Bài giảng Ứng dụng của sắc kí khí

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 11/29/2010 ‹#› BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Khoa Công nghệ sinh học K13S02 GVHD: Th.S Cao Ngọc Minh Trang Ứng dụng của Sắc kí khí I. SẮC KÍ KHÍ  II. ỨNG DỤNG Sắc kí khí 1. Nguyên tắc: Khi một hỗn hợp các chất bay hơi được khí mang (pha động) vận chuyển qua cột chứa một chất hấp phụ rắn hoặc thông thường hơn là qua một pha lỏng hấp phụ lên một chất rắn (pha tĩnh), mỗi thành phần hơi đó được phân bố trong khí mang và chất rắn hoặc chất lỏng. Tùy theo thời gian lưu, mỗi thành phần hơi sẽ thoát ra khỏi cột sắc ký ở các thời gian khác nhau và được xác định bởi detector thích hợp, có thể xác định định tính cũng như định lượng. 2. Ưu điểm Khả năng phân tách rất cao, ngay cả đối với những hỗn hợp phức tạp Độ nhạy, độ chính xác và độ tin cậy rất cao Thời gian phân tích ngắn Có thể phân tích hàng loạt 3. Cấu tạo Cột sắc ký Cột nhồi Cột mao quản Khí mang Detector 6 1 3 4 5 7 8 9 2 1. Bộ cung cấp khí mang2. Bộ điều chỉnh áp suất3. Bộ đo lưu lượng 4. Bộ nạp mẫu 5. Cột sắc ký 6. Buồng ổn nhiệt7. Detector8. Bộ khuếch đại điện tử9. Bộ xử lý tín hiệu  II. Ứng dụng Thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản Phân tích thành phân acid béo bằng phương pháp sắc kí khí Thuốc trừ sâu gốc phospho hữu cơ trong thuỷ sản và sản phẩm thuỷ sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký khí Phạm vi áp dụng  5 loại thuốc trừ sâu chính: Dimethoate Chlorfenvinphos Chlorpyrifos Methidathion Phosmet 2. Nguyên tắc Thuốc trừ sâu OP trong mẫu thủy sản được chiết tách ra bằng hỗn hợp axetonitril-axeton. Dịch chiết được làm sạch trên cột silicagel, sau đó được chiết tách làm 2 phân đoạn. Hàm lượng các thuốc trừ sâu OP trong các phân đoạn chiết được xác định trên hệ thống GC với 2 đầu dò: Đầu dò bắt giữ điện tử (ECD) Đầu dò ion hoá nhiệt phát hiện nitơ-phospho (NPD). 3. Phương pháp tiến hành Chuẩn bị mẫu thử Cân chính xác 5g mẫu đã được nghiền bằng máy nghiền đồng thể rồi cho vào cốc thuỷ tinh có mỏ. Thêm 1g xelit, 30g sunfat natri khan rồi nghiền đều. Tiếp tục thêm vào 150ml hỗn hợp dung dịch axetonitril-axeton theo tỷ lệ về thể tích là 9:1 rồi trộn hỗn hợp trong 3 phút trong máy trộn cao tốc để chiết lấy các thuốc trừ sâu từ mẫu. Sau đó, lọc dung dịch bằng giấy lọc. Sản phẩm chiết được cô đặc trên máy cô quay đến khoảng 5ml, sau đó cô đặc tiếp cho đến khô trên máy cô quay trong chế độ chân không ở nhiệt độ 40oC. Thêm vào dịch thu được 1ml hexan rồi làm sạch dịch chiết Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng là mẫu thủy sản đã được xác định không có chứa thuốc trừ sâu gốc OP. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị đối với mẫu thử Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi  Thêm 1ml dung dịch chuẩn có hàm lượng từ 0,005 đến 50mg/ml vào 5g mẫu trắng, trộn đều mẫu bằng máy nghiền đồng thể Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị đối với mẫu thử theo qui định trên Làm sạch dịch chiết Chuẩn bị cột: Bông thuỷ tinh 1,3g silicagel đã được hoạt hoá 1g sunfat natri khan Trước khi tiến hành phân tích, cho vào cột 5ml etyl axetat và sau đó là 5ml hexan Làm sạch dịch chiết  Chuyển dịch thu được vào các cột sắc ký đã được chuẩn bị Rửa dung dịch trong cột với 5ml hexan, sau đó với 2ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ về thể tích là 95:5. Tiếp theo, rửa giải với 8ml hỗn hợp hexan-etyl axetat theo tỷ lệ về thể tích là 50:50 rồi tách lấy phân đoạn 1. Sau đó, tiếp tục rửa giải với 5ml etyl axetat rồi tách lấy phân đoạn 2. Tốc độ rửa giải phải luôn điều chỉnh đạt 10 giọt/phút. Thu các phân đoạn chiết vào các bình thuỷ tinh đáy tròn của máy cô quay chân không  Tiến hành cô trên máy cô quay cho đến khô. Sau đó, thêm chính xác 1 ml hexan vào từng bình, lắc cho tan đều rồi hút để bơm vào máy