Bài giảng Vi sinh vật học đại cương - Chương 2 Sinh lý học của vi sinh vật

Chương 2 Sinh lý học của vi sinh vật Lời cảm ơn Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên, Trưởng bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã dày công biên soạn bộ bài giảng này! I. Khái niệm : Sinh lý học của vi khuẩn là khoa học về sự dinh dưỡng, sinh trưởng và các chức năng sống khác của vi khuẩn. Nội dung cụ thể: + Nghiên cứu thành phần hoá học + Quy luật và cơ chế của : - Sự dinh dưỡng - Hô hấp - Sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. II. Thành phần hoá học của tế bào VSV Chủ yếu là nước và một phần vật chất khô. 1. Nước: Chiếm 70 - 80% trọng lượng tế bào, tồn tại ở hai dạng: + Nước kết hợp : - Tham gia vào thành phần chất keo của NSC tế bào - Tạo môi trường thích hợp cho phản ứng sinh học nôi bào - Nước liên kết rất khó tách ra - Mất nước liên kết  cấu trúc tế bào bị phá huỷ, tế bào chết. + Nước tự do: - Là dung môi cho các chất vô cơ, hữu cơ hoà tan - Tham gia vào các phản ứng thủy phân trong tế bào. - Nguồn cung cấp ion H+ , OH – - Dễ bay hơi khi sấy khô, mất nước tự do khô tế bào, TĐC bị ảnh hưởng sâu sắc 2. Chất khô Chất khô trong tế bào chiếm từ 15- 25% trọng lượng tế bào gồm: Chất hữu cơ và chất khoáng + Chất hữu cơ : Các chất hữu cơ chiếm 85 % vật chất khô, gồm có: - Protit: Chiếm tỷ lệ lớn trong tổng số chất hữu cơ :50 - 80% trọng lượng khô tế bào . Protein của nấm men : 40 – 60 % . Protein của nấm mốc : 15 – 40 % . Protein của vi khuẩn : 60 – 80 % . Protein của tảo hiển vi: 40 – 50 % Protit gồm 2 loại: . Là những protein đơn giản như albumin, globulin đó là các chất dự trữ. . Protit phức tạp ( proteit) có vai trò sinh học quan trọng trong tế bào như Nucleoprotein, lipoprotein , glucoprotein + Gluxit: - Chiếm tỷ lệ tương đối cao trong tế bào - Hàm lượng gluxit thay đổi tuỳ loại VSV: . Vi khuẩn : 10 – 30 % trọng lượng khô . Nấm men : 27 – 63 % . Nấm mốc : 40 - 60 % - Tồn tại ở hai dạng: đơn giản (ozơ) và phức tạp (ozit) -- Đóng vai trò quan trọng trong tế bào: . Tham gia cấu trúc tế bào (màng, giáp mô, axít Nucleic..) . Là nguyên liệu chủ yếu cho hô hấp của tế bào . Thức ăn dự trữ của tế bào . + Lipit: - Lipit chỉ chiếm số lượng ít :3 – 7 % trọng lượng khô Ơ nấm men, mốc lượng lipit có thể có tới 40 %. Ơ vi khuẩn chỉ có 1 – 3%. Riêng VK lao, lipit trong tế bào có tới 45 % - Lipit tồn tại ở 2 dạng .Dạng đơn giản là các hạt mỡ dự trữ. .Dạng phức tạp là lipoprotein, phospholipit... - Tham gia cấu trúc màng NSC, màng tế bào, - Là nguồn nguyên liệu năng lượng .Sắc tố: - Sắc tố có nhiều loại, khác nhau về màu sắc: đỏ, xanh, đen, vàng, tím, và khác cả về tính chất lý học, hoá học.. - Sắc tố chứa chủ yếu trong dịch bào làm cho VSV có màu sắc Một số VSV sắc tố ở dạng hạt nằm rải rác trong NSC, một số VSV khác sắc tố tiết ra ngoài môi trường - Chức năng: . VSV tự dưỡng thu năng lượng mặt trời . Tránh tác động của tia tử ngoại ( VSV hoại sinh) . Một số sắc tố có khả năng kháng khuẩn Một số chất hữu cơ khác: - Các axit hữu cơ: axit oxalic, xitric - Muối của axit hữu cơ - Vitamin : tiền vitamin A, vitamin B, C, K, PP Trong tế bào VSV, phần lớn các loại coenzym là vitamin hoặc dẫn xuất của vitamin . Vitamin được hấp thu từ môi trường hoặc do VSV tổng hợp ra từ các hợp chất hữu cơ khác . Vitamin cần thiết cho VSV phát triển, một số VSV muốn phát triển bình thường phải được cung cấp 1 hoặc nhiều loại vitamin Chất khoáng: - Chiếm số lượng ít trong tế bào VSV( 15 % vật chất khô), - Chúng có trong thành phần của các hợp chất hữu cơ phức tạp: proteit, vitamin, enzym - Giữ vai trò quan trọng trong hoạt động sống của tế bào Giữ áp suất thẩm thấu nội bào ở mức bình thường - Lượng chất khoáng thay đổi tuỳ loại VSV, tuỳ giai đoạn và điều kiện phát triển - Chất khoáng được chia làm hai loại: + Nguyên tố đa lượng: + Nguyên tố vi lượng: III. Dinh dưỡng của vi sinh vật 1. Khái niệm: + Chất dinh dưỡng: Là những chất được VSV hấp thu từ môi trường xung quanh và được sử dụng cho quá trình trao đổi chất của tế bào Ví dụ: . Axit amin . Các loại đường đơn . N2 , CO2 , NH3 , . + Quá trình dinh dưỡng: Là quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào VSV 2. Nhu cầu thức ăn của VSV Ví dụ: Vi khuẩn cần lượng thức ăn bằng trọng lượng cơ thể của chúng. Bởi vì : . Cần thức ăn cho việc kiến tạo . Cung cấp năng lượng cho quá trình sống . Cần thức ăn cho quá trình sinh sản ( VK sinh sản rất nhanh 20 - 30 phút sinh sản một lần và theo cấp số nhân 1 tế bào/ 24 giờ  47.146,9 x 106 tế bào) Nhu cầu về thức ăn cuả VSV có thể chia làm 3 loại: + Thức ăn cung cấp năng lượng: cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của VSV như: gluxit, lipit, protein , NH3 + Thức ăn kiến tạo: sau khi hấp thụ được tiêu hoá, chế biến lại thành nguyên liệu tham gia xây dựng cấu trúc tế bào như: gluxit, lipit, protein , N2 ,CO2 • + Thức ăn đặc biệt: • Là những