Bài giảng Đại cương về sắc ký – Nguyễn Đức Tuấn

Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù (Chromatography) PGS.TS. Nguyeãn Ñöùc Tuaán Boä moân Hoùa Phaân Tích – Kieåm Nghieäm Khoa Döôïc – Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Muïc tieâu - Trình baøy ñöôïc ñònh nghóa saéc kyù, caùc giai ñoaïn cuûa quaù trình saéc kyù, phaân loaïi saéc kyù, hai yeáu toá chuû yeáu quyeát ñònh quaù trình taùch saéc kyù, nguyeân taéc cuûa saéc kyù haáp phuï, phaân boá, trao ñoåi ion, raây phaân töû, aùi löïc - Giaûi thích ñöôïc yù nghóa cuûa caùc thoâng soá saéc kyù - ÖÙng duïng ñöôïc caùch ñònh tính, ñònh löôïng baèng phöông phaùp saéc kyù Ñaïi Cöông Veà Saéc Kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Daøn baøi - Lòch söû - Ñònh nghóa - Quaù trình saéc kyù - Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù - Söï taùch saéc kyù vaø saéc kyù ñoà - Caùc thoâng soá ñaëc tröng cuûa saéc kyù - ÖÙng duïng cuûa saéc kyù Lòch söû - Ñònh nghóa Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Ether daàu hoûa Saéc toá TV CaCO 3 Chlorophyl Xanthophyl t0 t1  1906: Mikhail Tswett – saéc kyù loûng haáp phuï treân coät  1938: Izmailov & Schraiber – xaây döïng phöông phaùp SKLM  1958: Stahl – hoaøn thieän phöông phaùp SKLM  1941: Martin & Synge – ñaët neàn taûng cho saéc kyù phaân boá: SKG vaø SKK  1952: Martin & James – baøi baùo ñaàu tieân veà SKK  Cuoái naêm 1960: saéc kyù loûng cao aùp ra ñôøi  1937 – 1972: 12 giaûi Nobel veà saéc kyù  Ñaàu naêm 2005: saéc kyù loûng sieâu aùp  2012: Sắc ký hội tu siêu hiệu năng Lòch söû - Ñònh nghóa Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Qui trình trong ñoù chaát tan ñöôïc taùch rieâng ra bôûi quaù trình dòch chuyeån khaùc nhau veà ñoäng löïc hoïc cuûa chuùng trong moät heä thoáng hai hay nhieàu pha. Moät trong caùc pha naøy chuyeån ñoäng moät caùch lieân tuïc theo moät höôùng nhaát ñònh vaø trong pha naøy caùc chaát rieâng bieät theå hieän linh ñoä khaùc nhau laø do coù söï khaùc nhau veà phaân boá, haáp phuï, ñieän tích, kích thöôùc phaân töû, ñoä hoøa tan vaø aùp suaát hôi  Saéc kyù ñoøi hoûi hai pha:  Pha ñoäng: loûng, khí, loûng sieâu tôùi haïn  Pha tónh: coá ñònh trong coät hay treân beà maët chaát mang raén trô hoùa hoïc  Chaát raén hay chaát loûng ñöôïc taåm, haáp phuï hay lieân keát hoùa hoïc chaát mang  Töông taùc vôùi chaát tan theo caùc cô cheá haáp phuï, phaân boá, trao ñoåi ion, aùi löïc  Phöông phaùp saéc kyù ñöôïc aùp duïng trong caùc ngaønh khoa hoïc khaùc nhau  Ngaønh Döôïc: nghieân cöùu, phaân tích, kieåm nghieäm thuoác A B Hôïp chaát B Hôïp chaát A SAÉC KYÙ LOÛNG HIEÄU NAÊNG CAO Quaù trình saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Ñöa hoãn hôïp leân pha tónh  Khai trieån saéc kyù  Saéc kyù khai trieån  Saéc kyù röûa giaûi:  Quaù trình röûa giaûi  Dung moâi röûa giaûi (eluent)  Dung dòch röûa giaûi (eluate)  Phaùt hieän caùc chaát  Maøu cuûa chaát  Ñeøn töû ngoaïi  Phun thuoác thöû  Ñaàu doø (detector) Maãu Trieån khai saéc kyù x x x O X A F Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Theo baûn chaát vaät lyù caùc pha Teân kyõ thuaät Pha tónh Loaïi caân baèng Saéc kyù loûng (liquid chromatography): pha ñoäng laø chaát loûng - Chaát loûng ñöôïc haáp phuï treân 1 chaát raén (chaát mang) - Pha lieân keát - Chaát raén - Phaân boá giöõa hai pha loûng - Phaân boá giöõa pha loûng vaø beà maët pha