởng của Formamide: Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều. Đối với những đoạn dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau: ∆Tm = - 0,6 x (% formamide) Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ thong dụng là 50% tương ứng với việc hạ Tm xuống 300C. Trong thực tế, cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán Tm. Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm: Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - %mismatch 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide). Công thức này đúng cho những đọan DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trrong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na+. KHÁI NIỆM VỀ LAI PHÂN TỬ: Khái niệm về lai phân tử: Sau khi 2 phân tử của mạch DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột; lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới 1 cấu hình không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi 2 mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, 2 mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization), với 2 đặc điểm sau: Đặc hiệu tuyệt đối : Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung dẫu chúng chỉ có 2 bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu trình tự khác. Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA , dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA_DNA, RNA_RNA, hay các pân tử lai DNA_RNA. Hình 2a_Sự lai giữa DNA và RNA. Hình 2b_Quá trình lai DNA với DNA, lai DNA với RNA. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử: Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Để sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn xảy ra, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau. Như vậy, tần số gặp gỡ giữa 2 trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp. Ở 1 nhiệt độ xác định, 2 chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng. Nồng độ DNA nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng, kết quả là tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên. Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất trên càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp (lai). Hai thông số nói trên thường được xem xét đồng thời; tích số giữa nồng độ và thời gian được gọi là Cot (C: concentration_nồng độ; t: time_thời gian). Cot1/2 là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai. Nhiệt độ: Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt đố thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%. Độ dài của các trình tự : Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ sung. Lực ion: Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng. Một vấn đề quan trọng trong lai phân tử là tạo một đầu dò có đánh dấu phóng xạ. Thông thường người ta sử dụng đầu dò DNA bổ sung (cDNA). - Sử dụng cDNA tổng hợp từ mRNA có một số ưu điểm: 1. Việc phân lập mẫu mRNA chuẩn dễ dàng hơn so với phân lập mẫu gene DNA chuẩn cũng như tổng hợp đoạn primer và phân lập cDNA sau khi tổng hợp dễ hơn. 2. cDNA có thể lai với cả RNA và DNA mã hóa nên RNA đó, rất hữu hiệu trong phát hiện một lượng rất nhỏ RNA đặc hiệu. Hình 3_các bước chuẩn bị cDNA. Phương pháp chuẩn bị đoạn cDNA. Hầu hết mRNA chứa một chuỗi AAAA ở đuôi 3’, do đó chỉ cần tổng hợp đoạn primer chứa khoảng 15 T và cho bắt cặp với đầu 3’ của mRNA. Enzyme phiên mã ngược sau đó sẽ phiên mã một sợi DNA bổ sung từ đoạn primer TTTT này. Đoạn cDNA có thể được phân lập bằng cách nâng pH của dd, nhờ đó tách mạch lai và dùng enzyme phân hủy RNA. CÁC KIỂU LAI PHÂN TỬ: Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời có thể chia chúng thành 3 nhóm lớn: Lai trên pha lỏng. Lai trên pha rắn. Lai tại chỗ ( in situ hybridization). Lai trong pha lỏng: Nguyên tắc: Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Trong thực tế, nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 150C; hơn nữa, người ta còn thêm formamide để làm giảm nhiệt độ lai. Đối với những trình tự ngắn, nhiệt độ lai được tính theo những công thức nêu ở phần trên, đối với các trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 420C. Phân tích định lượng các phân tử lai: Ba phương pháp thường được sử dụng là: Phương pháp dùng quang phổ kế: Như đã đề cập ở phần trên, DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn. Do đó, trong phản ứng lai, sự giảm OD 260nm tương ứng với sự tăng số lượng các phân tử lai ( do sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn bổ sung). Các giá trị OD được đo với 1 quang phổ kế trong đó cuvet đựng mẫu đo có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ. Phương pháp sử dụng Nuclease S1: Nuclease S1 là 1 enzyme có khả năng thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm. Dung dịch phản ứng lai được trích ra 1 phần, đem xử lý với Nuclease S1. Các mạch đơn đều sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai. Chúng được thu nhận qua phương pháp tủa rồi được đem định lượng. Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite: Hydroxylapatite là những tinh thể phosphate calci. Ở nồng độ muối cao, chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn vào giá thể này, phần nucleic kkhông gắn vào giá thể sẽ được thu nhận. Sau đó, nếu tăng nồng độ phosphate lên, các nucleic acid đã gắn sẽ tách rời giá thể và được thu nhận riêng. Số lượng DNA gắn (mạch đôi) và không gắn vào giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ kế; từ đó tính được % tỉ lệ phân tử lai. Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng: Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 loài gần nhau: nếu không hiện diện với số lượng quá lớn, các mismatch (bắt cặp sai lệch) không ngăn cản hoàn toàn quá trình lai giữa những đoạn DNA lớn. Chúng chỉ làm giảm Tm (nghĩa là làm giảm độ bền vững) của các phân tử lai. Như vậy DNA có nguồn gốc từ 2 loài gần nhau, dù không tuyệt đối giống nhau, vẫn có thể lai được với nhau. Để tránh sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử ban đầu, DNA của 2 lòai phải có nồng độ rất khác nhau. Nếu phản ứng xảy ra hoàn toàn, tỷ lệ % các phân tử lai có thể được xem như tương ứng với tỷ lệ % các trình tự giống nhau giữa 2 lòai đó. Tỷ lệ càng cao thì 2 loài càng gần nhau trong cây tiến hóa. Hình 3_Đường cong tái bắt cặp của DNA ở động vật có vú và E.coli. Ở prokaryote, động học của sự tái bắt cặp biểu thị dưới dạng một đường cong đơn giản; điều này cho thấy vận tốc tái bắt cặp của tất cả các trình tự trên bộ gen là như nhau nghĩa là không có trình tự nào được lặp lại. Ở Eukaryote, đó là một đường cong phức tạp bao gồm nhiều đường cong đơn giản ; điều này cho thấy có 3 lọai trình tự DNA : (1)DNA có khả năng bắt cặp tức thời (Cot<10-3), tương ứng với các trình tự lặp lại rất nhiều lần, (2)DNA tái bắt cặp chậm hơn (10-3<Cot<10) tương ứng với các trình tự lặp lại vừa vừa, (3) DNA tái bắt cặp rất chậm (10< Cot <103) tương ứung với các trình tự duy nhất. 3. Phân tích các trình tự lặp lại : Trong 1 dd DNA, một trình tự lặo lại nhiều lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất. Động học tái bắt cặp của nó sẽ nhanh hơn so với trình tự duy nhất ; động học này càng lớn khi số lượng bản sao của trình tự lặp lại càng cao, như ở bộ gen của đọng vật có vú (hình 2). 4. Ứng dụng trong việc so sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại : ở prokaryote, bộ gen không chứa các trình tự lặp lại nên động học lai của tất cả các trình tự là như nhau. Do đó giá trị Cot1/2 chỉ phụ thuộc kích thước của bộ gen. Tính chất này được sử dụng để so sánh kích thước bộ gen ở các lòai sinh vật prokaryote. 2. Lai trên pha rắn : a. Nguyên tắc : lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là 1 trong 2 trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên 1 giá thể rắn. thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là dễ dàng trong thao tác và trong việv tách các trìng tự không lai ra khỏi các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử. Bù lại, việc phân tích và định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả lai thấp. Mặt khác, vận tốc lai trên pha rắn kém gấp 10 lần vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung. b. Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong phương pháp lai trên pha rắn : giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai. Có 2 loại màng lai : (1) màng lai bằng nitrocellulose_là loại giá thể được sử dụng đầu tiên, hiện nay không còn thông dụng do 2 nhược điểm : - độ bền cơ học kém nên khó thao tác. - không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác (2) màng lai bằng nylon : có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau (cần lọai bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới). c. Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn : trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn, có 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất : phương pháp Southern blot, Northern blot và Dot (SLot) blot. 1. SOUTHERN BLOT : - Mục đích : Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage,… - Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975 - Các bước tiến hành : 1. Cắt DNA thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng enzyme cắt giới hạn, đem điện di trên gel agarose. 2. Biến tính DNA thàng 2 mạch đơn bằng nhiệt ngay trên gel rồi chuyển lên màng lai. Trong quá trình chuyển, vị trí cá cđọang được giữ nguyên. 3. Đem lai các DNA được cố định trên màng này với các mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng. 4. Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai. Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dò được đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim. Hình 4_Sơ đồ lai Southern blot. Các ứng dụng quan trọng của Southern blot : - Lập bản đồ giới hạn của một gen. - Phát hiện các đa dạng trình tự (fragment polymorphism) của cùng một gen ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng. - Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn. Hình 5_Các bước thực hiện Sounthern blot. (A) hỗn hợp các đoạn DNA mạch đôi tạo bởi xử lý DNA bằng enzyme cắt đặc hiệu được tách ra theo độ dài bằng điện di trên gel. (B) Một bản nitrocellulose hoặc nylon được đặt lên trên gel, các tờ giấy thấm được đặt lên trên. Toàn bộ sẽ được đặt lên một lớp bọt biển trong dd alkali. Các đoạn DNA đã được tách rời sẽ được chuyển lên bản nitrocellulose (hoặc nylon) bằng blotting: dd đệm sẽ được hút lên qua gel → bản nitrocellulose → giấy thấm, mang theo các đoạn DNA. Khi di qua bản nitrocellulose, các đoạn DNA này sẽ được giữ lại và bám chặt trên đó. (C) bản nitrocellulose được gỡ cẩn thận ra khỏi lớp gel. (D) bản này được đặt vào trong một túi nhựa dán kín chứa dd đệm cùng với các đoạn đầu dò phóng xạ DNA có trình tự đặc hiệu mong muốn. Túi sau đó được để trong điều kiện thích hợp cho sự lai. (E) Bản được lấy khỏi túi và rửa sạch, để cho chỉ có những đầu dò đã lai với DNA trên bản được giữ lại. Sau khi chiếu tia X, các DNA đã lai với đầu dò sẽ cho một băng trên ảnh. 2. NORTNERN BLOT : - Mục đích : nhằm xác định kích thước và hàm lượng của 1 mRNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA. - Các bước thực hiện : 1. Biến tính RNA, điện di trên gel agarose để phân tách kích thước 2. Chuyển RNA lên màng lai. 3. Đem lai RNA trên màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. 