Báo cáo Ảnh hưởng của tần suât siêu âm đến kết quả thu tế bào trứng từ bò sống để tạo phôi in vitro

PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tần suất siêu âm ... 53 ẢNH HƯỞNG CỦA TẦN SUÂT SIÊU ÂM ĐẾN KẾT QUẢ THU TẾ BÀO TRỨNG TỪ BÒ SỐNG ĐỂ TẠO PHÔI IN VITRO (Kết quả bước đầu thực hiện năm 2006 ) Phan Lê Sơn1*, Nguyễn Văn Lý2, Nguyễn Thị Thoa2, Nguyễn Khánh Vân2 Vũ Ngọc Hiệu1 và Lưu Thị Ngọc Anh2 1Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi 2Phòng Thí nghiệm trọng điểm Tế bào động vật *Tác giả liên hệ: Phan Lê Sơn - Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội Tel: (04) 38.385.940 /0914.551.149; Email: sonphanle@yahoo.com ABSTRACT Effect of ovum pick up frequence on oocyte number and embryo production Phan Le Son*, Nguyen Van Ly, Nguyen Thi Thoa, Nguyen Khanh Van, Vu Ngoc Hieu and Lưu Thi Ngoc Anh One experiment aiming at examining the possible effect of two frequences of ovum pick up (one times vs two times/weeks) on oocyte number and embryo production was under taken. Ovum pick up was conducted using non surgical method with the ultra sound equipment. It was found that , there was no significant differentes in number of oocytes obtained between two frequences (5.1 vs 5.28). However, there was a significant differentes in number of embryos at morular and/on blastocyst stages between two frequences of ovum pick up (38.83% vs 42.48%). Key words: Ovum pick-up, oocyte number, embryo production , TTON ĐẶT VẤN ĐỀ Sản xuất phôi in vitro bằng nguồn tế bào trứng khai thác từ bò sống là một trong những phương pháp mới nâng cao hiệu quả công nghệ phôi. Phương pháp siêu âm thu tế bào trứng cho phép thu được những tế bào trứng chưa thành thục từ những gia súc cái đã được biết rõ nguồn gốc. Khi siêu âm thu tế bào trứng lặp lại kết hợp với việc cải tiến kỹ thuật tạo phôi in vitro có thể khai thác nhiều lần để tận dụng tối đa tiềm năng sinh sản của con cái, đặc biệt là những con có giá trị di truyền cao. Phương pháp siêu âm hút tế bào trứng trên bò sống và tạo phôi in vitro lần đầu tiên được nghiên cứu tại Viện Chăn nuôi từ năm 2005. Đây là phương pháp tiên tiến, đòi hỏi thiết bị siêu âm đắt tiền và trình độ cao của người thao tác. Kết quả thu tế bào trứng và chất lượng tế bào trứng thu được phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Để nâng cao hiệu quả kỹ thuật siêu âm thu tế bào trứng và tạo phôi in vitro, chúng tôi đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả thu tế bào trứng từ bò sống để tạo phôi in vitro. Nhằm xác định khoảng cách siêu âm hút tế bào trứng cho số lượng và chất lượng tế bào trứng là tốt nhất. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Gồm 5 bò lai hướng sữa (F2, n=2; F3, n = 3) , có năng suất sữa trên 5000 lít/chu kỳ, thể trọng > 400kg. Những bò này được cho ăn 40kg cỏ tươi và 4kg thức ăn tinh/ngày và được nuôi nhốt tại Trạm nghiên cứu thử nghiệm thức ăn chăn nuôi - Viện Chăn nuôi. Tinh cọng rạ HF nhập từ Mỹ có hoạt lực trên 40%, có năng suất sữa trên 10.000 lít/chu kỳ. Loại tinh này đã được kiểm tra năng suất qua đời sau. Bò nhận phôi là bò Lai Sind và bò lai VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 54 hướng sữa (F2, F3) có thể trọng >250kg, có chu kỳ sinh lý sinh sản bình thường và không mắc các bệnh về đường sinh dục. Nội dung nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của tần suất siêu âm đến số lượng tế bào trứng thu được Xác định ảnh hưởng của tần suất siêu âm đến kết quả tạo phôi in vitro. Phương pháp nghiên cứu Những con bò tốt đã được chọn lựa về mặt di truyền sẽ được sử dụng máy siêu âm hoặc khám qua trực tràng để xác định khả năng cho tế bào trứng, từ đó tiến hành thu tế bào trứng. Hút tế bào trứng được thực hiện mỗi tuần một lần và 2 lần. Quá trình hút tế bào trứng được tiến hành như sau: Cho bò vào giá cố định, lấy hết phân ra, rửa sạch, sát khuẩn âm hộ và khu vực xung quanh. Chuẩn bị hệ thống máy siêu âm, nối đầu dò âm đạo vào máy siêu âm. Nối kim hút tế bào trứng (kim 16G dài 55 cm), đặt máy tạo áp suất ở 120 mmHg, tương đương tốc độ dòng chảy 25 ml/phút. Chuẩn bị môi trường hút tế bào trứng (mDPBS của Sigma) có bổ sung 50 iu/ml heparin và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000 UI penicilin/ml + 100mg streptomycin/ml) duy trì ở nhiệt độ 370C bằng máy ổn nhiệt. Nhẹ nhàng cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng xác định vị trí của buồng trứng, vị trí các nang trứng rồi đưa buồng trứng về phía đầu quét của đầu dò, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm, đếm số nang trứng có mặt trên buồng trứng, Trước khi hút dịch nang trứng, hút một ít môi trường hút trứng để làm trơn hệ thống kim và ống dẫn. Sau khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon, tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện. Dịch hút được thu vào ống ly tâm 50ml và duy trì ở nhiệt độ 370C bằng máy ổn nhiệt. Sau khi hút xong một buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có đường kính lỗ lọc 20m, 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô trùng có đường kính 90mm để soi tìm tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi. Tế bào trứng thu được được đánh giá phân loại theo phương pháp của Loos và cs (1989). Sau khi đánh giá phân loại, tế bào trứng được nuôi thành thục trong môi trường TCM-199 có bổ sung 5% huyết thanh bê mới sinh trong 24 giờ, tiếp theo chúng được chuyển qua môi trường thụ tinh BO với mật độ tinh trùng 6,25x106/ml trong 5 giờ. Sau quá trình thụ tinh, hợp tử được tách tế bào cumulus và chuyển sang nuôi trong môi trường nuôi CR1 có bổ sung axit amin, huyết thanh bê mới sinh và albumin huyết thanh bò. Sau 7 ngày nuôi, những phôi dâu, phôi nang có chất lượng tốt được lựa chọn để cấy cho bò nhận động dục đồng pha hoặc đông lạnh bảo quản. Sau 3 tháng, khám thai qua trực tràng để xác định tỷ lệ có chửa. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học có sử dụng phần mềm Excel version 5.0 và Minitab Release 12. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại Viện Chăn nuôi từ tháng 2/2006 đến tháng 12/2006 PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tần suất siêu âm ... 