chất cần thiết đối với hoạt động sống của VSV mà một loài nào đó không thể tự tổng hợp được. • Ví dụ : • - Axit amin không thay thế • - Vitamin... Vikhuẩn Streptococcus cần B1 3. Các kiểu dinh dưỡng của VSV Thành phần cơ bản cấu tạo lên tế bào VSV gồm 4 nguyên tố chính :C, H, O, N + Dinh dưỡng cacbon: Các bon chiếm > 50 % vật chất khô của VSV Là yếu tố rất quan trọng trong các hợp chất có mặt trong tế bào Trong tự nhiên cac bon tồn tại ở 2 dạng - Hợp chất cac bon vô cơ : CO2 , muối cacbonát . - Hợp chất cac bon hữu cơ: gluxit, lipit, protein.. Tuỳ thuộc khả năng sử dụng nguồn các bon, người ta chia VSV làm 2 nhóm VSV tự dưỡng các bon: . Là các VSV có thể sử dụng nguồn cacbon vô cơ như CO2 và muối cacbonat . Dựa vào nguồn cung cấp năng lượng, người ta chia kiểu tự dưỡng cacbon làm 2 loại: - VSV tự dưỡng C quang năng: . có sắc tố quang hợp (Bacterioclorophil) . Có khả năng chuyển hoá trực tiếp năng lượng của ánh sáng mặt trời thành năng lượng hoá học tích luỹ lại trong ATP . Sử dụng năng lượng này để chuyển cacbon vô cơ thành cacbon hữu cơ cần thiết cho cơ thể. Ví dụ: Quá trình quang hợp của VK lưu huỳnh màu lục (Green sunfua bacteria): ánh sáng mặt trời Lục tố vi khuẩn CO2 + 2H2S (C6H12O6) + H2O + 2S Tương tự cây xanh: CO2 + 2H2O (C6H12O6) + O2 Ánh sáng mặt trời Diệp lục Như vậy cả hai phản ứng đều sử dụng quang năng để tạo thành các hợp chất cacbon hữu cơ từ CO2 và một chất khác. Điều khác nhau cơ bản ở đây là: Vi khuẩn lưu huỳnh thu H từ H2S, giải phóng S. Cây xanh thu H từ H2O giải phóng O2. 1 6 Do đó công thức tổng quát của quá trình quang hợp là: ánh sáng Sắc tố quang hợp CO2 + 2H2A (C6H12O6) + H2O + 2A Trong đó A là một chất vô cơ. -VSV tự dưỡng C hoá năng: . Là nhóm VSV sử dụng năng lượng của các phản ứng oxy hoá để chuyển nguồn C vô cơ thành chất hữu cơ cần thiết cho cơ thể . Ví dụ: Vi khuẩn Nitrocomonas sử dụng năng lượng của phản ứng oxy hoá NH3. 2NH3 + 3O2 2HNO2 + 2H2O 158 calo CO2 + 4H+ (C6H12O6) + H2O O2 4H+ 1 6 1 6 Vi khuẩn lưu huỳnh (Green sunfua bacteria) cũng có kiểu hoá năng: Từ đó vi khuẩn khử CO2 trong không khí: Từ các phản ứng trên có thể rút ra công thức tổng quát dạng dinh dưỡng hoá năng như sau: + H2S + O2 2H2O + S + 126 calo O2 4H+ + CO2 + 4H+ (C6H12O6) + H2O 126 calo Chất vô cơ : H2M + O2 Chất oxy hoá + Q (năng lượng) CO2 + 4H + (C6H12O6) + H2O Q 1 6 1 6 Như vậy ở nhóm VSV tự dưỡng C hoá năng, để đồng hoá C phải gồm 2 bước: + Bước 1: Oxy hoá hợp chất vô cơ để giải phóng W + Bước 2: Nhờ có W chuyển C vô cơ -- > C hữu cơ Ơ VSV 2 quá trình này diễn ra song hành VSV tự dưỡng C hoá năng có chuyên tính cao Ví dụ: Vi khuẩn Nitrocomonas chỉ oxy hoá NH3. + Vi sinh vật dị dưỡng cacbon: - Là những VSV chỉ có thể sử dụng C ở dạng hợp chất hữu cơ sẵn có trong môi trường làm nguồn dinh dưỡng xây dựng cơ thể và cung cấp W cho hoạt động sống của VSV. • Dựa vào nguồn cung cấp các hợp chất hữu cơ,nhóm VSV này chia làm 2 loại: + VSV ký sinh: . Là loại VSV sử dụng nguồn C từ các hợp chất hữu cơ có sẵn trên cơ thể vật chủ +VSV hoại sinh: . Là các VSV chỉ sử dụng nguồn C từ những hợp chất hữu cơ có ở các xác chết động, thực vật Dinh dưỡng Nitơ . Nitơ có ý nghĩa quan trọng với sự phát triển của VSV Nitơ tồn tại ở 2 dạng: + Nitơ vô cơ: - Nitơ phân tử( N2 ): Chiếm một lượng nhiều nhất và chính là đạm của khí quyển. Trong không khí, N2 chiếm 75,5% về trọng lượng, 78,1% về thể tích. Tính ra trong khí quyển hành tinh chúng ta có tới 4 triệu tỷ tấn (4.1015 tấn) - Nitơ vô cơ hữu hiệu: Tồn tại dưới dạng muối amon ( NH3 + ), nitrat ( NO3 - ), số lượng bằng 1% lượng đạm hữu cơ: + Nitơ hữu cơ: Có chủ yếu trong sinh vật và các sản phẩm không hoàn toàn của chúng. . Lượng đạm này có khoảng 10 - 25 tỷ tấn. Vi sinh vật có thể sử dụng nguồn Nitơ ở cả 3 dạng trong thiên nhiên. Tuỳ nguồn Nitơ VSV sử dụng, người ta chia dinh dưỡng Nitơ làm 2 loại: + VSV tự dưỡng amin: . Là nhóm VSV có khả năng sử dụng nguồn Nitơ vô cơ hoặc các hợp chất Nitơ hữu cơ đơn giản như axit amin, protein, ure để tạo lên các axit amin và thành phần chứa Nitơ trong tế bào. . Đối với N2 chỉ những VSV có khả năng cố định Nitơ mới sử dụng được. Loại VSV có hệ enzym Nitrogenaza phong phú, loại này có 2 loại: - VSV cố định Nitơ không cộng sinh như: . Vi khuẩn Azotobacte ( A. chrococcum), hiếu khí . Vi khuẩn Beijerinskii . Vi khuẩn Clostridium ( Clos. pasteurianum), yếm khí - VSV cố định Nitơ cộng sinh như: . Vi khuẩn nốt sần cây họ đậu (Rhizobium) . Vi khuẩn lam Các VSV tự dưỡng amin có vai trò rất quan trọng trong chu trình chuyển hoá đạm trong tự nhiên. Nhờ có VSV, lượng đạm trong tự nhiên luôn được chuyển hoá từ dạng này sang dạng khác để sinh vật có thể hấp thu, duy trì sự sống. Ta có chu trình đạm trong tự nhiên: Protein vi sinh vật Protein động vật Protein thực vật NH3 VSV amon hoá đồng hoá đạm vô cơ đồng hoá đạm vô cơ VSV Nitrat hoáNO3 VSVcố định Nitơ phân tử N2 VSV phản nitrat hoá