Bài giảng môn Di truyền học

Bài giảng điện tử Mơn: Di truyền học (45 tiết) Trương Thị Bích Phượng Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Chương 1 Bản chất của vật chất di truyền Mục tiêu của chương Giới thiệu bản chất của vật chất di truyền là DNA, thành phần, cấu trúc của phân tử DNA, dạng DNA khác nhau trong tế bào. Số tiết: 6 Nội dung I. DNA là vật chất di truyền Năm 1968, Frederich Miescher (Thụy Điển) phát hiện ra trong nhân tế bào bạch cầu một chất khơng phải là protein và gọi là nuclein. Về sau thấy chất này cĩ tính acid nên gọi là acid nucleic. Acid nucleic cĩ 2 loại là desoxyribonucleic (DNA) và ribonucleic (RNA). Năm 1914, R. Feulgen (nhà hĩa học người Đức) tìm ra phương pháp nhuộm màu đặc hiệu đối với DNA. Sau đĩ các nghiên cứu cho thấy DNA của nhân giới hạn trong NST. Nhiều sự kiện cho gián tiếp cho thấy DNA là chất di truyền. Mãi đến năm 1944 vai trị mang thơng tin di truyền của DNA mới được chứng minh và đến năm 1952 mới được cơng nhận. 1. Các chứng minh gián tiếp Nhiều số liệu cho thấy cĩ mối quan hệ giữa DNA và chất di truyền - DNA cĩ trong tế bào của tất cả các vi sinh vật, thực vật, động vật chỉ giới hạn ở trong nhân và là thành phần chủ yếu của nhiễm sắc thể. Đĩ là một cấu trúc mang nhiều gen xếp theo đường thẳng. 1 - Tất cả các tế bào dinh dưỡng của bất kỳ một loại sinh vật nào đều chứa một lượng DNA rất ổn định, khơng phụ thuộc vào sự phân hĩa chức năng hoặc trạng thái trao đổi chất. Ngược lại, số lượng RNA lại biến đổi tùy theo trạng thái sinh lý của tế bào. - Số lượng DNA tăng theo số lượng bội thể của tế bào. Ở tế bào sinh dục đơn bội (n) số lượng DNA là 1, thì tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) cĩ số lượng DNA gấp đơi. - Tia tử ngoại (UV) cĩ hiệu quả gây đột biến cao nhất ở bước sĩng 260nm. Đây chính là bước sĩng DNA hấp thu tia tử ngoại nhiều nhất. Tuy nhiên trong các số liệu trên, thành phần cấu tạo của NST ngồi DNA cịn cĩ các protein. Do đĩ cần cĩ các chứng minh trực tiếp mới khẳng định vai trị vật chất di truyền của DNA. 2. Thí nghiệm biến nạp DNA (Transformation) Hiện tượng biến nạp do Griffith phát hiện vào năm 1928 ở vi khuẩn Diplococcus pneumoniae (gây sưng phổi ở động vật cĩ vú). Vi khuẩn này cĩ hai dạng: - Dạng S (gây bệnh): cĩ vỏ bao tế bào bằng polysaccharid, ngăn cản bạch cầu phá vỡ tế bào. Dạng này tạo khuẩn lạc láng trên mơi trường agar. - Dạng R (khơng gây bệnh) khơng cĩ vỏ bao tế bào bằng polysaccharid, tạo khuẩn lạc nhăn. Thí nghiệm được tiến hành như sau: a. Tiêm vi khuẩn dạng S sống gây bệnh cho chuột, sau một thời gian nhiễm bệnh, chuột chết b. Tiêm vi khuẩn dạng R sống khơng gây bệnh cho chuột, chuột sống c. Tiêm vi khuẩn dạng S bị đun chết cho chuột, chuột chết d. Tiêm hỗn hợp vi khuẩn dạng S bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống cho chuột, chuột chết. Trong xác chuột chết cĩ vi khuẩn S và R. 2 Hình 1.1 Thí nghiệm biến nạp ở chuột Hiện tượng trên cho thấy vi khuẩn S khơng thể tự sống lại được sau khi bị đun chết, nhưng các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào R. Hiện tượng này gọi là biến nạp. Đến 1944, ba nhà khoa học T. Avery, Mc Leod, Mc Carty đã tiến hành thí nghiệm xác định rõ tác nhân gây biến nạp. Nếu tế bào S bị xử lý bởi protease hoặc RNAase. thì hoạt tính biến nạp vẫn cịn, cứng tỏ RNA và protein khơng phải là tác nhân gây bệnh. Nhưng nếu tế bào chết S bị xử lý bằng DNAase thì hoạt tính biến nạp khơng cịn nữa, chứng tỏ DNA là nhân tố biến nạp. Kết quả thí nghiệm được tĩm tắc như sau: DNA của S + tế bào R sống  chuột chết (cĩ S, R ) 3 Kết luận: hiện tượng biến nạp là một chứng minh sinh hĩa xác nhận rằng DNA mang tín hiệu di truyền. Nhưng vai trị của DNA vẫn chưa được cơng nhận vì cho rằng trong các thí nghiệm vẫn cịn một ít protein. Hình 1.2 Vật chất di truyền của phage là DNA 3. Sự xâm nhập của DNA virus vào