Bài giảng Công nghệ sinh học trong bệnh cây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA NÔNG HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BỆNH CÂY (Bài giảng) Biên soạn TS. Hà Viết Cường 2009 Mô tả môn học Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu: Sự đa dạng của tác nhân gây bệnh Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây Chẩn đoán tác nhân gây bệnh Phòng chống tác nhân gây bệnh Các nhóm tác nhân gây bệnh được lựa chọn là nấm/nấm trứng, vi khuẩn và virus. Các kiến thức trên sẽ được minh họa dựa trên các tác nhân gây bệnh/cây ký chủ quan trọng (hoặc là mô hình nghiên cứu phổ biến trên thế giới; hoặc có ý nghĩa kinh tế đối với Việt Nam). Mục tiêu Sinh viên có khả năng hiểu và vận dụng các kiến thức của môn học trong nghiên cứu bệnh cây đặc biệt trong chẩn đoán, nghiên cứu đa dạng và phòng chống. Học phần tiên quyết Bệnh cây đại cương (hoặc Bệnh cây Nông nghiệp) Công nghệ sinh học thực vật MỤC LỤC Giới thiệu CNSH trong bệnh cây Khái niệm về công nghệ sinh học Có rất nhiều định nghĩa về công nghệ sinh học (biotechnology) nhưng nhìn chung CNSH có thể được hiểu theo 2 nghĩa. Theo nghĩa rộng, điển hình như định nghĩa trong Công ước về Đa dạng Sinh học của Liên hiệp quốc (1992) thì CNSH là “Bất kỳ ứng dụng công nghệ sử dụng các hệ thống sinh học, các sinh vật sống hoặc các thành phần của chúng nhằm tạo ra hoặc biến đổi các sản phẩm hoặc qui trình cho một mục đích đặc biệt” “any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use”. Một cách đơn giản, CNSH là công nghệ được áp dụng trên một đối tượng sinh vật. Hiện nay, CNSH thường được hiểu theo nghĩa hẹp hơn nhiều. Nó thường được xem như các công nghệ liên quan đến sinh học phân tử chẳng hạn công nghệ AND, công nghệ chuyển gen, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào...Theo định nghĩa của FAO: CNSH là kiến thức liên quan đến khía cạnh phân tử của sinh vật và tế bào của chúng. Công nghệ sinh học trong bệnh cây Bệnh cây học (phytopathology = plant patho logy) nghiên cứu 4 lĩnh vực chính: Tác nhân gây bệnh (pathogens): nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, phân loại, di truyền, tiến hóa của tác nhân gây bệnh. Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây ký chủ (plant-pathogen interaction): nghiên cứu cơ chế tấn công của tác nhân gây bệnh và cơ chế phòng thủ của cây, hậu quả của mối tương tác này đối với cây (các biến đổi cấu trúc và chức năng của tế bào và mô cây bị bệnh). Dịch bệnh học (phytopathological epidemiology): nghiên cứu động thái phát triển của bệnh cây theo không gian và thời gian, các yếu tố của cây ký chủ, môi trường , tác nhân gây bệnh và con người ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của bệnh. Phòng chống: nghiên cứu các nguyên lý phòng chống, các biện pháp phòng chống. Công nghệ sinh học trong bệnh cây, do vậy, cũng nhằm vào 4 lĩnh vực trên. Các nghiên cứu đa dạng, tiến hóa của các nhóm tác nhân gây bệnh chủ yếu dựa vào các phân tích phân tử. Nhiều nhóm tác nhân gây bệnh, chẳng hạn virus, viroid, phytoplasma, chỉ có thể được xác định, phân loại chính xác khi phân tích bộ gen của chúng. Xác định đầy đủ thành phần, nguồn gốc, mức độ đa dạng của tác nhân gây bệnh luôn là thông tin đầu tiên và quan trọng đối với bất kỳ chiến lược phòng chống nào. Sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh và cây thường rất phức tạp với sự tham gia của nhiều gen ở cả 2 phía. Hiện nay, một công nghệ dựa trên lai phân tử gọi là công nghệ microarray (chip gen) có thể xác đinh sự biểu hiện đồng thời của hàng chục nghìn gen chỉ trên một lam kính. Trong lĩnh vực phòng chống bệnh, có vô số ví dụ cho thấy vai trò của CNSH. Các giống kháng bệnh có thể đươc tạo ra dùng 2 chiến lược chính: (i) dùng gen kháng có nguồn gốc từ cây. Đây là chiến lược áp dụng cho mọi đối tượng dịch hại. (ii) dùng gen từ tác nhân gây bệnh để tạo tính kháng (tính kháng có nguồn gốc từ bệnh). Đây là chiến lược áp dụng cho các bệnh virus. Vai trò của CNSH thể hiện ở các kỹ thuật phân lập gen kháng, thiết kế các cấu trúc chuyển gen, chuyển gen, lai