lieân keát - Haáp phuï Saéc kyù khí (gas chromatography, GC): pha ñoäng laø chaát khí - Chaát loûng ñöôïc haáp phuï treân chaát raén - Pha lieân keát - Chaát raén - Phaân boá giöõa pha khí vaø pha loûng - Phaân boá giöõa pha khí vaø pha lieân keát - Haáp phuï Saéc kyù loûng sieâu tôùi haïn (supercritical fluid chromatography, SFC): pha ñoäng laø chaát loûng sieâu tôùi haïn - Pha lieân keát - Phaân boá giöõa pha loûng sieâu tôùi haïn vaø pha lieân keát Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Theo phöông caùch cho pha ñoäng đi qua pha tónh  Saéc kyù khai trieån  Saéc kyù röûa giaûi  Theo phöông caùch löu giöõ pha tónh  Saéc kyù coät  Saéc kyù lôùp moûng  Saéc kyù giaáy Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Theo baûn chaát cuûa quaù trình saéc kyù  Saéc kyù haáp phuï  Saéc kyù phaân boá  Saéc kyù trao ñoåi ion  Saéc kyù raây phaân töû  Saéc kyù aùi löïc  Sắc ký cặp ion Phaân loaïi caùc phöông phaùp saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Thoâng thöôøng  Saéc kyù coät (Column Chromatography, CC)  Saéc kyù giaáy (Paper Chromatography, PC)  Saéc kyù lôùp moûng (Thin Layer Chromatography, TLC)  Saéc kyù khí (Gas Chromatography, GC)  Saéc kyù loûng hieäu naêng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)  Saéc kyù loûng sieâu “hieäu naêng” (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC), UHPLC hoặc UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography)  Sắc ký hội tụ siêu “hiệu năng” (Ultra Performance Convergence Chromatography, UPCC, UPC2) Cô cheá taùch – Phaân boá Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Chaát phaân tích hoøa tan trong pha tónh loûng bao treân beà maët chaát mang raén trô K S1 (pha 1) S2 (pha 2) K: heä soá phaân boá 1 ][ 2 ][ S S K Chaát mang raén Pha tónh Chaát phaân tích   A B D C C K KD: heä soá phaân boá bieåu kieán Cô cheá taùch – Haáp phuï Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM n: soá mol pha ñoäng bò thay theá töø beà maët S 2 : phaân töû chaát tan trong pha ñoäng S 1 : phaân töû chaát tan bò haáp phuï M 2 : phaân töû pha ñoäng M 1 : phaân töû pha ñoäng bò haáp phuï : beà maët hoaït ñoäng cuûa pha tónh S 2 + nM 1 S 1 + nM 2 n n MS MS K ]][[ ]][[ 12 21 - Pha ñoäng luoân chaïy theo moät chieàu nhaát ñònh neân luoân xaûy ra quaù trình haáp phuï vaø phaûn haáp phuï - Caùc chaát tan seõ bò keùo theo pha ñoäng vaø coù aùi löïc khaùc nhau vôùi pha tónh Chaát tan haáp phuï treân beà maët pha tónh Cô cheá taùch – Trao ñoåi ion Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Pha tónh laø caùc chaát trao ñoåi ion. Goàm 2 loaïi:  Nhöïa trao ñoåi cation (cationit): Cationit acid maïnh -SO 3 - H + Cationit acid yeáu -COO - H +  Nhöïa trao ñoåi anion (anionit): Anionit base maïnh -N(CH 3 ) 3 + OH - Anionit base yeáu -NH 3 + OH - Tieán trình trao ñoåi: (M x+ vaø A x- : ion chaát tan) Cation: xRSO 3 - H + + M x+ (RSO 3 - ) x M x+ + xH + Anion: xRN(CH 3 ) 3 + OH - + A x- [RN(CH 3 ) 3 + ] x A x- + xOH - - Pha ñoäng thöôøng laø caùc dung dòch ñeäm coù pH vaø chaát ñieän ly thích hôïp. - Pha ñoäng coù theâm moät soá dung moâi höõu cô nhö MeOH, EtOH,ñeå laøm taêng ñoä hoøa tan hay ñoä choïn loïc cho chaát tan caùc ion chaát tan caïnh tranh treân maïng ion Ion phaân tích Ion traùi daáu Ionit Ñieän tích coá ñònh Quaù trình trao ñoåi ion Cô cheá taùch – Trao ñoåi ion Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Sử