vi khuẩn Năm 1952, A. Hershey và M. Chase đã tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 xâm nhập vi khuẩn E.coli. Phage T2 cấu tạo gồm vỏ protein bên ngồi và ruột DNA bên trong. Thí nghiệm này nhằm xác định xem phage nhiễm vi khuẩn đã bơm chất nào vào tế bào vi khuẩn: chỉ DNA, chỉ protein hay cả hai. Vì DNA chứa nhiều phosphor, khơng cĩ lưu huỳnh; cịn protein chứa lưu huỳnh nhưng khơng chứa phosphor nên cĩ thể phân biệt giữa DNA và protein nhờ đồng vị phĩng xạ. Phage được nuơi trên vi khuẩn mọc trên mơi trường chứa các đồng vị phĩng xạ P32 và S35. S35 xâm nhập vào protein và P32 xâm nhập vào DNA của phage 4 Thí nghiệm: phage T2 nhiễm phĩng xạ được tách ra và đem nhiễm vào các vi khuẩn khơng nhiễm phĩng xạ, chúng sẽ gắn lên mặt ngồi của tế bào vi khuẩn. Cho phage nhiễm trong một khoảng thời gian đủ để bám vào vách tế bào vi khuẩn và bơm chất nào đĩ vào tế bào vi khuẩn. Dung dịch được lắc mạnh và ly tâm để tách rời tế bào vi khuẩn khỏi phần phage bám bên ngồi vách tế bào. Phân tích phần trong tế bào vi khuẩn thấy chứa nhiều P32 (70%) và rất ít S35, phần bên ngồi tế bào vi khuẩn chứa nhiều S35 và rất ít P32. Thế hệ mới của phage chứa khoảng 30% P32 ban đầu Thí nghiệm này đã được chứng minh trực tiếp rằng DNA của phage T2 đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sinh sản để tạo ra thế hệ phage mới mang tính di truyền cĩ khả năng đến nhiễm vào các vi khuẩn khác. Hinh 1.3 Sư xâm nhâp DNA cua virus vao vi khuân II. Thành phần và cấu tạo hĩa học của acid nucleic DNA và RNA là những hợp chất cao phân tử. Các đơn phân là các nucleotide. Mỗi nucleotide gồm ba thành phần - H3PO4 5 - Đường desoxyribose (DNA ), ribose ( RNA) - Nitrogenous base DNA RNA + Purin Adenin (A) Adenin (A) Guanin (G) Guanin (G) + Pyrimidin Cytosin (C) Cytosin (C) Timin (T) Uracin (U) (a) (b) (c) Hình 1.4 Thành phần đường và base của nucleotide (a) Base purin va pyrimidin (b) Đương ribose va deoxyribose (c) Sư khac nhau giưa Thymine va Uracil Trong nucleotide, base purin sẽ gắn với C1 của đường ỏ N9. Nếu là pyrimidin thì sẽ gắn với C1 của đường ở N3. C5 của đường gắn với nhĩm phosphate. 6 Trong mạch, 2 nucleotide nối với nhau nhờ mối liên kết giữa nhĩm 3’-OH của đường với nhĩm -OH của H3PO4, cùng nhau mất đi một phân tử nước. Nếu phân tử chỉ gồm đường và nitrogenous base gọi là nucleoside. 1. DNA 1.1. Cấu tạo hĩa học của DNA Hình 1.5 Sự bắt cặp bổ sung của các base của hai mạch đơn Trên cơ sở các nghiên cứu của mình, Chargaff (1951) đã đưa ra kết luận: + Số lượng A = T, G = C 7 + Tỉ số A +T đặc trưng cho mỗi lồi sinh vật. G + X Các base căn bản của acid nucleic bắt cặp bổ sung Cũng trong thời gian này, Wilkins và Franklin (người Anh) nghiên cứu, phân tích tán xạ bằng tia rơnghen, kết luận: + Các purin và pyrimidin cĩ cấu trúc phẳng, mặt phẳng của chúng được xếp vuơng gĩc với trục dài của mạch polynucleotide cái này xếp chồng lên cái kia, khoảng cách trung tâm giữa hai mặt phẳng kề nhau là 3,4Ao + Mạch polynucleotide xoắn thành lị xo quanh trục giữa, mỗi bước xoắn là 34Ao (ứng với 10 nu) + Việc so sánh nồng độ DNA đo được với các số liệu tính tốn trên cơ sở sắp khơng gian của các nguyên tử cho thấy DNA cĩ nhiều hơn một mạch polynucleotide. Năm 1951, J. Watson và F. Crick: tổng hợp các số liệu phân tích hĩa học và tán xạ của tia X, để xây dựng nên mơ hình cấu trúc phân tử DNA. Theo mơ hình này, phân tử DNA cĩ những đặc trưng chủ yếu trong cấu trúc khơng gian như sau: Hình 1.6. Mối liên kết hydro giữa A-T và G-C 8 1. Phân tử DNA gồm hai chuỗi polynucleotide xoắn song song ngược chiều quanh một trục chung. 