tạo với sự trợ giúp của các marker phân tử. Sử dụng VSV đối kháng hoặc các sản phẩm có nguồn gốc VSV để phòng chống bệnh cũng có thể được xem là ứng dụng CNSH (theo nghĩa rộng) trong bệnh cây. Chương 1. Di truyền quần thể trong bệnh cây Mục tiêu của chương này là cung cấp các khái niệm cơ bản trong di truyền quần thể. Các khái niệm này sẽ rất cần thiết giúp sinh viên có khả năng phân tích kết quả sau khi thực hiện các thí nghiệm dựa trên công cụ CNSH khi đánh giá đa dạng của tác nhân gây bệnh cây. Sinh học quần thể của tác nhân gây bệnh Sinh học quần thể nghiên cứu các quá trình sinh học ảnh hưởng tới quần thể sinh vật. Sinh học quần thể, do vậy, cũng là một lĩnh vực nghiên cứu của bệnh cây học vì bệnh cây chỉ hình thành dưới tác động của 1 quần thể tác nhân gây bệnh. Một vết bệnh trên lá sẽ không có ý nghĩa về mặt kinh tế lẫn sinh thái. Một vụ dịch gây thiệt hại kinh tế lớn thường do vô số các sự kiện xâm nhiễm gây bệnh liên quan đến toàn thể quần thể ký sinh và ký chủ. Để phòng chống bệnh, người ta phải xây dựng các biện pháp phòng chống nhằm vào toàn bộ quần thể tác nhân gây bệnh. Như vậy, hiểu được sinh học quần thể tác nhân gây bệnh là bước quan trọng nhằm phát triển các chiến lược phòng chống bệnh hiệu quả. Một quần thể là một tập hợp các cá thể cùng loài chiếm một không gian địa lý nhất định và thể hiện sự liên tục về mặt sinh sản từ thế hệ này sang thế hệ khác. Mối tương tác sinh thái và sinh sản của các cá thể trong cùng quần thể, do vậy, phổ biến hơn so với mối tương tác của các cá thể thuộc các quần thể khác nhau. Di truyền quần thể tập trung vào quá trình dẫn tới trao đổi di truyền hay tiến hóa trong quần thể theo thời gian và không gian. Phần lớn các nghiên cứu di truyền quần thể dựa trên qui mô thời gian dài (ví dụ qua nhiều mùa vụ hoặc qua nhiều thế hệ tác nhân gây bệnh) và không gian lớn (ví dụ qui mô toàn cầu cho các đối tượng bệnh có thể phát tán xa). Di truyền quần thể giải quyết chủ yếu các các quá trình di truyền như đột biến, trôi dạt di truyền, giao lưu gen, hệ thống sinh sản/ghép cặp và chọn lọc tự nhiên. Tiến hóa Tiến hóa Tiến hóa là một quá trình gồm 2 bước. Đầu tiên là quá trình đột biến gen hoặc tái tổ hợp di truyền xảy ra và tạo nên sự đa dạng di truyền trong quần thể. Tiếp theo, các quá trình như chọn lọc hoặc trôi dạt di truyền sẽ tác động là thay đổi tần số allele trong quần thể. Tiến hóa, như vậy, hình thành từ sự thay đổi tần số allele trong quần thể. Ví dụ, khi một quần thể cây ký chủ trải qua một sự gia tăng trong tần số các allele kháng hình thành từ sự chọn lọc các cá thể kháng thì quần thể cây này đã tiến hóa lên một mức độ kháng cao hơn. Tương tự, khi một quần thể tác nhân gây bệnh không độc trải qua một sự gia tăng trong tần số allele độc nhờ quá trình chọn lọc các cá thể độc có khả năng thoát khỏi sự nhận biết của các allele kháng của cây ký chủ kháng bệnh thì người ta gọi quần thể tác nhân gây bệnh này đã tiến hóa tới một mức độ độc cao hơn. Sinh học tiến hóa: Di truyền quần thể và phả hệ trong bệnh cây Sinh học tiến hóa là một ngành nghiên cứu quá trình dẫn tới thay đổi di truyền hoặc tiến hóa của quần thể hoặc của loài. Di truyền quần thể và phả hệ học là 2 ngành phụ trong sinh học tiến hóa. Di truyền quần thể nghiên cứu các quá trình vi tiến hóa (microevolution) xảy ra trong loài nhằm giải thích sự phân bố biến dị di truyền bên trong các quần thể hoặc giữa các quần thể của cùng loài. Phả hệ học nghiên cứu các quá trình đại tiến hóa (macroevolution) xảy ra trong loài nhằm giải thích mối quan hệ phả hệ (quan hệ tổ tiên – con cháu) dẫn tới sự phân bố của loài hiện tại theo không gian và thời gian. Phả hệ học (Phylogenetics) (Đại tiến hóa = macroevolution) Biệt hóa loài (Speciation) Di truyền quần thể (Population genetics) (Vi tiến hóa = microevolution) Sinh học tiến hóa Hình 1. Mối quan hệ giữa phả hệ học và di truyền quần thể trong quá trình biệt hóa loài Bệnh cây học nghiên cứu sinh học tiến hóa vì (1) quần thể tác nhân gây bệnh thường tiến hóa nhằm phản ứng lại các biện pháp phòng chống và (2) người ta thường không