4. các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Hình 6_Sơ đồ thực hiện Northern blot. 3. PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT : - Mục đích : dùng để phát hiện protein - Protein sau khi được chiết tách và điện di trên polyacrylamide gel sẽ được chuyển lân màng nitrocellulose. - Protein cố định trên màng tạo ra những vệt (blot) có thể thăm dò (probe) được nhờ sử dụng kháng thể. - Trước khi thăm dò, các vị trí còn trống trên màng được trám bằng protein để ngăn cản hiện tượng gắn không đặc hiệu của kháng thể lên màng. - Sau đó 1 loại kháng thể (primary antibody) có kháng nguyên chính là protein được xác định được thêm vào và kháng thể này sẽ gắn lên các vệt protein trên màng. - Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang một lọai enzyme sẽ bắt cặp với khácg thể ban đầu, enzyme trên phản ứng với cơ chế đặc hiệu tạo ra sản phẩm kết tủa có màu tại vị trí của phức hợp kháng nguyên_kháng thể . 4. DOT VÀ SLOT BLOT : - Mục đích : định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương phá này có thể sử dụng cho RNA. Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot hay 1 khe_Slot). Quá trình lai và phân tách phâan tử lai giống như đề cập ở phần trên. Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươ 5c phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu. Trong thục nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai. 3. Lai tại chỗ : a. Định nghĩa : Lai tại chỗ là 1 kiểu lai phân tử trong đó trình tự nuclic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. b. Nguyên tắc : Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng tế khỏi mô hay tế bào. c. Ứng dụng đa dạng : - Định vị gen trên NST. - Nghiên cứu 1 mRNA riêng biệt trong tế bào và mô. d. Các phương pháp lai tại chỗ : 1. LAI TRÊN NST : Phương pháp này cung cấp thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của 1 trình tự DNA cần tìm trên NST nhờ một mẫu dò chuyên biệt. Các NSt ở giai đoạn trung kì_các NST này thường có nguồn gốc từ bạch cầu_được xử lí bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame. SAu công đoạn loại bỏ RNA (bằng RNase) và protein (bằng proteinase K), NST cố định trên lame được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame 1 huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ. SAu 1 thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch. Lame được quan sát dưới kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai. Hình 7_lai trên NST. 2. LAI TRÊN KHUẨN LẠC : - Mục đích : phương [háp này được sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân hàng gen tức tập hợp caác dòng vi kkhuẩn tái tổ hợp được trải trên mặt thạch của hộp petri. Sau khi các khuẩn lạc (colony) đạt kích thước nhất định, người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt thạch. Hình 8_Sơ đồ lai trên khuẩn lạc. Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai ; màng lai sau đó sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khẩn và làm biến tính DNA. Việc cố định DNA trên màng và thao tác lai diễn biến theo cá bước tương tự như ở các phương pháp lai trên pha rắn khác. Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìn trên hộp petri ban đầu. Dòng này sẽ được thu nhận và phân tích. 3. LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MÔ : Trong tế bào và mô, các RNA, đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định. Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều h òa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô. Nghiên cứu trên mRNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể. Trong trường hợp đó, người ta thường sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô. Mô được xử lí bằng phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành những lát mỏng (7 đến 10 micromet), trải trên lame). RHAo tác xử lí mẫu, lai và phá hiện các phân tử lai giống như phương pháp lai trên NST. Kết quả được đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi. Phương pháp này thường được sử dụng trong các trường hợp sau : - Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ. Ở đây người ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó. - Các phương pháp miễn dịch tế bào cho phép xác định 1 protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trưng của nó. Khi phối hợp phương pháp mhiễn dịch tế bào và lai tại chỗ, người ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và proteincủa nó ; từ đó, xác định được mối tương quan giữa các hoạt động phiên mã và dịch mã của cùng một gen, - Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trìng sống. Hiện nay, kỹ thuật đánh dấu bằng mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn. Điều này đã tạo những bước nhảy vọt rất lớn cho các phương pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò được đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau. IV. KẾT LUẬN CHUNG VỀ TẦM QUAN TRỌNG: 1. Lai xuyên loài. 2. So sánh kích thước các bộ gen không chứa các trình tự lặp lại. 3. Lập bản đồ giới hạn của 1 gen, phát hiện các đột biến. 4. Tìm hiểu sự phân bố của mRNA, ảnh hưởng đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện và sự tương tác của chúng đến các thành phần khác của tế bào và mô. TÀI LIỆU THAM KHẢO Sinh Học Phân Tử_Hồ Huỳnh Thùy Dương_chương XI_Các phương pháp lai phân tử_trang 149 đến trang 164.