2. Các gốc base quay vào phía trong của vịng xoắn, cịn các gốc H3PO4, pentose quay ra ngồi tạo phần mặt của hình trụ. Các mặt phẳng của phân tử đường nằm về phía phải của các base. Cịn các base thì xếp trên những mặt phẳng song song với nhau và thẳng gĩc với trục phân tử. Khoảng cách giữa các cặp base là 3,4 Ao. Chúng lệch nhau một gĩc 360 nên cứ 10 gốc (10 nucleotide) tạo nên một vịng quay. Hình 1.7 Chuỗi xoắn kép DNA 3. Chiều cao của mỗi vịng xoắn là 34 Ao, gồm 10 bậc thang do 10 cặp base tạo nên. Đường kính của vịng xoắn là 20 Ao. 9 4. Hai chuỗi polynucleotide gắn với nhau qua liên kết hydro được hình thành giữa các cặp base đứng đối diện nhau theo nguyên tắc bổ sung cặp đơi nghiêm ngặt: A luơn luơn liên kết với T bằng 2 mối liên kết hydro, G liên kết với X bằng 3 mối liên kết hydro. Do đĩ trong phân tử DNA tổng số base loại pirimidin luơn bằng tổng số các base loại purin (quy luật Chargaff). + Khoảng cách giữa hai mạch polynucleotide luơn xác định, khơng thay đổi. Khoảng cách này bằng kích thước của một base loại purin cộng với kích thước của một base loại pirimidin. + A luơn luơn đi với T là vì giữa 2 base này chỉ cĩ khả năng hình thành nên hai liên kết hydrro ở các vị trí N6 - O6 và N1 - N1. G luơn luơn đi với X vì giữa 2 base này cĩ thể tạo ra 3 liên kết hydro ở các vị trí N6 - O6, N1 -N1 và N2 - O2. Vì vậy mà A chỉ liên kết với T và G chỉ liên kết với C. 5. Tính chất bổ sung giữa các cặp base dẫn đến tính chất bổ sung giữa hai chuỗi polynucleotide của DNA. Do đĩ biết thành phần, trật tự sắp xếp của các nucleotide trên chuỗi này sẽ suy ra thành phần, trật tự sắp xếp của các nucleotide trên chuỗi kia. Đặc điểm quan trọng nhất của mơ hình là đối song song (antiparallel). Để các bazơ tương ứng đối diện nhau, hai mạch cần phải bố trí: đầu của sợi này đối diện với đuơi của sợi kia. Mơ hình Watson-Crick ra đời từ năm 1953 và trong vịng 25 năm tiếp theo nĩ được cơng nhận và sử dụng rộng rãi. Mãi đến những năm 70, nhờ dùng các phân tích chính xác nhiều dạng DNA đã được phát hiện, dạng thường gặp là dạng B theo mơ hình của Watson-Crick, đây là cấu trúc phổ biến cho hầu hết sinh vật. Mỗi dạng DNA là một dịng họ các phân tử cĩ kích thước dao động quanh các trị số trung bình Hai chỉ số được dùng để đánh giá DNA - Chỉ số h: là chiều cao giữa hai nu kề nhau. - Chỉ số n: số nucleotide của một vịng xoắn Ngồi DNA dạng B, cịn nhiều dạng xoắn phải khác (A, C, D ...) chúng phân biệt với DNA dạng B về khoảng cách giữa các base cũng như độ nghiêng của chúng so với trục và sự phân bố trên chuỗi kép. 10 Gần đây, người ta cịn phát hiện ra một dạng DNA cĩ bộ khung zigzag và đĩng xoắn theo chiều trái, gọi là DNA xoắn trái hay DNA Z, trên mỗi vịng xoắn cĩ tới 12 cặp base. Giải thích sự tồn tại của DNA Z cĩ nhiều quan niệm khác nhau: Theo Watson, chỉ trong những điều kiện đặc biệt, như nồng độ muối cao thì các vùng chứa trình tự ...GCGCGC... chuyển sang cấu hình Z, ngược lại ở nồng độ muối thấp chúng quay trở lại dạng B. Điều đĩ chứng tỏ DNA Z cĩ thể đĩng vai trị giảm sức căng cục bộ trong phân tử DNA siêu xoắn hoặc cĩ thể tương tác đặc thù với các protein điều hịa. Tuy nhiên A. Rich cho rằng DNA Z xảy ra trong tự nhiên mà bằng chứng là cĩ mặt trong ruồi giấm bình thường. Cĩ thể là vùng DNA Z nằm xen kẻ với vùng DNA B và chúng cĩ thể xoay hình dáng thành dạng B khi xảy ra các biến đổi hĩa học nào đĩ làm cho DNA Z trở nên khơng ổn định. Rich cịn gợi ý rằng những gen nằm ở các vùng bị xoay như thế thì cĩ thể tháo xoắn sau đĩ và bắt đầu phiên mã. Nhờ vậy mà protein cĩ thể được tổng hợp. Mặc dù đây mới chỉ là giả thiết song khám phá này đã cung cấp một cơng cụ tiềm năng cho nghiên cứu về hoạt động của các gen và DNA.Việc phát hiện các dạng DNA cho thấy DNA trong tế bào khơng đơn điệu. tùy trạng thái sinh lý mà DNA ở dạng này hoặc dạng khác. Hình 1.8 DNA dạng xoắn kép Z a. Mơ hình dạng B của Watson-Crick, là dạng xoắn phải với trục đều b. Mơ hình dạng Z, là dạng xoắn trái với trục khơng đều 1.2. DNA cuộn lại trong tế bào Hầu hết trong cơ thể sinh vật, DNA cĩ chiều dài dài hơn rất nhiều lần so với chiều dài của tế bào. 11 Ví dụ: phage T2 cĩ chiều dài tế bào khoảng 0,16 µm, trong khi chiêu dài ADN của chúng khoảng 50 µm. Hình 1.9 Các dạng thẳng, vịng trịn và xiêu xoắn của DNA Do đĩ DNA ở trong tế bào phải cuộn xoắn. Sự cuộn xoắn này rất tinh vi vì trong quá trình tồn tại, các gen phải hoạt động, như vậy nĩ phải là một chất cĩ hoạt tính thường xuyên Người ta thấy DNA cĩ thể ở 3 dạng cấu trúc: - Dạng siêu xoắn: mạch kép vặn xoắn lại thành hình số 8. Đây là dang tự nhiên ở vi khuẩn. 