rõ liệu một quần thể tác nhân gây bệnh mới hình thành và thay thế một quần thể đang tồn tại trước đó là một quần thể chuyển ký chủ hay là một loài mới hoàn toàn. Phân tích phả hệ sẽ phân biệt được các loài dựa trên mối quan hệ tổ tiên – con cháu từ các tổ tiên chung; trong khi đó di truyền quần thể xác định mối quan hệ giữa các quần thể của cùng một loài. Ranh giới giữa di truyền quần thể và phả hệ học là sự biệt hóa loài (speciation) tức là quá trình hình thành loài mới. Sự biệt hóa loài có thể xảy ra trong cùng một vùng địa lý, hoặc tại các vùng địa lý cách xa nhau hoặc tại các vùng địa lý lân cận. Sự biệt hóa loài có thể xuất hiện nhanh hơn đối với tác nhân gây bệnh cây so với các sinh vật khác do hậu quả của sự đồng tiến hóa. Phả hệ học và di truyền quần thể sử dụng các các công cụ phân tích di truyền khác nhau. Phân tích phả hệ sử dụng các đặc điểm đặc trưng cho loài nhằm xác định các đơn vị phân loại dựa trên 2 phương pháp là phương pháp phân nhánh (cladistics) và phương pháp kiểu hình (phenetics). Di truyền quần thể sử dụng các tần số allele tại các vị trí đa hình (polymorphic loci) nhằm xác định cấu trúc di truyền và ranh giới quần thể. Cả 2 lĩnh vực nghiên cứu trên đều nhằm làm sáng tỏ quá trình dẫn tới thành phần quần thể và loài hiện tại. Trong quá trình xác định nguồn gốc của các loài tác nhân gây bệnh mới, người ta có tể phải sử dụng các công cụ nghiên cứu của cả phả hệ học và di truyền quần thể. Năm lực tiến hóa (Five Evolutionary Forces) Trong hệ sinh thái nông nghiệp, chúng ta quan tâm liệu một biện pháp phòng chống (chẳng hạn dùng một gen kháng, phun một loại thuốc hóa học, áp dụng một chương trình kiểm dịch mới, luân canh cây trồng…) sẽ ảnh hưởng tới di truyền quần thể hay tiến hóa của một quần thể tác nhân gây nào đó như thế nào. Trong di truyền quần thể, nhìn chung, người ta xét 5 lực tiến hóa có ảnh hưởng tới quần thể tác nhân gây bệnh. Các lực này là: Đột biến (mutation) Trôi dạt di truyền (genetic drift) Giao lưu gen/kiểu gen (gene/genotype flow) Hệ thống sinh sản/ghép cặp (reproductive/mating type systems) Chọn lọc tự nhiên (natural selection) Nếu không có đột biến, trôi dạt di truyền, giao lưu gen/kiểu gen và chọn lọc tự nhiên thì quần thể sẽ đạt tới trạng thái cân bằng theo định luật Hardy-Wenberg. Để đơn giản, chúng ta sẽ xét chỉ một lực tiến hóa tại một thời điểm mặc dù trong tự nhiên, tất cả các lực này thường xảy ra đồng thời và tương tác với nhau để định hình cấu trúc di truyền của quần thể. Đột biến Định nghia Đột biến là 1 thay đổi trong DNA ở một locus nào đó của sinh vật. Vai trò Đột biến là một lực tiến hóa yếu để có thể làm thay đổi tần số allele nhưng là một lực tiến hóa mạnh để tạo ra một allele mới. Đột biến là nguồn chủ yếu để tạo thành các allele mới trong quần thể tác nhân gây bệnh. Do vậy, đột biến cũng cũng là nguồn chủ yếu để tạo thành các allele mới có khả năng tạo ra các kiểu gen mới của một tác nhân gây bệnh (chẳng hạn chủng mới, dạng chuyên hóa mới). Đột biến đóng một vai trò quan trọng trong tiến hóa. Nguồn chủ yếu các biến dị di truyền là đôt biến. Đột biến quan trọng vì là bước đầu tiên của tiến hóa khi nó tạo ra các trình tự DNA mới cho môt gene (tức tạo ra các allele mới). Cần chú ý là tái tổ hợp (recombination) cũng có vai trò tương tự. Đột biến có vai trò như là một lực tiến hóa vì nó có khả năng gây ra những thay đổi đáng kể trong tần số allele qua một thời gian rất lâu. Nhưng nếu đột biến là lực tiến hóa duy nhất tác động lên quần thể tác nhân gây bênh thì tốc độ tiến hóa thấp tới mức chúng ta không thể quan sát thấy được. Trong bệnh cây, chúng ta thường quan tâm nhất tới các đột biến ảnh hưởng tới tính độc của tác nhân gây bệnh hoặc tính mẫn cảm đối với thuốc hóa học. Đối với tác nhân gây bênh có mối quan hệ gene-đối-gene đối với cây thì chúng ta đặc biệt quan tâm tới các đột biến làm tác nhân gây bệnh chuyển từ tính không độc sang tính độc vì đây là các đột biến dẫn tới mất tính kháng di truyền của cây ở cả hệ sinh thái nông nhiệp và hệ sinh thái tự nhiên. Tuy nhiên các đột biến làm tác nhân gây bệnh