Dồng hoá đạm vô cơ + VSV dị dưỡng amin: - Gồm những VSV chỉ có khả năng sử dụng Nitơ ở dạng hữu cơ - Các axit amin này phải được VSV sử dụng một cách nguyên vẹn để tổng hợp lên protit của VSV Có thể thấy sự khác nhau giữa vi sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng amin qua sơ đồ sau: Protein Peptit Axit amin VSV tự dưỡng NH3 NO3 N2 Protein vi sinh vật 3. Cơ chế của sự dinh dưỡng . Để duy trì sự sống tế bào, VSV phải trao đổi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. . VSV không có cơ quan tiêu hoá và bài tiết .Toàn bộ quá trình trao đổi vật chất được thực hiện nhờ màng NSC của tế bào. . Các chất dinh dưỡng qua màng NSC để vào cơ thể, sản phẩm cặn bã đều qua màng ra ngoài. . VSV hấp thu thức ăn một cách chọn lọc và chỉ hấp thu được các chất có cấu trúc phân tử đơn giản, dễ hoà tan. Người ta thấy rằng: + Axit amin, chuỗi peptit ngắn có 3 – 5 a.a + Gluxit chỉ ở dạng đường đơn VSV mới hấp thu được Proteaza vi sinh vật Peptitaza vi sinh vật Lipaza vi sinh vật Amilaza Xellulaza Monopeptit axit amin Glucoza Polypeptit glyxerin + axit béo Dextran Protit Lipit Gluxit Để hấp thu được các chất dinh dưỡng VSV phải nhờ các ngoại enzim tiết ra môi trường Enzym phân huỷ các hợp chất cao phân tử  các chất đơn giản, dễ hoà tan rồi mới hấp thu qua màng NSC. Sự thẩm thấu của các chất dinh dưỡng qua màng NSC là một quá trình lý hoá phức tạp, phụ thuộc vào điều kiện sau: - Khả năng thẩm thấu của màng - Nồng độ chất dinh dưỡng ở trong và ngoài màng - Độ pH môi trường - Điểm đẳng điện của tế bào VSV Cơ chế của sự hấp thu Màng NSC tế bào có khả năng điều chỉnh tinh vi sự ra vào của các chất Tế bào nhận và thải các chất một cách chọn lọc. Sự vận chuyển các chất qua màng NSC tuân theo một trong các cơ chế sau: + Cơ chế vận chuyển thụ động: Cơ chế vận chuyển này không tiêu tốn W . Theo kiểu này các chất đi qua màng NSC nhờ sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa môi trường và tế bào. .Chiều đi của các chất từ nơi có nồng độ cao  nồng độ thấp .Trong quá trình trao đổi chất chỉ có nước, CO2 và một số ít axit béo qua màng theo cơ chế này. . *Cơ chế vận chuyển tích cực: . Theo cơ chế này các chất muốn qua được màng NSC phải liên kết với Protein vận chuyển (Pecmeaza) . Pecmeaza nằm ở lỗ màng NSC . Pecmeaza được tổng hợp theo kiểu cảm ứng . Pecmeaza vận chuyển chon lọc 1 hay vài cơ chất . Dựa vào việc cần hay không cần W trong quá trình vận chuyển mà cơ chế vận chuyển này có 2 phương thức: + Phương thức vận chuyển thụ động: - Theo phương thức vận chuyển này không cần chi phí năng lượng của tế bào - Cơ chất liên kết thuận nghịch với pecmeaza nằm ở lỗ màng tạo phức hợp: Pecmeaza + cơ chất - Hướng đi của cơ chất theo kiểu xuôi dòng: nồng độ cao  nồng độ thấp Ơ VSV có nhân thật thường vận chuyển theo cơ chế này Bên ngoài tế bào Màng nguyên sinh Bên trong tế bào S S S S S P S P SP S S P S S PP PHƯƠNG THỨC VẬN CHUYỂN THỤ ĐỘNG Phương thức vận chuyển chủ động: .Trong quá trình hấp thu chất dinh dưỡng VSV có khả năng tích luỹ một số chất với nồng độ cao hơn nhiều so với bên ngoài .Sự vận chuyển trong trường hợp này là sự vận chuyển chủ động theo kiểu ngược dòng. .Quá trình này cần phải tiêu tốn W . W này do ATP của tế bào cung cấp Theo cơ chế này: + Pecmeaza ở trạng thái chưa hoạt động( Pi) + Nhờ W của tế bào cung cấp: Pi  Pecmeaza hoạt đông(P) + Pecmeaza liên kết với chất dinh dưỡng  được vận chuyển vào bên trong tế bào . + Trong tế bào nồng độ chất dinh dưỡng cao, pecmeaza không thể tách chất dinh dưỡng này ra được  tế bào cung cấp W để pecmeaza tách khỏi cơ chất  Pi  được chuyển ra lỗ màng.Pi ở trạng thái không hoạt động. PHƯƠNG THỨC VẬN CHUYỂN CHỦ ĐỘNG Bên ngoài tế bào Màng nguyên sinh Bên trong tế bào S S S S P S Pi Q P S S Pi S PP ATP ADPATP ADP P S S Q Cơ chế vận chuyển nhóm: - 1964, Kundig phát hiện ở vi khuẩn E. coli một hệ thống vận chuyển: hệ thống PTS (Phosphat Transferaza ) - Hệ thống này vận chuyển hầu hết các loại đường vào tế bào VK - Hệ thống PTS gồm 2 enzym E1, E2 và một protein chứa Histidin (PrH) - Hệ thống PTS được phân tử PEP(Phosphat Enol Pyruvic) cung cấp năng lượng(- P) . Enzym E1 xúc tác chuyển dây nối năng lượng P cho PrH  PrH- P .Enzym này chung cho nhiều loại đường . Enzym E2 chuyển C6 của đường đơn đến PrH- P (E2 đặc trưng cho từng loại đường, vai trò của nó giống như Pecmeraza) . Glucoza khi qua màng  glucoza- 6- P Cơ chế vận chuyển nhóm Bên ngoài tế bào Màng NSC Bên trong tế bào Glucoza – 6 P Glucoza E2 PrH E1 PEP E2 – Glucoza PrH -- P 4. Sự chuyển hoá các chất bên trong tế bào VSV MĐ: xây dựng tế bào, cho sinh sản, cung cấp W Toàn bộ quá trình này gồm: + Trao đổi W: còn gọi là quá trình hô hấp. Hô hấp ở VSV có điểm khác với động, thực vật . Cần Oxy(hiếu khí), không cần Oxy (yếm khí) . Chất oxy hoá có thể là chất hữu cơ hoặc vô cơ . Một phần W chuyển thành nhiệt năng làm nóng môi trường - Hô hấp của VSV là