12 - Dạng vịng trịn: sợi DNA căng trịn cĩ được do DNA siêu xoắn bị cắt đứt 1 trong hai mạch kép. - Dạng thẳng: khi DNA bị cắt đứt cả hai mạch. Mơ hình về bộ gen của E .coli Ở E. coli, chiều dài DNA được rút ngắn đáng kể, sự cuộn lại được thực hiện nhờ vào các RNA nối. Khi các RNA nối bị cắt thì các DNA bung dài ra, thuận lợi cho sự sao chép DNA. Nếu mạch DNA bị cắt, DNA được tháo xoắn, căng ra thuận lợi cho sự tổng hợp protein. Hình 1.10 Mơ hình cấu trúc nhiễm sắc thể (bộ gen) của E. coli (Theo Pettijohn và Hecht, 1974) 13 Hình 1.11 Sự tháo xoắn DNA trong tế bào vi khuẩn 2. RNA Ở các sinh vật như: thực khuẩn thể, virus của động vật, virus của thực vật... thì vật liệu di truyền là RNA. Ở các sinh vật bậc cao cĩ RNA là bản sao mã của DNA. RNA cĩ cấu tạo từ các đơn phân là các ribonucleotide. Giống với nucleotide, mỗi ribonucleotide gồm ba thành phần: đường ribose, H3PO4, bazơnitric (T được thay bằng U). Trong tế bào cĩ ba loại RNA: 2.1. RNA riboxom (ribosomal RNA-rRNA) rRNA cùng với protein cấu tạo nên ribosome. rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào cĩ thể đến 75% của tổng RNA. Ở các ribosome khác nhau cĩ các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi hằng số lắng S: - Eukaryote : ribosome cĩ hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai đơn vị: + Đơn vị lớn ( 60S) cĩ rRNA 28S; 5,8S; 5S + Đơn vị nhỏ (40S) cĩ rRNA 18S - Prokaryote và lục lạp, ty thể cĩ hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 đơn vị: + Đơn vị lớn (50S): cĩ loại rRNA 23S; 5S + Đơn vị nhỏ (30S): cĩ rRNA 16S 14 RNA ribosom cĩ cấu trúc bậc I (mạch thẳng) và cấu trúc bậc hai. Trong ribosome, các rRNA tồn tại ở dạng cấu trúc bậc hai. RNA ribosom cĩ cấu tạo là một sợi xoắn cĩ nhiều vùng liên kết đơi theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với U, G liên kết với X và cĩ khi G liên kết với U. Trong tế bào rRNA chiếm tỷ lệ cao cĩ thể lên đến 75-80% tổng số RNA Hình 1.12 rRNA cấu tạo nên ribosom 2.2. RNA vận chuyển (Transfer RNA - tRNA) Mỗi tRNA gắn với một phân tử amino acid, mang đến ribosome để tham gia tổng hợp protein. Mỗi tRNA đặc hiệu cho một loại amino acid. Cĩ hơn 20 loại tRNA khác nhau tương ứng với hơn 20 loại amino acid. Trong thực tế, người ta thấy số lượng tRNA lớn hơn rất nhiều so với số lượng amino acid vì một amino acid cĩ nhiều bộ ba mã hĩa. Đồng thời cùng một bộ ba mã hĩa, vẫn cĩ thể cĩ nhiều tRNA do hiện tượng biến đổi của các nucleotide trong tRNA tạo nên các loại tRNA mới và trong quá trình tổng hợp tRNA, sau khi hình thành chuỗi polynucleotide cịn chịu sự tác động của các yếu tố của mơi trường nội và ngoại bào làm các nucleotide bị biến đổi, tạo ra các tRNA mới. Các tRNA cùng tham gia vận chuyển một acid amin là các izoaceptor. Số lượng izoaceptor thay đổi tùy acid amin. 15 Cấu trúc bậc I của tRNA: tRNA vận chuyển cĩ phân tử lượng nhỏ: 25.000-30.000, gồm 75-90 nucleotide, cĩ hằng số lắng 4S. Trong thành phần cấu trúc của tRNA cĩ khoảng 10% các nucleotide hiếm với khoảng 30 loại khác nhau. Mọi cấu trúc của tRNA đều cĩ 2 đầu 5' và 3' giống nhau: đầu 5' luơn chứa G với gốc P tự do, cịn đầu 3' luơn cĩ 3 nucleotide là CCA 3'-OH. Nhĩm 3'-OH của A cĩ thể liên kết với acid amin để tạo phức hợp tRNA-aminoacyl. Chuỗi polynucleotide cuộn lại cĩ những đoạn tạo mạch xoắn kép, hình thành cấu trúc bậc hai của tRNA. Hình 1.13 Cấu trúc của tRNA Enzyme