chuyển từ trạng thái mẫn cảm thuốc sang trạng thái kháng thuốc cũng quan trọng trong hệ sinh thái nông nghiệp vì chúng ảnh hưởng tới tính thích nghi của tác nhân gây bệnh. Một mô hình đột biến đơn giản Nhằm chứng minh đột biến có thể dẫn tới thay đổi tần số allele như thế nào, hãy xét một mô hình đột biến đơn giản. Giả sử chúng ta có 2 allele ở một locus gọi là A1 và A2, trong đó A1 có thể đột biến thuận thành A2 và A2 có thể đột biến ngược thành A1. Tiếp theo, giả sử A1 đột biến thành A2 với tần số u trên một thế hệ (u là tốc độ đột biến thuận), A2 đột biến ngịch thành A1 với tần số v trên 1 thế hệ (v là tốc độ đột biến nghịch). Ở thời điểm t, tần số của allele A1 là pt và tần số allele A2 là qt. Ở mọi thế hệ, có một tỷ lệ allele A1 bị đột biến thành A2. Tỷ lệ này sẽ bằng tốc độ đột biến thuận u nhân với tần số allele A1 = up. Tương tự, ỏ mọi thế hệ cũng có một tỷ lệ allele A2 đột biến nghịch thành allele A1 và tỷ lệ này = vq. f(A1) = pt       f(A2) = qt A1 = avirulence allele, A2= virulence allele Thuận (u) A1 A2 Nghịch (v) upA1A2A1A2vq q = upt - vqt thêm mất Điều gì sẽ xảy ra với tần số allele A2 với điều kiện trên? Ở mọi thế hệ, tần số allele A2 sẽ tăng lên (up) do đột biến thuận nhưng cũng đồng thời bị giảm (vq) do đột biến nghịch. Như vậy, ở mỗi thế hệ, tổng thay đổi tần số allele A2 (Dq) = up – vq. Có thể suy ra tần số allele A2 ở thế hệ t +1 sẽ là q(t+1) = qt + q q(t+1) = qt + (upt - vqt) Ví dụ Giả sử u = 1 x 10-5 và v = 1 x 10-6 / thế hệ (đây là tốc độ đột biến thuận và nghịch điển hình). Giả sử tần số allele A1 (p) = 0.99 và tần số A2 (q) = 0.01. Vậy tần số mới của A2 là bao nhiêu sau một thế hệ đột biến? Tần số mới của allele A2 = 0.01 + [(10-5)(0.99) - (10-6)(0.01)] = 0.01 + 9.89 x 10-6 = 0.01001. Chúng ta có thể thấy rằng sự thay đổi tần số allele A2 là không đáng kể qua mỗi thế hệ. Nhìn chung, sau t thế hệ, tần số của allele A1 (wild-type) sẽ là: pt = p0(1-u)t Để tính số thế hệ cần nhằm thay đổi tần số allele với một số cho trước: t = log(pt/p0)/log(1-u) Chúng ta có thể dùng công thức trên để tính số thế hệ cần để thay đổi các tần số allele với điều kiện đột biến là lực tiến hóa duy nhất tác động lên quần thể. Để thay đổi tần số allele 1% (0.01) sẽ cần một thời gian dài. Giả sử u = 10-5 / thế hệ (đây là một tốc độ đột biến cao). Để chuyển tần số allele A1 từ 1.00 lên 0.99 (thay đổi 1%) sẽ cần 2000 thế hệ. Để chuyển tần số này từ 0.10 lên 0.09 (thay đổi 1%) sẽ cần 10,000 thế hệ. Nhìn chung, khi tần số của allele hoang dại giảm thì nó sẽ cần thời gian lâu hơn để tạo ra cùng số lượng đột biến. Mô hình này chứng tỏ rằng đột biến là lực tiến hóa rất yếu để có thể thay đổi tần số allele. Tuy nhiên, đột biến lại quan trọng trong khi tạo ra các allele mới trong quần thể. Số lượng allelle trong quần thể biến đổi theo kích thước quần thể. Tốc độ đột biến được tính theo thế hệ. Một tốc độ đột biến = 1 x 10-6 có thể có ý nghĩa là một đột biến ở một cặp gen sẽ xuất hiện một lần / 1 triệu tế bào / thế hệ hoặc cũng có thể có ý nghĩa là đột biến ở một cặp gen sẽ xuất hiện một lần / 1 triệu cặp base / thế hệ. Các đột biến chỉ có thể truyền sang thế hệ con cháu nếu xuất hiện ở các tế bào sinh sản như bào tử nấm, trứng + tinh trùng (của tuyến trùng, côn trùng), tế bào vi khuẩn hoặc phân tử virus. Một đột biến = 1 x 10-6 cũng ngụ ý rằng đột biến xuất hiện ở tần số 1 / 1 triệu cá thể của quần thể. Tốc độ đột biến they đổi theo gen và loại sinh vật, nhưng nhìn chung chúng thường thấp và có thể được xem là sự kiện hiếm trong hầu hết các trường hợp. Giả sử một đột biến có tốc độ 1 x 10-6 . Điều này có nghĩa trung bình, trong 1 quần thể 1 triệu cá thể (bào tử nấm, tế bào vi khuẩn, phân tử virus), người ta có thể hy vọng tìm được 1 đột biến trên bất kỳ một locus gen/thế hệ. Tương tự, trong 1 quần thể 10 triệu cá thể, người ta có thể hy vọng tìm thấy 10 đột biến. Đột biến trong tác nhân gây bệnh cây Lấy 1 ví dụ là nấm sương mai lúa miến (barley) Blumeria graminis f. sp. hordei. Một vết bệnh sương mai thành thục tạo ~104 bào tử /ngày. Nếu chỉ số bệnh (= % diện tích lá bị