dụng nhựa trao đổi ion để khử khoáng nước Cô cheá taùch – Raây phaân töû Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM - ÔÛ traïng thaùi caân baèng: C s C m C s, C m: noàng ñoä chaát tan trong pha tónh vaø pha ñoäng Heä soá K ñöôïc tính theo phöông trình: sV mVR V mC sCK Trong ñoù: V m: toång theå tích cuûa pha ñoäng naèm trong caùc loã xoáp cuûa caùc haït pha tónh V S : theå tích dung moâi giöõa caùc loã V R: theå tích bò löu giöõ cuûa chaát tan - Saéc kyù raây phaân töû = Saéc kyù loïc qua gel = Saéc kyù thaåm thaáu gel. - Duøng trong sinh hoùa ñeå taùch caùc protein, caùc carbohydrat, Cô cheá taùch – Aùi löïc Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM - Môùi vaø coù tính choïn loïc cao - Döïa vaøo töông taùc ñaëc hieäu giöõa moät loaïi phaân töû chaát tan vôùi moät phaân töû thöù hai lieân keát coäng hoùa trò vôùi pha tónh Ví duï: phaân töû lieân keát coäng hoùa trò vôùi pha tónh laø moät khaùng theå cuûa moät protein. Khi cho hoãn hôïp goàm haøng ngaøn protein qua coät, chæ coù moät pretein phaûn öùng vôùi khaùng theå ñöôïc giöõ laïi treân coät, caùc protein coøn laïi ñöôïc röûa khoûi coät. Protein bò giöõ laïi treân coät seõ ñöôïc taùch ra khoûi khaùng theå baèng caùch thay ñoåi pH hay noàng ñoä ion trong pha ñoäng. Saéc kyù aùi löïc Moät phaân töû töông taùc vôùi phaân töû lieân keát coäng hoùa trò vôùi pha tónh Caùc phaân töû khaùc ñöôïc röûa khoûi coät Quaù trình taùch saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Hai caùch taùch hai chaát xen phuû Söï taùch saéc kyù vaø saéc kyù ñoà Noàng ñoä chaát tan taïi caùc daõi A vaø B treân coät A B A B t1 t2 Caùc thoâng soá ñaëc tröng trong saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Ñeå taùch saéc kyù ñöôïc toát:  Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát tan  Hieän töôïng giaõn pic  Pic heïp vaø caân ñoái Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng Vò trí caùc veát treân saéc kyù ñoà coù theå xaùc ñònh nhôø chæ soá R f (Retardation factor) R d d v V f R M 0 ===> 0 R f 1 x x dM dR 1 2 Ñöôøng dung moâi - R f = 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån, naèm taïi ñieåm xuaát phaùt - R f = 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa dung moâi - d R : khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch - d M : khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi - v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch - V 0 : vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao Thôøi gian löu t R (phuùt): thôøi gian caàn thieát ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi tieâm maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho pic treân saéc kyù ñoà (tính töø luùc tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa pic).  t M (hoaëc t o ): thôøi gian löu cuûa moät chaát khoâng bò löu giöõ, coøn goïi laø thôøi gian cheát cuûa coät.  t R caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån cuûa noù caøng nhoû.  