aminoacyl tRNA synthetase gắn amino acid với tRNA tương ứng. Mỗi enzyme đặc hiệu cho một loại amino acid riêng biệt và xúc tác phản ứng gắn với tRNA của nĩ nhờ năng lượng ATP tạo ra aminoacyl tRNA. Phức hợp aminoacyl tRNA đến ribosome gắn với mRNA bằng nhờ các bộ ba đối mã (anticodon) trên tRNA bắt cặp bổ sung với các bộ ba mã hĩa (codon) trên mRNA. 16 Các tRNA cĩ một số đặc tính cấu trúc chung: chiều dài khoảng 73- 93 nucleotide, cấu trúc gồm một mach cuộn lại như hình lá chẻ ba nhờ bắt cặp bên trong phân tử. Đầu mút 3’ cĩ trình tự kết thúc là CCA, amino acid luơn gắn vào đầu này. Đầu 5 chứa gốc phosphate của G. Mỗi tRNA cĩ cĩ 4-5 vùng với chức năng khác nhau: - Vịng DHU: cĩ chứa nucleotide dihydrouridin, vùng này cĩ chức năng nhận biết aminoacyl tRNA synthetase - Vịng anticodon: đọc mã trên mRNA theo nguyên tắc kết cặp anticodon – codon. - Vịng phụ: cĩ thể khơng cĩ ở một số RNA. - Vịng TφC: cĩ chứa nucleotide pseudouridin, vùng này cĩ chức năng nhận biết ribosom để vào đúng vị trí tiếp nhận aminoacyl tRNA (vị trí A) - Đấu 3’ –CCA: vị trí gắn với acid amin. tRNA chiểm khoảng 15% tổng số RNA của tế bào 2.3. RNA thơng tin (messenger RNA – mRNA) RNA thơng tin làm nhiệm vụ truyền đạt thơng tin di truyền từ DNA đến protein. mRNA chiểm khoảng 5% tổng số RNA tế bào. Cấu trúc của mRNA: 5’ m7GxpYp AUG UAG 3’ vùng 5’ vùng vùng 3’ khơng mã hĩa mã hĩa khơng mã hĩa X, Y cĩ thể là A hoặc G DNA polymerase khởi sự phiên mã ở đoạn nằm ngay trước vùng mã hĩa được gọi là đoạn 5’ khơng mã hĩa (5’-non coding). Do đĩ mRNA cĩ đoạn đầu mang các tín hiệu cho ribosome nhận biết để gắn vào dịch mã. Ở đuơi 3’ sau dấu kết thúc cĩ đoạn 3’ khơng mã hĩa là nới gắn poly-A. Các mRNA của prokaryote cĩ nữa thời gian (half life) tồn tại ngắn trung bình 2 phút. Các mRNA của Eukaryote cĩ nữa thời gian tồn tại khoảng 30 phút - 24 giờ. 17 Hình 1.14 mRNA ở Prokaryote Hình 1.15 mRNA ở eukaryote 2.4. Ribozym và self- splicing Vào 1981, phát minh về vai trị xúc tác của một số phân tử RNA đã làm đảo lộn quan điểm về chất này. Các phân tử rRNA của các lồi nguyên sinh động vật, lúc đầu được tổng hợp với một số lượng lớn tiền chất, từ số các rRNA này sẽ cĩ một được tạo ra bằng cách tự cắt nối (self - splicing). Quá trình cắt nối này cĩ thể xảy ra ở in vitro trong sự vắng mặt của protein. Điều đĩ cho thấy rằng các trình tự intron tự nĩ cĩ hoạt tính xúc tác tương tự enzyme. Phản ứng self-splicing trong đĩ trình tự intron tự xúc tác quá trình tự cắt rời khỏi phân tử rRNA ở lồi Tetrahymena qua 2 bước: + phản ứng được bắt đầu khi nucleotide G gắn vào trình tự intron, đồng thời cắt mạch RNA. 18 5’ Vị trí gắn Rb Mã khởi đầu AUG Vùng không mã hóa 3’ P1 UAA mã kết thúc P2 UAA mã kết thúc P3 UAA mã kết thúc Mã khởi đầu AUG Mã khởi đầu AUG Vị trí gắn Rb Vị trí gắn Rb P P PG 5’ 5’ CAP Vị trí gắn Rb Vùng không mã hóa AUG Mã kết thúc UAA Vùng không mã hóa A-A-A--3’ + Đầu 3’ của RNA mới vừa được tạo ra gắn vào đầu bên kia của intron hồn thành phản ứng nối liền Hình 1.16 Hoạt động cắt intron và nối exon trên mRNA Trình tự intron dài 400 nucleotide đã được tổng hợp trong ống nghiệm và nĩ cuộn lại tạo phức hợp bề mặt cĩ hoạt tính tương tự enzyme trong các phản ứng với các RNA khác. Mặc dù splicing phần lớn khơng được thực hiện tự động như ở Tetrahymena nhưng hiện tượng này cũng được phát hiện ở những sinh vật khác, cả ở nấm và vi khuẩn. Các RNA cĩ khả năng tự xúc tác được gọi là ribozyme. Phát hiện này cĩ ý nghĩa quan trọng trong việc tìm hiểu cơ chế và nguồn gốc sự sống. 19 Hình 1.17 Phản ứng self-splicing của RNA III Các tính chất của DNA 1. Biến tính (denaturation) và hồi tính (renaturation) Hai mạch đơn của phân tử AND gắn với nhau nhờ các liên kết hydro.Khi đun nĩng DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80- 95oC), các liên kết hydro giữa 2 mạch bị đứt và chúng tách rời nhau. Trước