bệnh) trên một cánh đồng là 10 % thì sẽ có khqảng 105 vết bệnh / m2 và số lượng bào tử hình thành là khoảng 109 bào tử/ m2 / ngày hay 1013 bào tử/ ha/ ngày. Với một tốc độ đột biến = 10-6 tại một locus qui định tính không độc thì sẽ có khoảng 107 bào tử mang đột biến độc được tạo ra /ha/ngày. Các đột biến độc này phát tán sang các ruộng trồng giống kháng trồng cạnh đó và nhiễm trên các cây mang gen kháng và tạo ra một thế hệ con cháu mang gen độc. Quá trình này xảy ra khá phổ biến đối với nấm sương mai và gỉ sắt, và cuối cùng dẫn tới cái gọi là chu trình “đỉnh – và – đáy” (boom – and – bust). Trong chu trình này, đột biến là giai đoạn đầu tiên chủ chốt để tạo ra “đáy”. Nhìn chung, quần thể tác nhân gây bệnh lớn thường có nhiều allele hơn quần thể nhỏ vì có nhiều đột biến là nguyên liệu cho chọn lọc hoặc trôi dạt di truyền. Đây là một lý do người ta nên giữ quần thể tác nhân gây bệnh ở kích thước càng nhỏ càng tốt. Về lý thuyết, nếu kích thước quần thể là <106, người ta khó có thể tìm được nhiều allele đột biến cho bất kỳ gene nào, kể cả gene độc. Ngoài ra, kích thước quân thể lớn thường chứa nhiều allele hơn do chúng trải qua trôi dạt di truyền ít hơn. Như trình bày ở phần..., trôi dạt di truyền làm giảm số lượng allele của quần thể. Cuối cùng, sự đa dạng của các allele tại một locus sẽ bị ảnh hưởng bởi độ dài thời gian mà quần thể chiếm một vùng địa lý nào đó. Quan hàng ngàn thế hệ, nhiều đột biến sẽ được hình thành trong quần thể và một số trong các đột biến này có thể gia tăng tần số ở mức có thể phát hiện được do hậu quả của chọn lọc và trôi dạt di truyền. Cả 2 quá trình này có thể phải diễn ra trong một thời gian rất lâu để có thể tạo ra một sự gia tăng về mức độ đa dạng allele có thể lượng hóa được. Khái niệm «trung tâm đa dạng di truyền » thường được dùng để xác định trung tâm khởi nguyên của của một cây ký chủ và ký sinh của nó. Trung tâm đa dạng di truyền thường là trung tâm khởi nguyên của cả ký sinh và ký chủ và là nơi quá trình đồng tiến hóa đã xảy ra trong khoảng thời gian lâu nhất. Vì hậu quả của quá trình đồng tiến hóa, trung tâm khởi nguyên sẽ có sự đa dạng lớn nhất các allele kháng (của ký chủ) cũng như các allele độc và không độc của ký sinh. Đột biến và chiến lược tạo giống kháng Xét các ảnh hưởng của việc qui tụ các gene kháng. Nếu 2 gene kháng được đưa vào đồng thời trên một cây ký chủ thì tác nhân gây bệnh sẽ phải cần đồng thời 2 đột biến từ trạng thái không độc sang độc. Nếu giả sử tốc độ đột biến điển hình = 10-6, thì xác xuất để 2 đột biến này cùng xuất hiện trong một chủng là (10-6) x (10-6) = 10-12. Như vậy, lấy lại ví dụ về bệnh sương mai lúa miến ở trên, sẽ chỉ khoảng 10 đột biến kép có thể xảy ra mỗi ngày/ha. Nếu người ta đưa vào 3 gene kháng, thì xác suất tạo 3 đột biến đồng thời là 10-18 và sẽ chỉ có 1 cá thể mang 3 đột biến đồng thời / 105 ha cây ký chủ. Đây là lý do tại sao các nhà chọn giống thích đưa nhiều gen kháng vào một giống. Vì diện tích 106 ha là diện tích canh tác cây cốc khá phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới (?) và thường chỉ có thể cho 2-3 gene kháng nên người ta có thể hỏi tại sao tính kháng không bị bẻ gẫy nhanh chóng. Lý do là không phải tất cả các cá thể (bào tử) mang nhiều đột biến đông thời để bẻ gây tính kháng đa gene có cơ hội nhiễm trên cây kháng. Phần lớn trong số chúng sẽ rơi xuống đất, biến mất trên không khí, rơi trên cây ký chủ không phù hợp, và thậm chí nếu rơi trên cây ký chủ thích hợp thì lại gặp phải điều kiện môi trường không phù hợp cho sự nhiễm bệnh. Trôi dạt di truyền Định nghĩa Trôi dạt di truyền là 1 quá trình trong đó tần số allele của một quần thể bị thay đổi qua các thế hệ một cách hoàn toàn ngẫu nhiên. Đặc điểm Trôi dạt di truyền là một quá trình ngẫu nhiên có thể dẫn tới các thay đổi lớn về cấu trúc di truyền của quần thể trong thời gian ngắn. Trôi dạt di truyền dẫn tới cố định allele hay kiểu gene trong quần thể, làm tăng hệ số giao phối và tăng mức đồng hợp tử (homozygosity) do hâu quả của việc loại bỏ các allele. Trôi dạt di truyền có lẽ phổ biến trong các quần