55 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thu tế bào trứng từ bò sống Trong tổng số 276 lượt buồng trứng bò sống được thu tế bào trứng bằng phương pháp siêu âm, số tế bào trứng thu được là 1112, trung bình thu được 4,03 tế bào trứng/buồng trứng/lần (Bảng 1). Bảng 1. Thu tế bào trứng từ bò sống Chỉ tiêu Kết quả Số lượt buồng trứng siêu âm 276 Tổng số tế bào trứng thu được 1112 Tế bào trứng thu được/buồng trứng (Mean ± SE)/lần 4,03±1,41 Số nang trứng trung bình/buồng trứng/lần trong thí nghiệm của chúng tôi thấp hơn so với số liệu của Rizos và cs. (2005) ở cả bò hậu bị và bò cái sau đẻ (10,4 và 7,8 nang trứng/buồng trứng tương ứng). Tuy nhiên, số tế bào trứng bình quân thu được/buồng trứng/lần trong thí nghiệm của chúng tôi không sai khác nhiều so với kết quả các tác giả này (3,98 so với 4,7 ở bò hậu bị và 2,8 ở bò sau đẻ). Ảnh hưởng của khoảng cách thu tế bào trứng lặp lại Không có sự khác biệt về số lượng tế bào trứng thu được/buồng trứng bò cái/tuần giữa phương pháp siêu âm một lần một tuần so với hai lần một tuần. Với khoảng cách siêu âm một lần/tuần, số lượng tế bào trứng trung bình thu được/buồng trứng là 5,1. Trong khi đó, ở quy trình siêu âm 2 lần/tuần, số lượng tế bào trứng trung bình thu được là 5,28 (Bảng 2). Bảng 2. Ảnh hưởng của khoảng cách lặp lại đến kết quả thu tế bào trứng Tế bào trứng thu được/tuần Khoảng cách siêu âm Số lượt buồng trứng Được siêu âm n Mean 1 lần/tuần 156 795 5,10 2 lần/tuần 120 317 5,28 Kết quả siêu âm thu tế bào trứng lặp lại của chúng tôi còn thấp hơn kết quả của một số tác giả khác đã công bố. De Roover và cs. (2005) báo cáo trung bình thu được 5,6 tế bào trứng/buồng trứng/lần siêu âm. Theo Reis và cs. (2002), từ 24 bò hậu bị, bằng phương pháp siêu âm thu tế bào trứng lặp lại, các tác giả đã tiến hành chọc hút 8 lần trong tổng số 3234 nang trứng và thu được 1241 tế bào trứng (38,4% tương ứng). Trung bình thu được 7,2 tế bào trứng/bò/lần siêu âm thứ nhất và 5,7 tế bào trứng/bò/lần siêu âm lặp lại. Các tác giả Viana và cs. (2004) đã sử dụng 2 quy trình siêu âm hút tế bào trứng từ bò cái Gir và thấy rằng số lượng tế bào trứng thu được ở quy trình siêu âm 1lần/tuần là 8,9 tế bào trứng (chọc hút trên 11,6 nang) lớn hơn ở quy trình siêu âm 2lần/tuần là 7,0 tế bào trứng (chọc hút trên 12,1 nang) điều này tương ứng với tỷ lệ thu tế bào trứng ở quy trình thứ nhất là lớn hơn ở quy trình thứ hai (74,3% so với 59,0%). Như vậy, ở quy trình siêu âm 1lần/tuần tỷ lệ thu tế bào trứng của các tác giả là cao hơn của chúng tôi (74,3% so với 71,03%) còn ở quy trình siêu âm thứ 2lần/tuần tỷ lệ thu tế bào trứng của các tác giả lại cho kết quả thấp hơn của chúng tôi (59,0% so với 71,03%). Phân loại tế bào trứng thu được từ bò sống Sau khi thu được, tế bào trứng được chọn lọc, phân loại dựa vào chất lượng tế bào cumulus và VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 56 sự đồng nhất của khối nhân theo phương pháp của Loos và cs. (1989). Kết quả phân loại tế bào trứng được trình bày ở Bảng 3. Bảng 3. Phân loại chất lượng tế bào trứng thu được Tế bào trứng thu được Chất lượng n. % Loại A 400 35,97 Loại B 368 33,09 Loại C 54 4,86 Loại D 290 26,06 Loại sử dụng (A,B) 768 69,06 Chung 1112 100,0 Bảng 3 cho thấy, có sự khác nhau về tỷ lệ tế bào trứng thu được. Chất lượng tế bào trứng loại A là cao nhất, chiếm tỷ lệ 35,97%%, tiếp theo là tế bào trứng loại B và D (33,09% và 26,06% tương ứng); tỷ lệ tế bào trứng loại C thu được là thấp nhất, đạt 4,86%. Như vậy, tế bào trứng có thể sử dụng được đạt 69,06% (768/1112). Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B của chúng tôi cao hơn so với kết quả của một số tác giả khác đã báo cáo. Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B của chúng tôi (60,39%; 154/255) cao hơn tỷ lệ tế bào trứng loại I và II của các tác giả Viana và cs. (2004) khi sử dụng quy trình siêu âm mỗi tuần một lần (29,0%) và 2 lần một tuần (35%). Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi còn thấp hơn so với kết quả của Reis và cs. (2002) đã báo cáo. Theo các tác giả này, tỷ lệ tế bào trứng loại I và II thu được ở lần siêu âm 1 và 2 tương ứng là 54,9% và 46,8%. Ảnh hưởng của khoảng cách siêu âm đến chất lượng tế bào trứng thu được Tỷ lệ tế bào trứng loại A và B ở tần suất 2 lần và 1 tuần/ lần không có sự khác nhau đáng kể(35,3%; 35,65% so với 35,0%; 32,07%, tương ứng). Ngược lại, tế bào trứng loại D ở phương pháp thu tế bào trứng 2 lần một tuần thấp hơn so với một lần một tuần (20,88% so với 28,14%) (Bảng 4). Bảng 4. Ảnh hưởng của khoảng cách siêu âm đến chất lượng tế bào trứng thu được Chất lượng tế bào trứng Loại A Loại B Loại C Loại D Khoảng cách siêu âm n. % n % n. % n % 1 lần/tuần 278 35,0 255 32,07 39 4,90 224 28,14 2 lần/tuần 122 35,3 113 35,65 15 4,75 66 20,88 Chung 400 35,16 368 33,85 54 4,85 290 26,28 Kết quả thu tế bào trứng loại loại A, B của chúng ở phương pháp thu tế bào trứng 1 lần một tuần (66,9%) và hai lần một tuần (74,3) cao hơn tỷ lệ tế bào trứng loại I và II của các tác giả Viana và cs. (2004) khi các tác giả này sử dụng quy trình siêu âm hút tế bào trứng một tuần một lần (29,0%) và 2 lần một tuần (35%). Ảnh hưởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả tạo phôi in vitro Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã sử dụng 394 tế bào trứng được thu một tuần một lần và 153 tế bào trứng được thu hai lần một tuần để nuôi thành thục, thụ tinh và nuôi hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang. Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ hợp tử phân chia giữa tế bào trứng được thu một lần một tuần và tế bào trứng được thu hai lần PHAN LÊ SƠN – Ảnh hưởng của tần suất siêu âm ... 57 một tuần (53,8% so với 54,24%), nhưng có sự khác nhau về tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang (38,83% so với 42,48%) (Bảng 5). Bảng 5. Ảnh hưởng của khoảng cách siêu âm đến kết quả tạo phôi in vitro Phát triển của tế bào trứng in vitro Tế bào trứng phân chia Tế bào trứng phát triển Khoảng cách siêu âm Số tế bào trứng nuôi N % n % 1lần/tuần 394 212 53,80 153 38,83 2lần/tuần 153 83 54,24 65 42,48 Chung 547 295 53,93 218 39,85 Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Viana và cs. (2004) đã báo cáo. Theo các tác giả này, tỷ lệ hợp tử phân chia giữa tế bào trứng được thu một lần một tuần và tế bào trứng được thu hai lần một tuần tương ứng là 68,8% so với 68,6%), nhưng có sự khác nhau về tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi nang (31.8% so với 21,6%, tương ứng) Kết quả tạo phôi và cấy phôi tạo ra in vitro Từ 768 tế bào trứng loại A, B và C thu được từ bò sống bằng kỹ thuật siêu âm, đã có 547 (71,2%) tế bào trứng thành thục, 366 (66,91%) tế bào trứng thụ tinh, 295 (53,93%) hợp tử phân chia và 218 (39,95%) phôi dâu/phôi