tiên các mối liên kết A-T, khi nhiệt độ > 90oC các liên kết G -C bị đứt. Đĩ là hiện tượng biến tính của DNA. Nhiệt độ mà ở đĩ 2 mạch DNA tách rời nhau được gọi là điểm chảy melting poin) của DNA: Tm. Nhiệt độ này đặc trưng cho mỗi loại DNA, phụ 20 thuộc vào số lượng các liên kết hydro. DNA cĩ tỷ lệ G-C cao sẽ cĩ điểm chảy cao. DNA cĩ 60% G-C thì điểm chảy là 95oC. Hình 1.18 Sự biến tính và hồi tính của DNA Ngồi nhiệt độ, người ta cịn dùng chất formanide (NH2 -CH = 0) làm biến chất DNA ở 40oC Các DNA bị biến chất được hạ nhiệt độ từ từ, ở 60o -700C các nucleotide sẽ gắn lại với nhau để tạo nên DNA mạch kép. Hiện tượng này gọi là hồi tính. 21 Cĩ thể biết được DNA bị biến tính hoặc chưa nhờ vào sự gia tăng hấp thụ tia cực tím khi bị biến tính và sự giảm hấp thu tia cực tím khi hồi tính. Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đơi chuyển thành mạch đơn, điều này xảy ra do “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect), hoặc dựa vào sự thay đổi độ lắng tụ trong ống nghiệm khi ly tâm. 2. Lai acid nucleic Sử dụng đặc tính biến tính rồi hồi tính cĩ thể tiến hành lai DNA với DNA, DNA với RNA, RNA với RNA. Nguyên tắc: lấy DNA A làm biến tính thành mạch đơn, trộn với DNA B cũng bị biến tính thành mạch đơn. Dung dịch được hạ nhiệt độ từ từ để xảy ra hồi tính. Đây là kiểu lai lỏng hay lai trong dung dịch. Quá trình hồi tính xảy ra, sợi A kết với A, B kết với B, đồng thời cĩ sợi A kết với B tạo thành phân tử lai. Muốn lai được với nhau, giữa 2 loại DNA phải cĩ những đoạn cĩ trình tự bổ sung nhau. Cĩ thể dùng đồng vị phĩng xạ đánh dấu để phát hiện đoạn lai. Hiện nay cịn sử dụng phương pháp lai trên pha rắn, được sử dụng rộng nhất: + Phương pháp Southern blot, dùng cho DNA + Phương pháp Northern blot dùng cho RNA + Phương pháp dot (điểm) và slot (khe) blot dùng cho RNA và DNA - Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kiểu lai phân tử trong đĩ trình tự acid nucleic cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mơ. Lai tai chỗ cho phép nghiên cứu NST, khuẩn lạc hay mơ tế bào mà khơng cần tách chiết chúng. Dùng phương pháp lai DNA: + Cĩ thể xác định mối quan hệ họ hàng giữa các lồi. DNA người và DNA chuột chỉ lai được 25%. + Cĩ thể tiến hành lai mRNA với DNA để xác định vị trí gen trên DNA tạo ra mRNA tương ứng. Phương pháp lai acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nĩ là cơ sở của phương pháp chẩn đốn mới dùng acid nucleic đang đuợc sử dụng rộng rãi. 22 Hình 1.19 Phát hiện các DNA lai với mẫu dị IV. Những cấu trúc chứa DNA trong tế bào 1. Những đoạn DNA chứa thơng tin di truyền Đại phân tử DNA là do polynucleotide tạo thành, được chia làm nhiều đoạn. Mỗi đoạn là một đơn vị chức năng, gọi là gen Gen được định nghĩa trong di truyền học: + Mendel là người đầu tiên nêu lên khái niệm “nhân tố di truyền” + J. Morgan cụ thể hĩa khái niệm về gen: gen nằm trên nhiễm sắc thể chiếm một locus nhất định. Gen là đơn vị chức năng xác định một tính trạng. + Sau khi học thuyết trung tâm ra đời: gen là đoạn DNA trên nhiễm sắc thể khơng những mã hĩa cho các loại protein mà cả các loại RNA. + Cuối những năm 70, sau khi phát hiện ra gen gián đoạn: gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptid nĩ bao gồm cả vùng trước và sau vùng mã hĩa cho protein và cả những đoạn khơng mã hĩa xen giữa các đoạn mã hĩa. Hiện nay cĩ thể định nghiã tổng quát như sau: gen là đơn vị chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một locus nhất định trên NST và xác định một tính trạng nhất định. Các gen là những đoạn vật chất di truyền mã hĩa cho những sản phẩm riêng lẻ như các RNA được sử dụng trực tiếp cho 23 tổng hợp các enzym, các protein cấu trúc hay các mạch polypeptid để gắn lại tạo ra các protein cĩ hoạt tính sinh học. Tồn bộ những gen khác nhau của cơ thể, gọi là Idiotype. Ở Eukaryote nĩ bao gồm các gen trên nhiễm sắc thể (chromotype) và các gen ngồi nhân (plasmotype). Ở prokaryote, nĩ bao gồm bộ gen và plasmid. 