Thôøi gian löu hieäu chænh t' R ñöôïc tính theo coâng thöùc: t' R = t R - t M (hay t' R = t R - t o ) Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát Thể tích chết của cột (mL) vM 0,5 x 10 -3 x L x d2 L: chiều dài cột (mm) d: đường kính trong của cột (mm) Maùy HPLC Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 detector 18 1. Nguoàn heli 2. Bình dung moâi 3. Ñaàu phun 4. Ñaàu loïc 5. Van tyû leä dung moâi 6. Bôm 7. Van kieåm tra vaøo 8. Van kieåm tra ra 9. Khöû xung 10. Ñaàu thaûi 11. Van xaû 12. Moài bôm 13. Loïc dung moâi 14. Ñieàu hoøa aùp suaát ngöôïc 15. Chuyeån ñoåi aùp suaát 16. Van tieâm maãu 17. Coät baûo veä + coät saéc kyù 18. Tôùi detector. Toác ñoä di chuyeån cuûa caùc chaát Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Thôøi gian löu t’ R = t R – t M Heä soá dung löôïng k’ t R = t M (1 + k’) k’: baûn chaát caùc pha, chaát tan, nhieät ñoä, ñaëc ñieåm coät 2 < k’ < 10 (coù theå chaáp nhaän ñeán 1 < k’ < 20) Heä soá choïn loïc = B löu giöõ maïnh hôn A neân > 1 1,05 < < 2,00 K K k k t t B A B A R B R A ' ' ' ' , , Diện tích pic, chiều cao pic Hình daïng pic – Söï baát ñoái cuûa pic Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Ñöôøng cong phaân boá chuaån Gaussian AC BC AF Heä soá ñoái xứng (0,8 < AF < 1,5) BC: nöûa chieàu roäng phía sau cuûa pic ñöôïc ño ôû 1/10 chieàu cao cuûa pic. AC: nöûa chieàu roäng phía tröôùc cuûa pic ñöôïc ño ôû 1/10 chieàu cao cuûa pic. Heä soá keùo ñuoâi (1/20 chieàu cao) AC BCAC As 2 Hình daïng pic – Söï baát ñoái cuûa pic Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM AC BC AF Heä soá ñoái xứng (0,8 < AF < 1,5) Hieäu löïc coät vaø soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM 2 2/1 2 54,516 W t W t H L N RR N: soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến H: chieàu cao ñóa lyù thuyeát W: chieàu roäng cuûa pic ôû ñaùy pic W 1/2 : chieàu roäng cuûa pic ño ôû nöõa chieàu cao N toát khi N gaàn baèng N max pd L N 4000max L: chieàu daøi coät (cm) d p : ñöôøng kính haït pha tónh (m) Hieäu löïc coät vaø soá ñóa lyù thuyeát biểu kiến Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Saéc kyù ñoà minh hoïa caùch tính N Söï giaõn pic (peak spreading) – môû roäng daûi (band broadening) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Hieän töôïng ñaëc bieät trong saéc kyù  Nghieân cöùu qua thuyeát veà ñóa vaø thuyeát ñoäng hoïc  Laø keát quaû di chuyeån nhanh chaäm khaùc nhau cuûa caùc phaân töû cuøng moät chaát khi qua coät  Pic ra muoän tuø hôn pic ra sôùm  Coät saéc kyù toát (hieäu löïc cao) seõ cho pic nhoïn (ít bò giaõn) Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Phöông trình Van Deemter Cu u B AH a b c e d Khueách taùn xoaùy A Khueách taùn doïc B Chuyeån khoái C Moái lieân quan cuûa H vôùi caùc yeáu toá ñoäng hoïc trong quaù trình röûa giaûi:  Khueách taùn chaát tan khi di chuyeån trong coät  Thieát laäp caân baèng theo töông taùc: chaát tan – pha ñoäng – pha tónh  Toác ñoä cuûa caùc quaù trình töông taùc dieãn ra trong coät Khắc phục A - Hạt pha tĩnh nhỏ - Cột mao quản được bao pha tỉnh ở bề mặt bên trong Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Phöông trình Van Deemter Cu u B AH Khuếch tán xoáy A Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Phöông trình Van Deemter Cu u B AH Khuếch tán dọc B Khắc phục B - Sử dụng cột sắc ký có đường kính nhỏ (Cột mao quản) Söï giaõn pic vaø lyù thuyeát ñoäng hoïc Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Phöông trình Van Deemter Cu u B AH Chuyển khối C Khắc phục C - Cột mao quản bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều - Chất mang bao một lớp pha tĩnh mỏng và đều - Tăng nhiệt độ cột giảm độ nhớt pha động và giảm quá trình chuyển khối Pha tĩnh Chất mang Söï môû roäng daûi do caùc