quá trình oxy hoá khử các chất hữu cơ, vô cơ trong tế bào để tạo thành những chất đơn giản nghèo năng lượng - Năng lượng giải phóng ra được cất giữ vào các mạch cao năng của ATP rồi cung cấp dần cho các hoạt động sống của VSV - Nguyên liệu cho quá trình oxy hoá chủ yếu là gluxit: . C6H12O6 + 6O2  6CO2 + 6H2O + 2824 Kc . C2 H5 OH + O2  CH3 COOH + H2O + 486 Kc . C6H12O6  2C2 H5 OH + CO2 + 115 Kc - Nguyên liệu cho quá trình oxy hoá là chất vô cơ 2NH3 + 3O2  2HNO2 + 2H2O +158 Kc Dựa vào tính chất có sử dụng O2 hay không trong quá trình hô hấp, người ta chia hô hấp của vi khuẩn thành hai loại: Cơ chất O- H2O + W ADP ATP Hô hấp hiếu khí Đây là một quá trình rất phức tạp, có nhiều enzym tham gia: xytocrom, xytocrom oxydaza, peroxydaza. Cơ sở của quá trình hô hấp hiếu khí ở vsv là sự oxy hoá Hydro trong cơ chất, vận chuyển đến vật tiếp nhận là O2 để tạo ra H2O. Trong quá trình vận chuyển đó W giải phóng ra từ từ, tích luỹ vào các mạch nối cao năng của ATP để cung cấp cho các hoạt động sống của VSV. H+ H+ Hydro tách ra không trực tiếp kết hợp với O2 được vì quá trình này sẽ giải phóng ra W lớn,ồ ạt có thể giết chết VSV. Hydro phải được đưa qua nhiều chất trung gian nhờ vào một hệ thống men vận chuyển cuối cùng mới đến kết hợp với Oxy tạo thành H2O và W được tích luỹ từ từ vào ATP. Hô hấp yếm khí của VSV - Hô hấp yếm khí ở VSV là quá trình không có Oxy tham gia -Người ta gọi quá trình này là quá trình lên men. - Sự oxy hoá ở đây là có việc tách H2 ra khỏi cơ chất, chuyển qua nhiều trạm, đưa đến vật nhận nào đó không phải là Oxy - Cơ chất chủ yếu của quá trình hô hấp yếm khí là gluxit. - Khác với hô hấp hiếu khí, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men ngoài CO2 còn có các hợp chất cacbon chưa được oxy hoá hoàn toàn như rượu, axit hữu cơ... Dựa vào sản phẩm cuối cùng của quá trình này mà người ta đặt tên quá trình lên men: Ví dụ: . Lên men etylic . Lên men axetic... Môt số quá trình lên men: + Lên men Etylic - Dưới tác dụng của một số loại VSV, trong điều kiện yếm khí đường gluoza được phân giải thành rượu etylic và CO2 , đồng thời giải phóng W - Quá trình tóm tắt: C6H12O6  2C2 H5 OH + 2CO2 + 115 Kc - Nhiệt độ thích hợp cho lên men: 15 – 250 C - Ưng dụng: . Sản xuất rượu dùng Sacchromyces cerevisiae .Sản xuất bia dùng Sacchromyces carlsbergensis . Sản xuất rượu vang Sacchromyces vini . Men nở bột mỳ Sacchromyces cerevisiae .Sản xuất protein nấm men: S. cerevisiae,Candida, Torula Lên men Lactic: - Dưới tác dụng của một số loại VSV, trong điều kiện yếm khí,đường gluoza được phân giải thành a. lactic và CO2 , đồng thời giải phóng W - Quá trình tóm tắt: C6H12O6  2CH3- CHOH- COOH + 94 Kc - Lên men lactic dị hình ngoài sản phẩm axit lactic còn có các sản phẩm phụ: axit axetic, etylic, CO2,, H2 - Nhiêt độ thích hợp tuỳ loại vi khuẩn thường từ 200 C – 45o C - Ưng dụng: . Sản xuất axit lactic . Chế biến sữa chua dùng: Streptococcus lactic Streptococcus bulgaricus . Chế biến pho mát dùng : Lactobacillus casei . Muối dưa, ủ chua thức ăn: Lactobacillus plantarum Lên men butylic: - Dưới tác dụng của một số loại VSV, trong điều kiện yếm khí,đường gluoza được phân giải cho axit butylic và CO2 , đồng thời giải phóng W - Quá trình tóm tắt: C6H12O6  2CH3 CH2CH2 COOH + H2 + CO2 + W - vi khuẩn lên men butylic: VK yếm khí . Clostridium butylicum . Clostridium pasteurianum . Clostridium lactoacetophilum - Ưng dụng: . Sản xuất axit butylic . Điều chỉnh điều kiện lên men sản xuất butanol, axeton . Trong đất lượng axít này tích nhiều dẫn đến bất lợi cho cây trồng . Quá trình lên men butylic cũng gây ảnh hưởng xấu trong bảo quản hoa quả, thực phẩm, muối dưa, ủ chua thức ăn trong chăn nuôi Lên men propionic: - Dưới tác dụng của một số loại VSV, trong điều kiện yếm khí,đường gluoza được phân giải cho axit propionic, axetic và CO2 , đồng thời giải phóng W - Quá trình tóm tắt: 3C6H12O6 4CH3CH2COOH +2CH3COOH +H2 O+2CO2+ W - vi khuẩn lên men propionic: VK yếm khí .Thuộc giống Propionibacterium Ưng dụng: - Trong sản xuất phomát - Trong sản xuất vitamin B12 Ví dụ: Propionibacterium shermanii Vi khuẩn này thường có trong sữa, đất Lên men metan: - Dưới tác dụng của một số loại VSV, trong điều kiện yếm khí, một số hợp chất hữu cơ được phân giải, đồng thời giải phóng khí metan CH4 - Cơ chế: Quá trình chia làm 2 giai đoạn: + Giai đoạn 1: . Các chất hữu cơ: xơ, pectin,protein rượu, axit hữu cơ, CO2 + Giai đoạn 2: . Chuyển rượu, axit hữu cơ  CH4 4CH3OH  3 CH4 + CO2 + 2H2 O CH3COOH  CH4 + CO2 Ưng dụng: - Điều chế khí metan từ phân rác - Vi khuẩn lên men metan có khả năng tích luỹ vitamin B12.  