thể trải qua chu kỳ tuyệt chủng (extinction) và tái xuất hiện (recolonization). Điều này đặc biệt quan trọng trong hệ sinh thái tự nhiên nơi cả ký sinh và ký chủ phân bố không đều với mỗi phần là 1 quần thể nhỏ. Vì trong trôi dạt di truyền, tần số allele không thay đổi theo bất kỳ hướng xác định trước nào nên người ta còn gọi trôi dạt di truyền là trôi dạt ngẫu nhiên hay trôi dạt di truyền ngẫu nhiên. Nguyên nhân Trôi dạt di truyền có thể xảy ra do 3 nguyên nhân và chúng ta sẽ xét các nguyên nhân này theo mối quan hệ tam giác bệnh (cây ký chủ – tác nhân gây bệnh – môi trường). (1). Sự xuất hiện lại các quần thể có kích thước nhỏ. Kích thước nhỏ của quần thể tác nhân gây bệnh hình thành lại khi không có nhiều cây ký chủ trên vùng nhiễm bệnh, hoặc khi môi trường không thích hợp cho sự nhiễm bệnh. (2). Hiện tượng “thắt cổ chai” (hay là sự suy giảm mạnh kích thước quần thể). Một hiện tượng thắt cổ chai xuất hiện khi quần thể cây ký chủ bị loại bỏ (ví dụ do thu hoạch), hoặc khi môi trường thay đổi đã ngăn sự nhiễm bệnh trên cây hoặc tiêu diệt trực tiếp tác nhân gây bệnh (ví dụ thời tiết khô, nóng, băng giá…) (3). Hiệu ứng nền. Một hiệu ứng nền xuất hiện khi một số lượng nhỏ các cá thể, đại diện chỉ một phần nhỏ của tổng vốn gene của loài, bắt đầu một quần thể mới. Chẳng hạn, một hiệu ứng nền sẽ xuất hiện khi một vài cây mang mầm bệnh thoát khỏi sự kiểm tra của cơ quan kiểm dịch và hình thành một bệnh tại một nơi vốn trước đây không có bệnh. Đo trôi dạt di truyền Đối với một quần thể, mức độ trôi dạt di truyền phụ thuộc Ne . Ne là kích thước quần thể hiệu quả (effective population size) và là một quần thể lý tưởng có kích thước xác định. Quần thể lý tưởng là quần thể trong đó tất cả bố mẹ có cơ hội bằng nhau để là bố mẹ của bất kỳ con cháu nào (không có chọn lọc). Ne hiếm khi là số lượng cá thể thực sự của quần thể (N, còn gọi là kích thước dân số). Ne là một số lý thuyết trình bày số lượng cá thể khác biệt về mặt di truyền đóng góp vào sự hình thành giao tử cho thế hệ kế tiếp. Ne cũng còn được gọi là số cá thể giao phối khác biệt về di truyền của quần thể. Ne không dễ xác định vì nó bị ảnh hưởng bởi phương thức giao phối và sinh sản (tự thụ, giao phối chéo, sinh sản vô tính) và phụ thuộc vùng địa lý mà quần thể được lấy mẫu. Ne không dễ xác định đối với các tác nhân gây bệnh nấm có kiểu sinh sản vô tính và hữu tính hỗn hợp vì số lượng cá thể có thể rất lớn nhưng số kiểu gene khác nhau có trải qua tái tổ hợp hữu tính có thể tương đối nhỏ. Ví dụ một nghiên cứu về nấm Mycosphaerella graminicola gây bệnh trên lúa mỳ cho thấy Ne của nấm ít nhất gồm 70 chủng (strains) / m2 (Zhan et al., 2001). Nếu biết kích thước quần thể hiệu quả Ne, chúng ta có thể biết trôi dạt di truyền tới mức nào. Sự biến động (biểu diễn bằng phương sai Var) trong tần số allele (p) của một quần thể có trôi dạt di truyền được tính theo công thức: Var (p) = sau 1 thế hệ trôi dạt di truyền đối với sinh vật lưỡng bội Sau nhiều thế hệ trôi dạt di truyền, một cân bằng hình thành và tại điểm cân bằng, chúng ta có: Var (p) = p0q0 Trong đó p0 và q0 là tần số ban đầu của 2 alllele tại một locus. Nếu p0=q0=0.5 và Ne = 50 thì Var (p) = 0.0025 Độ lệch chuẩn SD của (p) = (0.0025)0.5 = 0.05. Độ lệch chuẩn là trung bình giá trị tuyệt đối của sai khác được kỳ vọng trong quần thể sau 1 thế hệ trôi dạt di truyền và xấp xỉ bằng thay đổi được kỳ vọng trong tần số allele (p) trong một quần thể. Do vậy trong một quần thể có 50 cá thể với 2 allele có tần số ban đầu bằng nhau thì chúng ta có thể dự đoán tần số các allele này sẽ thay đổi khoảng 5 % qua mỗi thế hệ. Mức độ thay đổi sẽ tăng khi kích thước quần thể giảm. Ví dụ Nếu p0=q0=0.5 và Ne = 5 thì Var (p) = 0.05 Độ lệch chuẩn SD của (p) = (0.05)0.5 = 0.22 Trong trường hợp này, quần thể với 5 cá thể trải qua trôi dạt di truyền sẽ có sự thay đổi tần số allele khoảng 22% qua mỗi thế hệ. Trôi dạt di truyền làm giảm đa dạng di truyền và dẫn tới phân chia quần thể Cơ hội để cố định (fix) một allele tại một locus do trôi dạt di truyền phụ thuộc kích thước quần thể hiệu quả Ne và