2. Virus chứa DNA và virus chứa RNA Virus gây bệnh đốm thuốc lá (mosaic tobacco virus - MTV) là virus chứa RNA sợi đơn. Nĩ là một hạt hình que dài 300 nm, cĩ đường kính 18 nm. Bên ngồi cĩ một vỏ chứa 2130 phân tử và một vịng xoắn RNA ở bên trong. Chiều cao vịng xoắn: 23Ao, khối lượng phân tử = 2.106 đvC. Hình 1.20 Virus khảm thuốc lá a. Ảnh virus khảm thuốc lá chụp bằng kính hiển vi điện tử ở độ phĩng đại 37.428X b. RNA điều khiển sự hình thành tính trạng vỏ của virus Một số virus chứa DNA sợi đơi như các thực khuẩn thể T2, T4, T6 chứa DNA mạch đơi thẳng, dài. Cĩ chứa 2.105 đơi nucleotide, khối lượng 24 phân tử: 130.10 đvC. Khi lực thẩm thấu của mơi trường thay đổi đột ngột, phân tử DNA này thốt ra khỏi vỏ protein, người ta chụp ảnh được ảnh DNA của tjực khuẩn thể T2 với chiều dài 0,05 mm (50µm), phân tử này xếp gọn ở phần đầu của thực khuẩn thể. Tất cả thực khuẩn thể T số chẵn chứa DNA với mạch polynucleotide giống nhau, nên khi trộn lẫn các DNA mạch đơn đã bị biến tính của chúng với nhau thì các mạch đơn này cĩ thể tạo thành phân tử lai. Phân tử DNA của T3, T7 khơng thể hình thành phân tử DNA lai với DNA của T số chẵn. Cịn virus ΦX174 cĩ chứa DNA sợi đơn gồm 5400 nucleotide với khoảng 9 gen. 3. Nhiễm sắc thể chính và plasmid của vi khuẩn DNA của vi khuẩn làm thành thể nhân, tiếp xúc trực tiếp với tế bào chất, khơng cĩ màng nhân làm giới hạn. DNA của thể nhân là DNA mạch vịng, xoắn kép Ví dụ: DNA E.coli cĩ đường kính 350 µm, gồm 4.106 đơi nucleotide và chứa khoảng 500 gen xếp nối tiếp nhau thành chuỗi dài chi phối tất cả các hoạt động chức năng của sự sống. Plasmid cũng là phân tử DNA mạch kép, dạng vịng ở bên cạnh thể nhân. Khối lượng phân tử trung bình khoảng 1% DNA của thể nhân. Các plasmid cĩ thể gắn tạm thời hoặc vĩnh viễn ở trên NST chính của vi khuẩn. Cĩ thể tham gia sự tự nhân đơi và tham gia tiếp hợp khác như là một phần của NST chính. 4. Nhiễm sắc thể Eukaryota. 4.1 Các trình tự lặp lại và đơn độc DNA được cắt thành từng đoạn nhỏ, cho biến tính, sau đĩ hồi tinh thì các đoạn cĩ trình tự bổ sung dễ tái tổ hợp với nhau hơn các đoạn khác. Nhờ vậy cĩ thể nhận biết được các trình tự lặp lại. Dựa vào đĩ phân DNA thành ba loại: + DNA đơn độc (tái hợp rất chậm) + DNA lặp lại trung bình (tái hợp nhanh vừa) + DNA lặp lại cao (tái hợp rất nhanh) 25 Mặc dù DNA mang thơng tin mã hĩa cho các protein nhưng trong thực tế chỉ cĩ khoảng 10% trong số 3 tỷ cặp nucleotide trong genome của người thực sự làm chức năng này. Căn cứ vào đặc điểm cấu trúc và phân, chia DNA thành các loại sau: - DNA đơn độc (Single copy DNA) Đây là loại phổ biến nhất, chiếm khoảng 75% genome. Các đoạn DNA này chỉ thấy 1 lần (hoặc vài lần) trong genome. Một phần nhỏ của DNA loại này là các gen mã hĩa cho protein. Hẫu hết các DNA đơn độc là các intron hoặc là các đoạn nằm xen giữa các gen. - DNA lặp lại (repetitive DNA) Chiểm 25% cịn lại của genome, đây là các đoạn DNA được lặp đi lặp lại hàng ngàn lần trong genome. DNA lặp lại gồm 2 loại: + DNA vệ tinh (satellite DNA): loại DNA tập trung ở 1 số vùng nhất định trên NST, ở đĩ chúng xếp đuơi nhau, cái này tiếp cái kia. Loại này chiếm 10% bộ gen. + DNA lặp lại rãi rác: loại DNA này chiếm khoảng 15% genome, gồm 2 loại: Các yếu tố rãi rác cĩ kích thước ngắn SINEs (short interspersed repetitive elements): kích thước từ 90-500 bp. Trong nhĩm này cĩ loại DNA lặp lại tên Alu với kích thước khoảng 300 bp, mang đoạn DNA cĩ thể bị enzyme hạn chế Alu I cắt (đây là enzyme cĩ nguồn gốc từ vi khuẩn Arthrobacter luteus). Đoạn lặp Alu là 1 họ bao gồm các đoạn DNA cĩ độ giống nhau cao, phân bố rãi rác khắp hệ gen với khoảng 300.000 bản sao, chiếm khoảng 2-3% tồn bộ DNA của người, chúng được xem như là các yếu tố vận động. Ở 2 đầu mỗi đoạn