có thể thu B12 từ bùn ao • Quá trình lên men cho rất ít W do cơ chất không được khai thác triệt để đồng thời W sinh ra phải chi phí một phần cho phản ứng khử, chỉ một phần được tích lại trong ATP. • Ví dụ: Phân giải hiếu khí một phân tử glucoza được 38 ATP (nấm men) • Phân giải yếm khí một phân tử glucoza chỉ được 2ATP • Quá trình lên men yếm khí có ý nghĩa lớn trong vòng tuần hoàn cacbon trong thiên nhiên. CO2 Vi sinh vật kỵ khí Cây xanh Động vật Chất hữu cơ cặn bã Trao đổi xây dựng: Đây là quá trình tổng hợp các chất cho cơ thể. Quá trình này phải tiêu tốn W: - VSV tự dưỡng quang năng lấy W từ ánh sáng mặt trời và W từ phản ứng hoá học - VSV dị dưỡng hoá năng lấy W từ phản ứng hoá học + Sự tổng hợp các chất hữu cơ không chứa Nitơ: - Đối với nhóm VSV dị dưỡng để tổng hợp các chất hữu cơ không chứa Nitơ đòi hỏi ta phải cung cấp các chất hữu cơ đơn giản dễ hấp thu như: - Đường đơn: glucoza, lactoza. - Axit béo + Đối với nhóm VSV tự dưỡng: Chúng có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ không chứa Nitơ từ nguồn các bon vô cơ: - CO2 - Muối cacbonat Sơ đồ tóm tắt: NADPH2 2NADP CO2 ---------------------------------------- 1/6 C6H12O6 3ATP 3ADP + 3Pi Sự tổng hợp các chất hữu cơ chứa Nitơ: + Với nhóm VSV tự dưỡng: Sử dụng nguồn Nitơ đa dạng: - Nitơ vô cơ : N2 , NO3 - , NH4 - Nitơ hữu cơ : protein, peptit, axit amin. .Từ các nguồn Nitơ này, chúng được chuyển thành NH3. .NH3 liên kết với xetoaxit tạo thành axitamin Vi dụ: NH3 + Xetoglutarat -- axit glutamic + H2O .Từ Axitamin tạo thành protein của VSV. . Sự tổng hợp protein diễn ra tại Riboxom. . AND của tế bào giữ vai trò điều khiển + Với nhóm VSV dị dưỡng: . Chúng hấp thu axitamin từ môi trường . Từ axitamin tổng hợp nên protein của VSV 5. Sinh trưởng và phát triển của VSV + Khái niệm: - Sinh trưởng: . Chỉ sự tăng lên về kích thước và thể tích của tế bào . Là biểu hiện sự tăng có qui tắc các tổ chức của tế bào Ví dụ: Staphylococcus đường kính 0,7 – 1mm - Phát triển (hoặc sinh sản): . Là sự tăng lên về số lượng tế bào. Trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH, chất dinh dưỡng VSV sẽ sinh trưởng và phát triển. Đây là hai quá trình gần như đồng diễn, có quan hệ hữu cơ. Tuy nhiên trong thực tế sự tăng về số lượng tế bào không phải bao giờ cũng diễn ra song song với quá trình tăng sinh khối. Ví dụ: Khi nuôi VK trong điều kiện cạn chất dinh dưỡng VK vẫn phân chia nhưng cho ra các tế bào con nhỏ hơn tế bào phân chia trong điều kiện bình thường. + Lý thuyết về sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn: Ơ đây ta chỉ nghiên cứu về sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn vì: - Ơ VK, vấn đề này đã được nghiên cứu sâu, có thể khái quát hoá dưới dạng toán học - Sinh trưởng, phát triển của các VSV khác không khác lắm so với VK. Những kiến thức sinh trưởng, phát triển ở VK có thể ứng dụng ở các VSV Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển ở VK phải nghiên cứu trên một quần thể tế bào . Khi nuôi cấy VK vào một môi trường hoàn toàn thích hợp . VK sẽ sinh trưởng, tổng hợp các thành phần của tế bào cho tới khi kích thước lớn gấp đôi, lúc đó VK bắt đầu sinh sản. . Thường cứ 20 - 30 phút VK sinh sản một lần và sinh sản theo cấp số nhân. . Giả sử cấy 1 VK vào môi trường thích hợp, VK tiến hành sinh sản. . Sau lần phân chia thứ nhất sẽ cho ra 2 tế bào con . 2 tế bào này sinh trưởng rồi phân chia thành 4 rồi thành 8 tế bào... như thế ta sẽ có - Số lần phân chia: 0 1 2 3 .n - Số lượng tế bào : 1 2 4 8 .2n = = = = 20 21 22 23 . Nếu lúc đầu ta cấy không phải là 1 VK mà là N0 , thì sau n lần phân chia ta sẽ có số lượng tế bào tổng cộng là: N = N0 x 2n . Các giá trị N, N0 có thể xác định được bằng cách đếm số lượng tế bào . Giá trị n tính bằng logarit thập phân: N = N0 x 2n (1) LgN = LgN0 + nLg2 n = 1/Lg2 x (LgN - LgN0 ) Như vậy với số lượng tế bào nuôi cấy ban đầu N0 Sau thời gian nuôi cấy, ta đếm được số tế bào N Ta có thể xác định được số thế hệ tế bào n Tốc độ sinh sản của VK còn phụ thuộc vào một số đại lượng sau: - Thời gian thế hệ (g): Là khoảng thời gian cần thiết cho việc tăng đôi số tế bào Biểu thị bằng công thức: g = t/n = Lg2 x (t 2 – t1 ) / (LgN - LgN0 ) Nếu thời gian thế hệ càng rút ngắn thì tốc độ sinh sản càng lớn. Thời gian được tính bằng giờ - Hằng số tốc độ phân chia (C): Là số lần phân chia sau 1 đơn vị thời gian (giờ) C = 1/g = n / t n = Ct Thay giá trị vào phương trình (1) ta có: N = N0 x 2Ct Hằng số tốc độ phân chia phụ thuộc: . Loài VK: E.coli có C = 3 M. tubercullosis C = 0,07 . Môi trường nuôi cấy: E. coli nuôi trong môi trường nước thịt C = 3 E. coli trong khoáng- glucoza C = 0,8 . Nhiệt độ nuôi cấy: E.coli ở 37oC C = 3 E.coli ở 18oC C = 0,51 + Biểu đồ sinh trưởng của VK trong điều kiện nuôi cấy tĩnh: . Phương pháp nuôi cấy tĩnh là trong suốt quá trình nuôi cấy ta không cho thêm chất dinh dưỡng vào và không loại bỏ sản phẩm TĐC . Khi nuôi cấy trong điều kiện thực tế – nuôi cấy tĩnh, sự sinh trưởng của VK có quy luật nhất định, được biểu hiện ở đường cong sinh trưởng gọi là biểu đồ sinh trưởng . Quá trình này chia làm 4 giai đoạn: Số lượng vi khuẩn Thời gian Biểu đồ sinh trưởng của vi khuẩn 1. Pha tiềm tàng - pha lag (Phase Latence) - Giai đoạn này tính từ lúc bắt đầu cấy VK, đến khi VK đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại - Đặc điểm pha này: . Số lượng tế bào không tăng . Thể tích tế bào tăng lên rõ rệt - Nguyên nhân: . Lúc này VK chưa phân chia, chúng phải trải qua một thời gian thích nghi với điều kiện sống mới và chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động . VK tăng tổng hợp các chất, enzym cần cho chuyển hoá, - Độ dài pha này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: . Tuổi của giống VK, dinh dưỡng, nhiệt độ... - Giai đoạn này biến động từ 3 - 5 giờ. 2. Giai đoạn tăng đều (pha log - phase exponentielle) - Trong pha này VK sinh sản với tốc độ nhanh chóng, thời gian thế hệ rút ngắn, VK sinh sản theo cấp số nhân. - Số tế bào tính theo công thức: N = N0 x 2Ct - Tế bào có kích thước điển hình, sức đề kháng cao - Độ dài pha này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: . Tuổi của giống VK . Môi trường dinh dưỡng . Nhiệt độ... - Biểu đồ đi lên rõ. 3. Giai đoạn ổn định (phase stationnarie) - Đường biểu diễn gần như song song với trục hoành - Số lượng tế bào VK sinh ra gần tương đương số lượng VK chết đi - Sinh khối tế bào ổn định - Nguyên nhân do : . Số lượng VK lớn sử dụng gần hết chất dinh dưỡng của môi trường . Đồng thời sản phẩm độc của quá trình TĐC tích luỹ ngày càng nhiều - Giai đoạn này kích thước tế bào không đồng nhất 4. Giai đoạn suy vong (phase decline) - Trong giai đoạn này số tế bào giảm theo luỹ thừa, đường biểu diễn đi xuống. - Số VK sinh ra nhỏ hơn rất nhiều so với số lượng vi khuẩn chết đi - Nguyên nhân: . Do môi trường cạn chất dinh dưỡng . Sản phẩm độc ngày càng tăng, nhiều vi khuẩn không còn khả năng sinh sản . Một số ít loại VK biến đổi hình thức sống bằng nha bào Ưng dụng của biểu đồ sinh trưởng của VK: - Sinh trưởng, phát triển của VK có quy luật, phụ thuộc nhiều yếu tố: giống, dinh dưỡng, nhiệt độ... - Tuỳ theo mục đích sử dụng, con người có thể điều khiển các giai đoạn sinh trưởng của VSV bằng các yếu tố: dinh dưỡng, nhiệt độ, pH, độ ẩmđể phục vụ cho sản xuất, đời sống con người: + Trong nuôi cấy, giữ giống VSV: Để có kết quả tốt . Nuôi cấy VSV trên môi trường dinh dưỡng, điều kiện thích hợp . Dùng giống gốc trẻ rút ngắn pha tiềm tàng, chuyển nhanh sang pha luỹ thừa để có số lượng lớn tế bào . Xác định thời gian thu hoạch, cấy chuyển VSV thích hợp trong giữ giống và nhân giống vi sinh vật, tạo điều kiện cho VSV phát triển nhanh và ổn định về đặc tính sinh học. + Nghiên cứu hình thái, hoạt động sinh lý của VSV; Nghiên cứu VSV ở giai đoạn luỹ thừa + Trong chế biến, sản xuất các chế phẩm VSV Tạo điều kiện để VSV phát triển nhanh, tạo số lượng tế bào lớn: . Rút ngắn pha tiềm tàng . Kéo dài pha luỹ thừa( Phương pháp nuôi cấy liên tục, dụng cụ Chemostat) Trong sản xuất vacxin: Xác định thời gian thu hoạch vacxin thích hợp (ở thời điểm có số lượng kháng nguyên lớn nhất cuối giai đoạn 2). + Trong bảo quản giống VSV, nguyên vât liệu và thức ăn: - Trong bảo quản giống VSV: Phải đảm bảo giống có tỷ lệ chết thấp, giữ được các đặc tính sinh học: . Giữ giống VK, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn..ở 40 C . Giữ giống virus ở âm 860 C . Giữ giống VSV bằng phương pháp đông khô - Trong bảo quản nguyên vật liệu và thức ăn: . Ngăn ngừa VSV xâm nhập và kìm hãm sự phát triển của chúng trong nguyên liệu, thức ăn . Tạo điều kiện bất lợi, kéo dài pha tiềm tàng . Có thể sử dụng phương pháp: làm khô, giữ ở nhiệt độ thấp, chiếu tia phóng xạ, sử dụng hoá chất + Trong phòng và trị bệnh truyền nhiễm: .Trong phòng bệnh áp dụng các biện pháp lý, hoá học nhằm giảm số lượng và nguy cơ lây nhiễm của VSV gây bệnh . Trong điều trị bệnh phải phát hiện bệnh sớm, điều trị ngay  cho hiệu quả cao + Đặc điểm sinh trưởng của VK trên các môi trường: - Trên môi trường lỏng: .Ta quan sát được sự sinh trưởng của VK biểu hiện ở độ đục trong, sự tạo màng, sự lắng cặn.. Ví dụ: - Môi trường đục: E.coli, Salmonella - Môi trường đục ít: E. rhusiopathiae - Trong có sợi bông: Bacillus anthracis B.anthracis trong nước thịt sau 24h +Trên môi trường đặc: . Vi khuẩn sinh trưởng hình thành khuẩn lạc . Khuẩn lạc (colonies) : Là một quần thể vi khuẩn được phát triển từ một tế bào và sinh trưởng ở cùng một nơi Một đơn vị khuẩn lạc C.F.U (coloning forming unit). . Vi khuẩn khác nhau thì hình thành lên những khuẩn lạc có hình thái, kích thước, màu sắc khác nhau. Người ta phân chúng thành 3 dạng chính: + Khuẩn lạc dạng S ( Smooth): Khuẩn lạc trơn bóng, mặt vồng, lồi, rìa gọn. + Khuẩn lạc dạng R ( Rough): Khuẩn lạc mặt khô, nhám xù xì, rìa không gọn. + Khuẩn lạc dạng M ( Mucoid): Khuẩn lạc dạng S nhưng bề mặt nhày. Khuẩn lạc Staphylococcus Bacillus subtilis Khuẩn lạc Streptococcus equi to, nhày - dạng M, dung huyết Khuẩn lạc Vk lao (hình hoa súp lơ) • 2.5. Nuôi cấy vi khuẩn • 2.5.1. Các loại môi trường • 1 - Căn