tần số của allele đó. Một allele được cố định có nghĩa allele này có tần số = 1 (tức là tất cả các thể của quần thể có cùng allele này). Trong một quần thể có kích thước quần thể hiệu quả lớn và các allele có tần số ngang bằng thì cơ hội cho một allele trở nên được cố đinh sẽ giảm. Các allele có tần số thấp sẽ ở vị trí bất lợi trong quá trình trôi dạt di truyền vì nguy cơ bị biến mất cao hơn so với các allele có tần số cao. .Trong điều kiện trôi dạt thuần túy, xác suất cố định của một allele trong một quần thể là tần số ban đầu của nó. Nếu giả sử tần số ban đầu của một allele là 0.01 thì sẽ có 1% cơ hội để allele này được cố định trong quần thể. Hình. Xác xuất 1 allele sẽ biến mất do trôi dạt di truyền khi giả sử quần thể có 2 allele với các tần số ban đầu khác nhau và kích thước quần thể hiệu quả khác nhau. Trôi dạt di truyền có thể dẫn tới nhiều hậu quả: Dẫn tới thay đổi tần số allele Dẫn tới cố định allele do mất allele hoặc kiểu gen Dẫn tới cố định hay mất toàn bộ kiểu gen của một sinh vật sinh sản vô tính Dẫn tới tăng tính đồng hợp tử đối với sinh vật lưỡng bội và tăng hệ số tự thụ Dẫn tới tăng sự sai khác di truyền giữa các quần thể nếu không có sự giao lưu gen (gene flow) giữa chúng Trôi dạt di truyền cũng có 2 hậu quả quan trọng về mặt tiến hóa qua thời gian dài. Tạo điều kiện cho sự biệt hóa loài (tạo loài mới) bằng cách cho phép tích lũy các các đột biến không thích nghi dẫn tới tạo điều kiện phân chia quần thể Tạo điều kiện cho sự di chuyển của một quần thể từ mặt bằng thích nghi thấp lên mặt bằng thích nghi cao hơn theo lý thuyế chuyển dịch cân bằng Sewall Wright. Sự phân chia quần thể do trôi dạt di truyền sẽ tăng do các allele có trong các quần thể khác nhau sẽ bị mất một cách ngẫu nhiên. Ngoài ra, thay đổi tần số allele một cách ngẫu nhiên trong quần thể cũng sẽ xảy ra trong các quần thể khác nhau và các thay đổi ngẫu nhiên này làm các quần thể trở nên biệt hóa. Cuối cùng, nếu trôi dạt di truyền xảy ra ở các quần thể có kích thước quần thể hiệu quả nhỏ thì xác suất giao phối chéo giữa các họ hang gần gũi có xu hướng tăng dẫn tới tăng tự thụ và tiếp theo làm giảm mức dị hợp tử (heterozygosity) Trôi dạt di truyền trong tác nhân gây bệnh cây Trong hệ sinh thái nông nghiệp, các quần thể tác nhân gây bệnh thường trở nên rất lớn do hậu quả tính đồng nhất di truyền cao của quần thể cây ký chủ. Do vậy, trôi dạt di truyền có thể không đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tiến hóa của tác nhân gây bệnh trong phạm vi một diện tích canh tác nhỏ (chẳng hạn một cánh đồng của nông dân). Tuy nhiên đã có rất nhiều bằng chứng về hiệu ứng nền trong hệ sinh thái nông nghiệp. Một ví dụ điển hình là Úc. Đây là một lục địa độc lập. Trong quá trình khai phá, người châu Âu đã mang cây trồng cũng như bệnh của chúng vào lục địa này. Trong hệ sinh thái tự nhiên, trôi dạt di truyền có lẽ đóng vai trò lớn hơn trong tiến hóa của tác nhân gây bệnh vì ngoài tự nhiên, quần thể cây ký chủ đa dạng về di truyền hơn, thường có phân bố không đều nên kích thước quần thể tác nhân gây bệnh không quá lớn. Hiện tượng thắt cổ chai thường xuất hiện trong quần thể tự nhiên nhiều hơn so với hệ sinh thái nông nghiệp. (Xem thêm khái niệm siêu quần thể) Ví dụ trôi dạt di truyền trong bệnh cây Một ví dụ về trôi dạt di truyền trong bệnh cây là trường hợp nấm Puccina striiformis gây bệnh gỉ sắt dạng sọc lúa mỳ ở Úc. Thông qua các phân tích phân tử, các nhà khoa học phát hiện thấy rằng nấm này đã tới Úc vào năm 1979 bằng 1 clone từ châu Âu vì trong 2 năm 1979-1980, chỉ 1 race của nấm này được phát hiện tại Úc và giống với 1 race của Châu Âu (Steele et al. 2001). Giao lưu gene và kiểu gen (Gene and Genotype Flow) Định nghĩa. Giao lưu gene/kiểu gen (hay di cư gen/kiểu gen) là quá trình chuyển vật liệu di truyền (dưới dạng gen/kiểu gen) từ quần thể này sang quần thể khác của cùng loài. Đặc điểm Giao lưu gen là một lực ngăn cản sự đa dạng của các quần thể. Giao lưu gen phá vỡ rào cản địa lý hoặc các rào cản khác gây ra sự biệt lập quần thể. Các quần thể biệt lập, do không có trao đổi di