nguyeân nhaân khaùc Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Doøng chaûy taàng H r u D ex M 2 24 H ex : yeáu toá aûnh höôûng ñeán H do nguyeân nhaân khaùc r (cm): baùn kính caùc oáng noái caùc boä phaän cuûa maùy HPLC u: toác ñoä doøng cuûa pha ñoäng D M : heä soá khueách taùn trong pha ñoäng Aûnh höôûng cuûa toác ñoä doøng leân hieäu löïc coät Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM (a) saéc kyù loûng Toác ñoä doøng (cm/s) H (mm) (b) Saéc kyù khí - loûng H (mm) Toác ñoä doøng (cm/s) Aûnh höôûng cuûa kích thöôùc haït nhoài coät Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM C u f d p d c u D uM M ( , , )2 2 Toác ñoä doøng (cm/giaây) Chieàu cao ñóa lyù thuyeát H (mm) Aûnh höôûng cuûa côõ maãu leân hieäu löïc coät Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM HETP (mm) g maãu/g chaát nhoài coät Coät Spherisorb ODS Phaân boá k’ = 4,3 Phaân boá k’ = 2,3 Haáp phuï Pha ñaûo k’ = 4,3 Pha ñaûo k’ = 2,2 Pha ñaûo k’ = 1,2 Phaân boá k’ = 1,0 Ñoä phaân giaûi Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM   R t t W W s R B R A A B 2 ( ) ( ) R s = 0,75: hai pic khoâng taùch toát, coøn xen phuû nhau nhieàu. R s = 1,0 : hai pic taùch khaù toát, coøn xen phuû nhau 4%. R s = 1,5 : hai pic taùch hoaøn toaøn (chæ xen phuû 0,3%). Moái lieân quan giöõa R s – t R – H vaø k’ Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Rs là hàm số của k’(1+k’) Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Aûnh höôûng cuûa hieäu löïc coät leân ñoä phaân giaûi t t a) b) t t a) b) Gia taêng hieäu löïc coät Aûnh höôûng cuûa hieäu löïc coät leân ñoä phaân giaûi trong tröôøng hôïp heä soá choïn loïc khoâng ñoåi (a) Hieäu löïc coät thaáp (b) Hieäu löïc coät cao Hieäu löïc coät cao vaø heä soá choïn loïc giaûm (a) Hieäu löïc coät toái ña vôùi heä soá choïn loïc thaáp (b) Gia taêng heä soá choïn loïc vaø vaãn giöõ hieäu löïc coät toái ña Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM Ñoä phaân giaûi R N k k s B B 4 1  ' ' Taêng R s : - Taêng N: baèng caùch duøng coät daøi hôn (aùp suaát, thôøi gian vaø ñoä roäng cuûa pic cuõng taêng theo) hoaëc pha tónh coù kích thöôùc haït nhoû hôn. Cuõng coù theå giaûm toác ñoä doøng pha ñoäng. - Taêng k' B : baèng caùch thay ñoåi thaønh phaàn pha ñoäng (saéc kyù loûng), nhieät ñoä (saéc kyù khí). k’ B taêng seõ taêng thôøi gian phaân tích. Ñeå dung hoøa R s vaø thôøi gian röûa giaûi : 2 < k’ B < 5. - Taêng baèng caùch thay ñoåi loaïi pha tónh hoaëc thaønh phaàn pha ñoäng, keå caû pH. Vieäc taêng coù aûnh höôûng maïnh ñeán R s . Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Ñònh tính vaø thöû tinh khieát  SKG & SKLM Vò trí caùc veát treân saéc kyù ñoà coù theå xaùc ñònh nhôø chæ soá R f (Retardation factor) R d d v V f R M 0 ===> 0 R f 1 x x dM dR 1 2 Ñöôøng dung moâi - R f = 0: chaát tan hoaøn toaøn khoâng di chuyeån, naèm taïi ñieåm xuaát phaùt - R f = 1: chaát tan di chuyeån cuøng vôùi vaän toác cuûa dung moâi - d R : khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa chaát caàn taùch - d M : khoaûng di chuyeån ñöôïc cuûa dung moâi - v: vaän toác di chuyeån cuûa chaát caàn taùch - V 0 : vaän toác di chuyeån cuûa dung moâi ÖÙng duïng cuûa saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM - Söû duïng chaát ñoái chieáu R X R X R A OX OF OA OF OX OA s f f ( ) ( ) ( ) * Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù R f vaø R s baèng nhau. * Hai chaát phaûi coù cuøng löôïng chaám nhö nhau vaø ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù x x x O X A F Saéc kyù ñoà saéc kyù ñoái chöùng ÖÙng duïng cuûa saéc kyù  SKG & SKLM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM  Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao Thôøi gian löu t R (phuùt): thôøi gian caàn thieát ñeå moät chaát di chuyeån töø nôi tieâm maãu qua coät saéc kyù, tôùi detector vaø cho peak treân saéc kyù ñoà (tính töø luùc tieâm ñeán luùc xuaát hieän ñænh cuûa peak).  t M (hoaëc t o ): thôøi gian löu cuûa moät chaát khoâng bò löu giöõ, coøn goïi laø thôøi gian cheát.  t R caøng lôùn, chaát tan bò löu giöõ caøng maïnh vaø toác ñoä di chuyeån cuûa noù caøng nhoû.  Thôøi gian löu hieäu chænh t' R ñöôïc tính theo coâng thöùc: t' R = t R - t M (hay t' R = t R - t o ) ÖÙng duïng cuûa saéc kyù Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM * Hai chaát gioáng nhau laàn löôït phaûi coù t R vaø t’ R baèng nhau * Hai chaát phaûi coù cuøng theå tích tieâm maãu nhö nhau vaø ñöôïc trieån khai trong cuøng ñieàu kieän saéc kyù Neáu treân truïc hoaønh cuûa saéc kyù ñoà söû duïng ñôn vò ño laø theå tích dung moâi: - theå tích löu V R - theå tích löu hieäu chænh V' R - theå tích cheát cuûa coät V M (theå tích roãng V o ): theå tích dung moâi töø nôi tieâm trong coät ñeán detector ÖÙng duïng cuûa saéc kyù  Saéc kyù khí vaø saéc kyù loûng hieäu naêng cao Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM ÖÙng duïng cuûa saéc kyù  Ñònh löôïng Nguyeân taéc chung: döïa treân söï so saùnh chieàu cao hoaëc dieän tích cuûa pic trong maãu thöû vôùi moät hay nhieàu maãu chuaån.  Pic heïp vaø ñoái xöùng: ño chieàu cao cuûa pic  Pic tuø hay leäch phöông: ño dieän tích cuûa pic  Phöông phaùp ñònh löôïng  Xaây döïng ñöôøng chuaån (chuaån ngoaïi nhieàu ñieåm)  So saùnh tröïc tieáp (chuaån ngoaïi 1 ñieåm)  Theâm chuaån  Noäi chuaån  Chuaån hoùa dieän tích Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM ÖÙng duïng cuûa saéc kyù  Duøng ñöôøng chuaån (chuaån ngoaïi nhieàu ñieåm)  Pha caùc dung dòch chuaån coù noàng ñoä khaùc nhau  Tieán haønh saéc kyù caùc maãu chuaån  Veõ ñöôøng chuaån ñoä bieåu dieãn söï phuï thuoäc chieàu cao hay dieän tích pic theo noàng ñoä  Tieán haønh saéc kyù maãu thöû. Döïa vaøo ñöôøng chuaån suy ra noàng ñoä maãu thöû Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM ÖÙng duïng cuûa saéc kyù  So saùnh tröïc tieáp (chuaån ngoaïi 1 ñieåm)  Phaân tích baèng chieàu cao cuûa pic: h o : Chieàu cao pic chuaån, h x : Chieàu cao pic thöû  Phaân tích baèng dieän tích pic: S o : Dieän tích pic cuûa chuaån, S x : Dieän tích pic cuûa thöû C C h h x o x o C C S S x o x o C 0 vaø C x caøng gaàn nhau keát quaû caøng chính xaùc  Phương pháp nội chuẩn  Kết quả phân tích không lặp lại khi áp dụng phương pháp ngoại chuẩn (xử lý mẫu qua nhiều giai đoạn, hàm lượng chất phân tích thấp hay thể tích tiêm mẫu không lặp lại)  Nguyên tắc  Thêm cùng hàm lượng một chất chuẩn khác (chuẩn nội) với chất cần định lượng vào mẫu thử và chuẩn  Mẫu phân tích gồm nhiều chất: chọn một trong các chất làm chuẩn nội  Tỷ số diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội là thông số được sử dụng để xây dựng đường chuẩn (S/SIS, C)  Yêu cầu của chuẩn nội  Pic của chuẩn nội phải tách khỏi pic của các thành phần khác  tR của chuẩn