cứ vào trạng thái • a. Môi trường dịch thể hay môi trường lỏng: Là môi trường hợp thành do sự hoà tan các chất dinh dưỡng cần thiết ở trong nước, như môi trường nước thịt, nước pepton, nước gan, nước dạ dày, nước các loại thân củ (thân ngô, đậu nành, cà rốt). • b. Môi trường bán cố thể: Là môi trường nước cho thêm một ít chất (thạch, keo) vào làm cho môi trường sánh lại hoặc hơi đặc lại, môi trường này dùng để theo dõi sự di động của vi khuẩn, nó hợp với điều kiện phát triển sinh lý của vi khuẩn (môi trường thạch mềm). • c. Môi trường cố thể hay môi trường rắn, đặc: Ví dụ như môi trường khoai tây để nuôi vi khuẩn lao; môi trường lỏng thêm thạch để tạo thành môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng dùng để phân lập và xem hình thái các khuẩn lạc; môi trường gelatin để kiểm tra xem vi khuẩn có làm tan chảy gêlatin không, dùng để định loại VSV 2. Căn cứ vào nguồn gốc các chất dinh dưỡng trong môi trường Như môi trường tự nhiên là môi trường mà các chất dinh dưỡng có sẵn trong thiên nhiên như máu, huyết thanh, nước tiểu, nước trứng, khoai tây... và môi trường nhân tạo là hỗn hợp của nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn như nước thịt, nước thịt gan... 3. Căn cứ vào mục đích và phương pháp sử dụng a. Môi trường phổ thông (căn bản, cơ sở): Trên cơ sở của môi trường này có thể điều chế ra các môi trường khác, môi trường phổ thông thường dùng là môi trường nước thịt, nước pepton, thạch lỏng... b. Môi trường nuôi dưỡng: Là môi trường dùng để nhân giống và giữ giống. Các chất dinh dưỡng trong môi trường đủ đảm bảo cho vi khuẩn phát triển bình thường, trong bảo tồn giống thường dùng môi trường thạch máu. c. Môi trường phân lập: Là môi trường chứa các chất dinh dưỡng cần thiết theo yêu cầu của phân lập, nghĩa là nó chỉ cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho một hoặc hai vi khuẩn phát triển được còn ức chế những loại vi khuẩn khác. Ví dụ như môi trường Istrati để phân lập E.coli. d. Môi trường giám định: Là môi trường dùng để giám định các loại vi sinh vật. Trong môi trường ngoài những chất cơ bản cho thêm các chất đặc biệt vào có tính chất giám định như các loại chỉ thị màu, các chất ức chế, đường... như môi trường EMB (Eosin metylen bleu) có đường lactoza dùng để phân lập E.coli và Salmonella. 2.5.2. Nguyên tắc chế tạo và bảo quản môi trường 1. Chế tạo môi trường phải tuyệt đối làm theo những điều chỉ dẫn không được tự ý thay đổi thành phần, số lượng, phẩm chất... 2. Nguyên liệu, hoá chất phải đúng phẩm chất và tinh khiết, nước cất dùng phải trung tính. 3. Dụng cụ thuỷ tinh dùng đựng môi trường phải trung tính; dụng cụ dùng để đun nấu, đựng môi trường phải là loại nhôm: tốt nhất là đồ tráng men. Không được dùng nồi đồng, nồi sắt. Khi đun phải thường xuyên quất đều và bổ sung lượng nước bị mất đi. 4. Độ ngâm nóng môi trường rất quan trọng, phải đúng và chính xác, nhiệt độ thấp hay cao một ít môi trường sẽ đục hoặc chất bổ sẽ không ra hết. 5. Môi trường phải thật trong, lọc qua giấy lọc, dùng ống lọc Seitz cỡ to, cho 3 lớp giấy thường vào rồi lọc trong chân không. 6. Xác định độ pH: Trong quá trình chế môi trường phải điều chỉnh độ pH cho thích hợp, thường dùng phương pháp so màu bằng hộp so màu và máy đo pH để điều chỉnh. 7. Môi trường phân phối ra chai, lọ, bình, ống nghiệm không được cho quá 2/3 dung lượng của vật đựng để khi khử trùng môi trường không tràn ra ngoài, phân xong nút bằng nút bông, không nút chặt quá và lỏng quá. 8. Khử trùng: Có nhiều phương pháp khử trùng, nhưng thông thường là phương pháp khử trùng bằng khí trưng cao áp. Các môi trường được khử trùng dưới áp lực 1 amp (1200C) trong 20 - 30 phút. Một số môi trường không khử trùng được ở nhiệt độ cao như môi trường đường, môi trường gêlatin... vì đường và gêlatin sẽ bị hỏng, phải khử trùng ở nhiệt độ 1100C trong 20 phút hay hấp cách quãng 1000C trong 30 phút mỗi ngày, trong 3 ngày liền. 9. Kiểm tra: Môi trường hấp xong, đặt một số ống vào trong tủ ấm 370C trong 24 - 48 giờ để kiểm tra, nếu không có vi khuẩn mọc là môi trường tốt. 10. Bảo quản: Môi trường sau khi khử trùng cần được bảo quản ở nhiệt độ thấp. Tốt nhất là bảo quản trong tủ lạnh, nhưng cũng không được để quá dài. 2.5.3. Cách chế các loại môi trường 1. Môi trường nước thịt pepton hay nước thịt thường a. Nước thịt cô đặc Thịt bò nạc 500 g Nước cất 500 ml Thịt bò bỏ hết mỡ, gân, bạc nhạc, xay nhỏ trong cối xay thịt hay băm nhỏ. Cân bỏ vào nồi tráng men hay nồi nhôm, cho nước cất vào theo tỷ lệ trên, quấy đều bằng đũa thủy tinh hay thìa nhôm. Đem ngâm tủ lạnh một đêm hoặc ngâm trong tủ ấm 50 độC trong 2 giờ, đun 100 độC trong30 phút để cho protit đông vón lại, quấy đều, vớt bọt đen đi, để lắng cặn, rồi lọc qua vải, chia ra chai, lọ, bình đem hấp ướt ở 120 độC trong 30 phút. Đây là nước thịt cô đặc. b. Nước thịt phổ thông hay nước thịt pepton Nước thịt cô đặc 500 ml Nước cất 