GC. Tiến hành phân tích trên GC Ðiều kiện phân tích Máy sắc ký khí sử dụng đầu dò ECD và NPD, chọn chế độ bơm tự động, mỗi lần một lượng 2ml theo chế độ tiêm không chia. Chế độ nhiệt của hệ thống GC Nhiệt độ của buồng tiêm: 2700C Nhiệt độ đầu dò ECD: 3000C, tốc độ dòng N2: 60ml/phút Ðiều kiện phân tích Nhiệt độ đầu dò NPD: 2700 C, tốc độ dòng He: 30ml/phút, H2: 3ml/phút, không khí: 100ml/phút. Chương trình nhiệt độ cột (mô tả chi tiết trong Biểu đồ 1): Duy trì ở 90 0C trong 1 phút; tăng 300C/phút, lên tới 1800C; tăng 40C/phút, lên tới 2700C và duy trì ở 2700C trong 20 phút Cột sắc ký: Cột mao quản HP Ultra 2, chất nhồi cột chứa 5% metylsilicol, chiều dài 25 m, đường kính trong 0,2 mm, độ dày lớp pha tĩnh 0,33 mm. Khí: Khí mang: heli, tốc độ 0,5ml/phút. Tiến hành phân tích Tiêm các dung dịch chuẩn công tác vào máy GC theo thứ tự từ nồng độ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại thuốc trừ sâu theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax+b). Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng, dung dịch xác định độ thu hồi đã được làm sạch vào hệ thống GC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVS) tính theo diện tích píc sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5%. Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã được bổ sung một lượng dung dịch chuẩn để tính đuợc hàm lượng chính xác. Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 70 đến 110% (tuỳ theo hàm lượng OP có trong mẫu).Ðường chuẩn của mỗi cấu tử phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. Tính kết quả (Y - b) C (g/kg) = ------------ x F a - C là nồng độ từng loại thuốc trừ sâu có trong mẫu, tính theo mg/kg. - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào GC, tính theo đơn vị diện tích. - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo trên - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích phân đoạn dịch chiết thu được sau khi làm sạch và khối lượng mẫu m sử dụng. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ACID BÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ Để phân tích thành phần acid béo, thường dùng phương pháp sắc kí khí. Do đó dẫn xuất methyl ester của acid béo thì có nhiệt độ hóa hơi thấp hơn nhiều so với acid béo tự do nên hỗn hợp acid béo được tạo thành dẫn xuất methyl ester trước khi đưa vào phân tích. Cũng có thể chuyển acid béo thành methyl ester có thể dùng xúc tác kiềm hoặc acid, tuy nhiên khi dùng BF3 làm xúc tác trong phương pháp acid sẽ làm biến đổi cấu trúc không gian của liên kết đôi thành các dạng liên hợp CLA,  làm sai lệch kết quả khi phân tích CLA (acid linoleic nối đôi liên hợp - C= C- C= C- ) Dụng cụ - thiết bị Phễu chiết 100ml, bình cầu 250ml có hai cổ, ống nghiệm, pipet tự động, syringe tiêm mẫu 10 microlit. Máy ly tâm Hệ thống thiết bị phân tích sắc kí khí Hóa chất Hexan Dung dịch metanolat natri Dung dịch metalonic HCl Phương pháp chuẩn bị methyl ester Nguyên lí: Triglycerid được chuyển ester hóa với methanol trong môi trường CH3ONa . Acid béo tự do còn lại sau phản ứng được methyl ester hóa bằng môi trường acid. Sản phẩm methyl ester của acid béo được trích ra khỏi hỗn hợp bằng hexan. Phương pháp tạo dẫn xuất methyl ester của các acid béo Cân chính xác khoảng 20÷30mg lipid, cho vào ống nghiệm. Sau đó cho vào 1ml hexan và 0,15ml dung dịch metalonat natri, lắc thật kĩ trong khoảng 1 phút rồi để yên ở nhiệt độ thường 30 phút. Tiếp theo cho vào 1ml metanolic HCl, lắc thật kĩ rồi cho để cho phản ứng xảy ra trong vòng 45 phút. Sau đó li tâm ống nghiệm 3000 vòng/phút. Phương pháp tạo dẫn xuất methyl ester của các acid béo Dung dịch trong ống nghiệm sẽ bị tách thành 3 pha. Dùng pipet tự động hút lấy pha trên cùng có chứa methyl ester của acid béo đem phân tích trên máy sắc kí khí. Dẫn xuất methyl ester được bảo quản trong điều kiện