Alu cĩ các đoạn lặp cùng chiều ngắn khoảng 7-10 bp. Bên trong đoạn Alu cĩ các đoạn lặp dài khoảng 40 bp. Điểm đặc biệt của các đoạn lặp DNA này là cĩ thể tạo ra bản sao của mình và cĩ thể cài vào các phần khác của bộ gen. Hiện tượng này đơi khi cĩ thể làm gián đoạn một gen mã hĩa cho protein nào đĩ và gây ra tình trạng bệnh lý di truyền. Vai trị của các trình tự Alu đến nay chưa rõ. Một điều đáng kinh ngạc là cĩ sự tương đồng (homologus) từ 80-100% giữa phần 3' của Alu với đầu mút 5' và 3' của RNA 7SL, là phần tương tác với các tín hiệu peptid trước khi vận chuyển ra tế bào chất. Việc xác định trình tự nucleotide của 26 Alu cho thấy cĩ ít nhất 6 nhĩm phụ và tất cả đều bắt nguồn từ DNA mã hĩa cho RNA 7SL. Các yếu tố rãi rác cĩ kích thước dài LINEs (long interspersed repetitive elements): bao gồm các họ LINE 1 (hay Kpn 1) và THE 1. Các trình tự LINE cĩ chiều dài khoảng 6000-7000 bp với gần 5.000 bản sao nguyên vẹn và 100.000 bản sao từng phần rãi rác khắp bộ gen người. Chúng là những trình tự lặp lại khơng mã hĩa dài nhất và thường ở vùng giàu AT. Các bản phiên mã trình tự LINE gắn với protein tạo thành phức hợp ribonucleoprotein. Ở một dịng tế bào người bị ung thư (teratocarcinome), người ta quan sát thấy cĩ các ribonucleoprotein này. Sự xen đoạn LINE vào các vị trí khác nhau cĩ thể gây hậu quả nhất định, như trong một trường hợp bệnh máu khơng đơng A (hemophilia). 4.2. Nhiễm sắc thể của Eukaryota Nhiễm sắc thể chứa một phân tử DNA thẳng, mạch kép. NST Eukaryote gồm DNA và protein, trong số đĩ histon là protein cốt lõi trong việc cuộn lại và điều hịa hoạt tính của DNA. Sự hình thành NST kỳ giữa từ chuỗi xoắn kép DNA qua hệ thống các bậc cấu trúc sau: + Nucleosome là đơn vị cấu trúc của NST được tạo nên do sợi DNA dài quấn quanh các protein histon thành sợi 11nm. Đơn vị này là phức hợp gồm 146 cặp nucleotide của DNA quấn quanh 8 phân tử histon: 2H2A, 2H2B, 2H3 ,2H4. Các nucleosome kề nhau được nối qua một phân tử histon trung gian H1. + Sợi chromatin dày 30nm: các nucleosome xếp sít nhau tạo thành phức hợp nucleoprotein. + Vùng xếp cuộn dày 300 nm do sợi chromatin sau nhiều lần xoắn uốn khúc tạo nên. + Chất dị nhiễm sắc 700 nm + Kỳ giữa 1400nm. 27 Hình 1.21 DNA quấn quanh bởi protein histon 28 Hình 1.22 Phức hợp nucleoprotein cuộn lại thành NST 4.3. Trình tự CEN: trình tự lặp lại cao CEN là của các tâm động. 4.4. Trình tự TEL: thuộc các telomer (đầu mút của NST) với nhiều vai trị khác nhau: bảo vệ đầu mút NST khỏi bị cắt bởi nuclease, giữ chiều dài của NST khi sao chép, gắn với màng nhân và kìm hãm sự biểu hiện của các gen ở đầu mút. Các trình tự TEL cĩ tính bảo tồn cao trong tiến hĩa. Chúng cĩ số lần lặp lại cao, giàu A và C. 29 Câu hỏi ơn tập 1. Nêu chứng minh gián tiếp cho thấy DNA là vật chất di truyền. 2. Trình bày thí nghiệm biến nạp qua đĩ chứng minh DNA là vật chất di truyền. 3, Các đặc điểm của mơ hình cấu trúc của Watson và Crick (1953). 4. Mơ tả các dạng tồn tại của DNA trong tế bào. 5. Mơ hình vầ cấu trúc bộ gene của E. coli. 6. Cấu trúc và chức năng các loại RNA trong tế bào Eukaryote. 7. DNA và RNA khác nhau ở những cấu phần nào 8. Hãy nêu các tính chất của phân tử DNA. 9. Các trình tự lặp lại ở DNA Eukaryote 10. Trình bày các mức độ kết cuộn của DNA để hình thành nhiễm sắc thể. Tài liệu tham khảo Trịnh Văn Bảo, Phan Thị Hoan, Trần Thị Thanh Hương, Trần Thị liên, Trần Đức Phấn, Phạm Đức Phùng, Nguyễn Văn Rực, Nguyễn Thị Trang. 2002. Các nguyên lý sinh học. NXB Y học Hà Nội. Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Nguyễn Bá Lộc (2004). Acid nucleic và sinh tổng hợp protein. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo Dục. Hồng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế. Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers. Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Inc., New York. 30