500ml Pepton bột 10g NaCl 5g Đun sôi trong 5 phút, sửa pH = 7,4 - 7,6 rồi đun sôi 100 độC trong 15 phút, lọc qua giấy hay nhiều lớp vải gạc, đóng ống, mỗi ống độ 5ml hay cho vào bình, lọ. Hấp ướt 120 độC trong 30 phút. 2. Môi trường nước thịt Mactin (Martin) a. Nước dạ dày hay pepton mactin: Dạ dày lợn 200g Nước cất 500C 1000 ml HCl 10ml Dạ dày lợn phải tươi, rửa sạch, lọc hết mỡ ở ngoài, bổ đôi, rửa nhẹ nhàng bên trong, xay nhỏ bằng cối hoặc cắt nhỏ, cân đổ nước 600C vào để nhiệt độ sau khi trộn sẽ là 500C. Cho HCl vào quấy đều. Để tủ ấm 500C trong 24 giờ, quấy 4 - 5 lần cho đều xong cho NaOH 2N, mỗi lít dạ dày cho 6ml. Đun sôi 1000C trong 10 phút, ngâm nước lạnh cho lắng, gạn phần trong, lọc qua bông, sửa pH = 7,4 - 7,6, hấp ướt 1200C trong 30 phút. b. Nước thịt mactin Nước thịt cô đặc 500 ml Nước cất 500ml Nước dạ dày lợn 500ml NaCl 5g Phương pháp chế cũng giống như nước thịt pepton. 3. Môi trường nước thịt gan yếm khí Gan bóc vỏ màng ngoài, rồi cắt thành miếng vuông to, để tủ lạnh, rồi đem đun sôi 1000C, cắt gan thành những miếng vuông nhỏ hạt lựu, rửa sạch cho hết bột gan, để môi trường không bị đục, tráng qua nước lọc rồi cho vào ống nghiệm, mỗi ống độ 3 - 4 miếng, sau đó đổ nước thịt pepton vào, nước thịt pepton này có độ pH = 7,8 - 8,2. Sau đó cho một lượt dầu parafin lên trên môi trường. Hấp ướt 1200C trong 30 phút. 4. Môi trường thạch thường Nước thịt pepton 1000ml Thạch sợi 20 - 25g Phải xử lý thạch trước khi cho vào, gói thạch vào vải màn và ngâm trong nước, tốt nhất là cho vòi nước chảy qua, rồi vắt và rửa 3 - 4 lần nữa cho thạch được trung tính vì thạch có tính chất toan, vắt thạch cho thật khô, lấy sợi bẩn ra rồi cho vào nước thịt pepton đã chế sẵn. Đun sôi 100 độC trong 5 phút cho tan thạch, quấy đều, sửa pH = 7,4. Nấu lại để có nhiệt độ 50 – 55 độC rồi thêm lòng trắng trứng gà vào theo tỷ lệ cứ một lòng trắng trứng gà cho vào 500ml môi trường (1 lòng trắng trứng gà cho thêm 15ml nước cất, đánh thật nhuyễn cho nổi bọt rồi mới cho vào môi trường). Nấu lại 100 độC trong 60 phút, lọc qua giấy, bông hay vải gạc (lọc trong lò hấp ướt). Chia vào ống nghiệm hay bình tam giác để sau này đổ thạch đĩa. Đem hấp ướt 120 độC trong 30 phút. - Chế thạch nghiêng: ống thạch sau khi đem hấp sát trùng lấy ra để nằm nghiêng, đầu ống nghiệm hơi cao, để cho mặt thạch vừa sát đáy ống. • - Chế thạch đĩa: Chuẩn bị hộp lồng petri đã bao gói hấp sát trùng. Đun cách thủy cho bình thạch tan hết, đợi nhiệt độ xuống 50 - 600C rồi hé nắp hộp lồng pêtri đổ thạch vào, lớp thạch không dày quá để tránh lãng phí và cũng không mỏng quá để khi cấy khỏi bị rách thạch. Tất cả các thao tác phải làm trong tủ cấy và hết sức vô trùng. Để yên 15 phút cho thạch đông đặc lại, xong gói giấy, để tủ ấm 370C trong 24 giờ để kiểm tra xem có vô khuẩn hay không. • 5. Thạch lỏng hay thạch mềm bán cố thể • Nước thịt pepton 1000ml • Thạch sợi 5g • Thạch xử lý như trên rồi cho vào, đun sôi 1000C cho tan, sửa pH = 7,4, lọc qua giấy, hay vải gạc. Chia vào ống nghiệm nhỏ. Hấp ướt 1200C trong 30 phút, hấp xong đem để đứng thẳng, thạch lỏng dùng để kiểm tra sự di động của vi khuẩn. 6. Phân loại vi khuẩn . VK cũng như mọi sinh vật khác đều được sắp xếp vào các hệ thống phân loại xác định . Việc sắp xếp này hết sức cần thiết đối với mọi lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng. . Đơn vị cơ bản trong phân loại vi sinh vật nằm trong hệ thống phân loại của sinh vật gồm: 1. Giới (Kingdom): Ví dụ : giới động vật hay giới thực vật 2. Ngành (Division) 3. Lớp (Class) 4. Bộ (Order): Tên gọi lấy tên họ chính, thêm tận cùng là "ales" Ví dụ: Pseudomonadales 5. Bộ phụ (Suborder): Dưới bộ, tận cùng có ineae Ví dụ: Rhodobacterineae 6. Họ (Family) : Thường có tận cùng bằng aceae Ví dụ: Enterobacteriaceae 7. Tộc (Tribe): Thường có tận cùng bằng eae Ví dụ: Tộc Escherichieae 8. Giống (Genus): Đơn vị dưới tộc Ví dụ: Escherichia Staphylococcus 9. Loài (Species): . Đây là đơn vị phân loại cơ bản nhất . Tên khoa học một loài theo danh pháp kép của Linne . Tên giống đặt trước viết hoa,tên loài đặt sau viết thường Ví dụ : Salmonella choleraesuis Staphylococcus aureus 10. Các đơn vị dưới loài gồm: + Thứ (Variety): Chỉ một nhóm nhất định trong một loài. Ví dụ: Mycobacterium tubercullosis bovis. + Dạng (Type hoặc forme): Chỉ một nhóm nhỏ hơn thứ. Ví dụ: Streptococcus pneumoniae type 14. + Chủng hay nòi (Strain): . Chỉ một chủng của một loài mới phân lập . Các cá thể của cùng một loài nhưng phân lập từ những nơi khác nhau không thể giống nhau hoàn toàn Trong vi sinh vật thú y, các đơn vị phân loại thường sử dụng là họ, tộc, giống, loài, type và chủng. . Việc phân loại VK rất phức tạp, tinh vi . Đã có nhiều khoá phân loại, nhưng cho đến nay chưa có khoá phân loại nào hoàn chỉnh . Có 2 hệ thống phân loại được sử dụng chủ yếu: - Hệ thống phân loại của D.N Bergey - Hệ thống phân loại của N.A Craxinhicop .