chống oxi hóa và bảo lạnh cho tới khi phân tích. Phân tích thành phần methyl ester trên máy sắc kí khí Giới thiệu về hệ thống thiết bị: Bình chứa khí mang Bộ phận điều chỉnh áp suất Van bộ phận lọc Lò Đầu bơm mẫu Cột mao quản Đầu dò Bộ phận xử lí số liệu Đầu dò: Sử dụng đầu dò ion hóa bằng ngọn lửa để phân tích chất béo ( FID). Đây là một đầu dò có độ nhạy cao, độ tuyến tính tương đối rộng, khá nhạy nếu chất hữu cơ chứa nhiều CH. Nguyên lí hoạt động đầu dò này là sẽ đốt cháy những chất ra khỏi cột phân tích bằng ngọn lửa có khí hidro đang cháy. Khi một chất hữu cơ bị đốt cháy dưới tác dụng của ngọn lửa tạo ra bởi sự đốt cháy hydro, có sự tạo thành các gốc CHn*, OH*, O2* ở biên ngọn lửa. Các gốc tự do phản ứng sinh ra CHO+: C* + OH* CHO+ e- Tiến hành phân tích mẫu Trình tự tiến hành: Khởi động máy Cho chạy pha động Cài đặc chương trình chạy sắc kí Bơm mẫu Chạy sắc kí phân tích mẫu Thu nhận và xử lí số liệu Báo cáo và trình bày kết quả phân tích Thực hiện Điều kiện phân tích: Sử dụng cột mao quản DB- 1 (ID = 0,25nm, l= 30m ), là loại cột không phân cực Pha tĩnh 100% dimethylpolyiloxane Pha động khí nitơ Ditector FID Cài đặc chương trình chạy sắc kí: Nhiệt độ injector 2500C Nhiệt độ detector 2500C Lưu lượng H2 40ml/min Lưu lượng dòng khí mang N2 400ml/min Nhiệt độ cột 1800C trong 2 phút, tăng 2,50C /phút tới 2050C, tăng 3,50C/phút tới 2300C, dừng 2 phút, tăng 50C/phút tới 2500C Áp suất đầu vào của khí mang 14psiSplit ratio 1/25 Dùng cột DB-5( 0,25mm, 30m) là một loại phân cực yếu. Pha tĩnh có 95% là dimethylpolysilosane, 5% là dimethylpolysilosane với chương trình chạy phân tích.  Cài đặc chương trình chạy sắc kí Nhiệt độ injector 2700C Nhiệt độ detector 2700C Chế độ bơm mẫu có lưu dòng, split ratio 1/60 Lưu lượng H2 40ml/min Lưu lượng dòng khí mang N2 400ml/min Nhiệt độ cột 1800C trong 2 phút, tăng 2,50C /phút tới 2050C, tăng 3,50C/phút tới 2300C, dừng 2 phút, tăng 50C/phút tới 2500C Áp suất đầu vào của khí mang 14psi Bơm mẫu: Dùng syringe với tiêm kim đầu nhọn, bơm trực tiếp khoảng 2 microlit dẫn xuất methyl ester của các acid béo vào cột sắc kí khí qua bộ phận tiêm mẫu Có thể thay đổi chương trình nhiệt độ nhằm làm giảm bớt thời gian phân tích khi có các khoảng trống không có mũi. Trong quá trình phân tích phải giữ vận tốc truyền thẳng của khí mang khi qua cột là không đổi để mũi sắc kí nhọn và đối xứng. Thời gian phân tích mẫu là do chế độ nhiệt độ cài đặt, thông thường 30 phút. Để xác định vị trí các acid béo trên sắc kí đồ dùng phương pháp nội chuẩn là bổ sung một chất chuẩn có nồng độ biết trước ngay trong mẫu trước khi xử lí. - Thường dùng acid có cacbon lẻ ( C15: 0 ) hoặc acid không có trong mẫu. - Để xác định trình tự có thể dùng hai mẫu chuẩn ở hai đầu. Nồng độ chất bổ sung phải gần nồng độ acid béo trong mẫu. Hay dùng phương pháp ngoại chuẩn, tức là dùng chất chuẩn xây dựng đường chuẩn. - Phải có đủ chất chuẩn, thực hiện phải cùng điều kiện, lượng mẫu bơm vào phải cố định, đường chuẩn phải tuyến tính. - Hệ số tương quan của đường chuẩn R2 phải gần bằng 1. Xử lí kết quả Xem so sánh sắc kí đồ của chuẩn và mãu. Dựa vào thời gian lưu của các peak chuẩn để xác định vị trí của các acid béo và thứ tự của các acid béo trên sắc kí đồ. So sánh diện tích peak và chiều cao peak của các acid trên sắc kí đồ của mẫu và các nồng độ chuẩn trong dung dịch hỗn hợp chuẩn. Lập đường chuẩn từ các nồng độ chuẩn. Công thức tính kết quả: Bi = Với Bi nồng độ acid béo i (%) SM diện tích của peak acid béo i trên sắc kí đồ của mẫu SC diện tích của peak acid béo i trên sắc kí đồ của chuẩn C nồng độ acid béo chuẩn i tính theo đường chuẩn Tổng diện tích của các peak acid béo trên 1. Hoàng Thị Minh Nhật 2. Trần Thị Huỳnh Tư 3. Võ Doãn Trung 4. Trần An Phương 5. Võ Quốc Cường 6. Nguyễn Khánh Ly 7. Nguyễn Thùy Trang 8. Nguyễn Thị Ngọc Anh 9. Phạm Hoàng Ngọc Thủy