nội phải gần với tR của chất phân tích  Nồng độ chuẩn nội thêm vào gần bằng nồng độ chất phân tích Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng bằng HPLC  Phương pháp nội chuẩn  Độ nhạy phát hiện của chuẩn nội và chất phân tích thường khác nhau  Xác định yếu tố hiệu chỉnh Fs của chuẩn nội và chất phân tích  Sử dụng dung dịch chuẩn tinh khiết F S C S C s i s s i  Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích đỉnh Sx C S S C Fx x i i s - Cs: nồng độ của dung dịch chuẩn ngoại - Ci: nồng độ của dung dịch chuẩn nội - Ss: diện tích đỉnh của chuẩn ngoại - Si: diện tích đỉnh của chuẩn nội Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng bằng HPLC  Phương pháp thêm chuẩn  Thêm một lượng xác định chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử  Nồng độ Cx của mẫu thử có diện tích pic là Sx  Thêm C vào làm tăng S  Áp dụng khi có ảnh hưởng của chất phụ C S C S x x Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng bằng HPLC  Phương pháp qui về 100% diện tích pic  Hay áp dụng để xác định độ tinh khiết của hoạt chất  Yêu cầu  Mọi cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích đều phải được rửa giải, phát hiện và tách hoàn toàn  Sự đáp ứng của đầu dò trên các cấu tử là như nhau zyx x AAA A X 100 % - % X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z - Ax, Ay, Az: diện tích pic của cấu tử X, Y, Z Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Phương pháp định lượng bằng HPLC Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng HPLC trong KN dược liệu và HCTN Định lượng dược liệu và HCTN – Không có chất chuẩn  Áp dụng phương pháp qui về 100% diện tích (xác định độ tinh khiết sắc ký)  Yêu cầu: tất cả các chất trong mẫu thử đều phải được tách và phát hiện  Giả định: mỗi chất trong hỗn hợp tiêm vào máy HPLC cho 1 pic duy nhất  Khối lượng của chất trong mỗi pic được tìm thấy [S1/(S1 + S2 + + Sn)] x M M: tổng khối lượng chất tan trong mẫu tiêm  Ứng dụng rất hạn chế khi định lượng đa thành phần  Có thể áp dụng để định lượng gần đúng các HCTN có độ tinh khiết cao  Pic dung môi và pic chính tương ứng với chất phân tích  Tỷ lệ % của diện tích pic cho biết hàm lượng tương đối của chất  Nên sử dụng pha động làm dung môi pha mẫu thử Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ứng dụng HPLC trong KN dược liệu và HCTN Kiểm tra độ tinh khiết ginsenosid-Rg1 trước và sau khi tinh chế Cột Supelcosil LC-18 (250 x 4,6 mm; 5 µm); Pha động: MeOH – H2O (60:40); F = 0,9 ml/phút; Đầu dò PDA: 203 nm Xác định độ tinh khiết Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi lên độ phân giải 30% MeOH 40% MeOH 50% MeOH 60% MeOH 70% MeOH Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ảnh hưởng của dung môi lên độ phân giải 50% MeOH 50% H2O 32% THF 68% H2O 25% THF 17% MeOH 58% H2O Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Ảnh hưởng của pha tĩnh lên độ phân giải Cột C18 Cột cyano Cột phenyl A. cortison; B. dexamethason; C. corticosteron; D. orthonitrophenol; E. flourobenzen. Bước sóng phát hiện: 254 nm Nguyễn Đức Tuấn Đại học Y Dược TPHCM Nguyeãn Ñöùc Tuaán Ñaïi hoïc Y Döôïc TPHCM ÖÙng duïng cuûa saéc kyù  Phương pháp nội chuẩn 1. Methyl parathion 2. Ciodrin 3. Parathion 4. Dyfonat 5. Diazinon 6. EPN 7. Ronnel 8. Trithion (nội chuẩn) Thuốc bảo vệ thực vật lân hữu cơ  Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic Các dẫn chất nitro benzen