Bài giảng Ứng dụng công nghệ sinh học trong trồng trọt

CHƯƠNG IIỨNG DỤNG CNSH TRONG TRỒNG TRỌT BÀI 1KHÁI QUÁT VỀ CNSH THỰC VẬT I. SƠ LƯỢC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Giai đoạn I (1902 – 1930): Thử nghiệm ban đầu; Giai đoạn II (1934 – 1954): Gautheret đã nuôi thành công mô tế nào cà rốt (1937). Phát hiện vai trò của các vitamin, các chất điều hoà tăng trưởng; Giai đoạn III (1957 – 1992): Phát triển công nghệ gen thực vật. Giai đoạn IV: Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn và diện rộng. II. CƠ SỞ CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 1. Định nghĩa Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. 2. Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật a. Tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. b. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Về bản chất, sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. III. NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ 1. Ý nghĩa Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. 2. Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro Bước 0: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Bước I: Nuôi cấy khởi động Bước II: Nhân nhanh Bước III: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Bước IV: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên 3. Nuôi cấy mô và cơ quan TV: Tế bào thực vật có tính toàn thế (totipotency) Để nuôi cấy mô TV (NCMTV) có hiệu quả cần thành thạo các kỹ thuật vô trùng, biết cách pha chế các môi trường thích hợp và sử dụng các trang thiết bị tương ứng. a. Môi trường nuôi cấy tế bào TV: Khoáng đa lượng: N, P, K, S, Ca, Mg Khoáng vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co, Mo Vitamin: nicotinic, biotin, thyamin, pyridoxin… Nguồn cacbon: sucrose hay glucose Các chất điều hòa tăng trưởng: auxin, cytokynin Để tạo môi trường đặc: Agar b. Mẫu dùng cho nuôi cấy mô: Gần như tất cả các phần của cây tươi đều có thể dùng làm mẫu nuôi cấy mô. Nguyên tắc căn bản: mẫu chứa các tế bào sống có khả năng phân chia mạnh, cây gốc có phẩm chất tốt, năng suất cao, không bị bệnh và không đang ở trạng thái ngủ. Mẫu cấy cần được vô trùng trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Có 2 cách: - Từ hạt: khử trùng bề mặt hạt và gieo hạt vào điều kiện vô trùng để mọc thành cây và lấy mẫu. - Mẫu cấy: mẫu được ngâm trong dung dịch chất sát trùng với thời gian và nồng độ thích hợp. c. Các phương pháp nuôi cấy: Nuôi cấy mô phân sinh: - Sử dụng đỉnh sinh trưởng (meristem) để nuôi cấy, sau một thời gian hình thành mô sẹo (callus). - Có thể sử dụng mô sẹo cho các mục đích khác nhau ở giai đoạn tiếp theo: tạo cụm chồi hay tạo thành dòng thứ cấp. Nuôi cơ quan thực vật: đặt mẫu cấy vào môi trường thích hợp sau một thời gian sẽ tạo ra các cây non hoàn chỉnh. Nuôi cấy tế bào trần: Dùng enzyme phân giải vách tế bào thực vật để tạo ra tế bào trần, có thể tiến hành dung hợp tế bào trần của các loài khác nhau để tạo ra loài lai mới. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn: Nuôi các bao phấn nguyên chứa các hạt phấn đang phát triển sẽ hình thành phôi soma trực tiếp từ hạt phấn và tạo ra nguyên cây đơn bội IV. NHỮNG ƯU THẾ CỦA NUÔI CẤY MÔ 1. Vi nhân giống (micropropagation) Thực hiện trong PTN với những chuẩn mực ổn định. Sinh sản vô tính tạo ra số lớn cây giống con, có sự đồng đều cao. Hệ số nhân giống cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và rút ngắn thời gian ra hoa, quả với những cây lâu năm. 2. Chọn giống in vitro Rút ngắn thời gian và đưa nhiều thử nghiệm đồng ruộng vào phòng thí nghiệm hoặc nhà kính như chọn các dòng kháng virus, chịu lạnh… Sử dụng các biomarker sàng lọc nhanh các tính trạng từ bộ sưu tập giống và các cây lai. Thu được các cây lưỡng bội thuần chủng nhờ đa bội hoá dòng đơn bội ưu việt. Tận dụng gen im lặng thường không biểu hiện trong tự nhiên. 3. Khai thác các hoá chất bằng nuôi tế bào đơn Sản xuất chủ động và liên tục trong phòng thí nghiệm. Khai thác các chất bằng sinh tổng hợp của thực vật thay cho tổng hợp hoá học. Chọn dòng tế bào sản sinh các chất với năng suất cao, vượt trội so với cây tự nhiên và thời gian sản xuất nhanh hơn. Thu nhận nhiều chất quý hiếm. Chuyển hoá sinh học có thể thực hiện nhờ tế bào đơn hay tế bào được cố định. V. CÁC HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ 1. Tính bất định về mặt di truyền Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma: Kiểu di truyền; Số lần cấy chuyển; Loại mô. 2. Sự nhiễm mẫu Các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùng mẫu. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như: Agrobacterium, Bacilus, Corylabacterium, Pseudomonas… có thể xâm nhiễm vào mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại. 3. Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy Trong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hoá nâu hay đen mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Các phương pháp loại trừ sự hoá nâu: Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy; Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hoá tốt ở mẫu một số cây ăn quả; Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng; Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic và citric vài giờ trước khi cấy; Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1 – 2 tuần); Cấy chuyển mẫu liên tục. 4. Hiện tượng thuỷ tinh hoá Trong quá trình nhân nhanh in vitro thường xuất hiện hiện tượng cây bị “thuỷ tinh hoá” – thân, lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường. Một số giải pháp tránh hiện tượng thuỷ tinh hoá: Tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm thấu cao; Giảm nồng độ các chất chứa Nitơ trong môi trường; Giảm sự sản sinh Ethylen trong bình nuôi cấy; Xử lý acid absisic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng; Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng nuôi. VI. VAI TRÒ CỦA CNSH TV TRONG TƯƠNG LAI CNSH TV phải giải quyết hàng loạt vấn đề như: Chọn giống có chất lượng thực phẩm tốt, thích nghi với những điều kiện khác nhau; Phát triển các biện pháp chống sâu bệnh, cỏ dại; Phát triển nông nghiệp sạch và xanh hơn. Ngoài ra, CNSH TV còn phải gánh vác các ngành sản xuất mới với các mục tiêu: Tăng sinh khối để sản xuất năng lượng thay thế nguồn dầu mỏ; Phát triển hoá học xanh để một mặt cung cấp sinh khối cho sản xuất hoá chất, mặt khác phải biến thực vật thành nhà máy hoá chất.