nang loại A, B và C thu được. Trong 20 phôi dâu/phôi nang loại A và B cấy cho bò nhận động dục đồng pha, có 6 trường hợp có chửa, đạt 30,0% và có 5 bê ra đời (Bảng 6). Bảng 6. Kết quả tạo phôi và cấy phôi tạo ra từ tế bào trứng thu từ bò sống Kết quả Chỉ tiêu n % Tế bào trứng được nuôi thành thục in vitro 768 Tế bào trứng thành thục in vitro 547 71,2 Tế bào trứng thụ tinh/tế bào trứng thành thục 366 66,91 Hợp tử phân chia/tế bàa trứng thành thục 295 53,93 Hợp tử phát triển/tế bàa trứng thành thục 218 39,85 Cấy cho bò nhận động dục đồng pha (n) 20 Bò có chửa 6 30,33 Bê sinh ra 5 25,0 Kết quả hợp tử phân chia trong nghiên cứu của chúng tôi còn thấp hơn so với kết quả của một số tác giả khác đã báo cáo khi sử dụng tế bào trứng thu từ bò sống (Galli và cs. 2001: 64,4%; Reis và cs. 2002: 81,1%; Rizos và cs. 2005: 80,8%). Tuy nhiên, Tỷ lệ hợp tử phát triển trong nghiên cứu của chúng tôi (39,85%) cao hơn tỷ lệ của của Galli và cs. (2001) (25,39% ) đã công bố. Tỷ lệ có chửa (30,0%) trong nghiên cứu của chúng tôi còn thấp hơn so tỷ lệ của Galli và cs. (2001) đã báo cáo (55,4%). KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Không có sự khác biệt về số lượng tế bào trứng trung bình thu được/bò/tuần giữa phương pháp siêu âm thu tế bào trứng lần một tuần so với hai lần một tuần (5,10 so với 5,28). Tuy nhiên, có sự khác nhau về tỷ lệ hợp tử phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang giữa phương pháp siêu âm thu tế bào trứng lần một tuần so với hai lần một tuần (38,83% so với VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 21-Tháng 12-2009 58 42,48%). Do vậy để thu được nhiều số lượng tế bào trứng, tạo phôi, cấy phôi và tăng nhanh số lượng đàn bê sinh ra có giá trị di truyền cao ở khoảng cách siêu âm hút tế bào trứng 1 tuấn 2 lần cho kết quả tốt nhất. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu để tăng số lượng tế bào trứng thu được/lần siêu âm thu tế bào trứng. TÀI LIỆU THAM KHẢO De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P. and Dessy, F. (2005). Ovum pick up and in vitro embryo production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol. Animal Reproduction Science 86: 13 – 25. Galli, C; Crotti, G; Notari, C; Turini, P; Duchi, R; Lazzari, G. (2001). Embryo Production by ovum pick up from live donors. Theriogenology 55: 1341-1357. Loos, C. Van Vliet, P.Maurik and M. A. Th. Kruip (1989). Morphology of immature bovine oocytes. Gemete Research 24: 197-204 Reis , A., Steines, M.E., Watt, R.G., Dolman, D.F., McEvoy, T.G. (2002). Embryo production using defined oocyte maturation and zygote culture media following repeated ovum pick-up (OPU) from FSH- stimulated Simmental heifers. Animal Reproduction Science 72: 137-151. Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P. and Lonergan, P. (2005). Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro. Theriogenology 63: 939-949. Viana, JHM. Camargo, LSA., Ferreira, A.M. (2004). Short intervals between ultrasonographically guided follicle aspiration improve oocyte quality but do not prevent establishment of dominant follicle in the Gir breed of cattle. Animal Reproduction Science 84: 1-12. *Người phản biện: TS. Nguyên Thạc Hòa; Ths.Trinh Văn Thân