truyền nên sẽ trở nên đa dạng do trôi dạt di truyền và chọn lọc các allele thích nghi nhất đối với ổ sinh thái của quần thể đó. Nhưng nếu giao lưu gene xuất hiện ở mức độ đủ lớn và hiệu quả thì các quần thể biệt lập sẽ trở nên không còn đa dạng về di truyền; nói cách khác chúng trở nên giống nhau và tiến hóa như một đơn vị tiến hóa duy nhất. Giao lưu gen đặc biệt quan trọng đối với tác nhân gây bệnh cây trong hệ sinh thái nông nghiệp vì nó là quá trình đưa các gen mới vào một vùng địa lý cách xa điểm xuất hiện đầu tiên của gen đó. Nó là quá trình đưa các allele độc vào một quần thể mới. Giao lưu gene do vậy có thể đưa các allele mới thay thế các allele cũ nếu các allele mới thích nghi hơn trên cây ký chủ hiện tại Giao lưu gen (gene flow) và giao lưu kiểu gen (genotype flow) Trong các quần thể tác nhân gây bệnh chỉ bao gồm một hoặc một vài dòng (chủng) đồng nhất, có thể xảy ra trường hợp giao lưu gene đặc biệt, trong đó, mỗi dòng (có kiểu gene đồng nhất) sẽ có nhiều đột biến làm nó khác với dòng ban đầu. Thực tế là nhiều gene di chuyển cùng với nhau trong các dòng vô tính nên người ta cũng quan tâm tới giao lưu kiểu gene. Giao lưu kiểu gene là sự di chuyển của toàn bộ kiểu gen từ quần thể này sang quần thể khác. Giao lưu kiểu gene chỉ xuất hiện đối với các sinh vật có kiểu sinh sản vô tính chiếm ưu thế trong vòng đời hay hoàn toàn sinh sản vô tính. Ví dụ: giao lưu kiểu gen xuất hiện khi 1 kiểu gen (clone) của nấm Fusarium oxysporum f. sp. melonis (gây bệnh héo Fusarium trên cây dưa) di chuyển từ Bắc Mỹ tới Israel qua ủng dính đất mang mầm bệnh của một nhà khoa học. Trong trường hợp này, vì nấm F. oxysporum không sinh sản hữu tính nên toàn bộ kiểu gen của nó đã được đưa vào một quần thể nấm mới. Nếu clone này có mức độ thích nghi cao, nó sẽ tồn tại được ở một vị trí mới. Đối với vi khuẩn và virus, mặc dù tái tổ hợp có thể xảy ra, nhưng do chúng sinh sản hoàn toàn vô tính nên giao lưu kiểu gene phổ biến hơn giao lưu gen. Trong khi đó, đối với nấm, do có cả sinh sản hữu tính và vô tính nên chúng có cả giao lưu gen và giao lưu kiểu gen Phân chia quần thể và giao lưu gen Sự phân chia quần thể do trôi dạt di chuyền có thể bị khắc phục nhờ giao lưu gen. Mô hình dễ nhất để xem quá trình này diễn ra thế nào là mô hình Lục địa – Đảo do Sewall Wright, một nhà di truyền quần thể, đề xuất. Hình. Mô hình lục địa – đảo về giao lưu gen Diễn giải mô hình Mô hình giả thiết giao lưu gen chỉ xảy ra một chiều từ quần thể cho (lục địa) sang quần thể nhận (đảo). Giả sử a là một allele mang đột biến độc xuất hiện tại một locus (A là allele không độc tương ứng). Giả sử tần số của allele a là f(a) = q và tần số tương ứng của A là f(A) = p. m = là tỷ lệ quần thể di cư ra đảo 1-m = tỷ lệ quần thể bản địa có sẵn trên đảo Q = Tần số allele a của quần thể di cư ra đảo qo = Tần số allele a của quần thể bản địa tiếp nhận allele a từ quần thể di cư Sau một chu kỳ giao lưu gen chúng ta có: q1 = (1-m)qo + mQ q = -m(qo - Q) Trong đó q = q1-q0 Công thức này có thể được dùng để tính tốc độ thay đổi tần số allele do giao lưu gen. Ví dụ: xét sự di chuyển giả định của một allele độc (a) của nấm gỉ sắt hại lá lúa mỳ từ Anh sang Pháp f(a) = 0.50, quần thể nấm ở Anh có tần số cao về allele độc vì hầu hết các giống lúa mỳ ở Anh có gen kháng Lr13. qo = 0.00,  m = 0.05, tốc độ di cư là cao vì một số lượng lớn bào tử đã bay từ Anh sang Pháp qua một trận bão. q = -0.05(0.00-0.50) = 0.025 q1 = 0.025 =>  ~3% của quần thể nấm tại Pháp bây giờ chứa gen độc (avrLr13) Tại điểm cân bằng (sau nhiều chu trình giao lưu gen do bào tử liên tục bay từ Anh sang Pháp), tần số allele của quần thể cho (Anh) bằng tần số allele của quần thể nhận (Pháp) qo = Q. Như vậy, tần số của allele độc (avrLr13) sẽ đạt tới 0.50 ở Pháp mặc dù các nhà chọn giống Pháp không dùng gen kháng Lr13 trong tạo giống kháng bệnh. Đây là một ví dụ giải thích tần số cao bất thường của các allele độc trong các quần thể của một số tác nhân gây bệnh khi ký chủ của nó thiếu gen kháng tương ứng. Nhiều loại mô hình đã được đề xuất phù hợp với nhiều hệ sinh thái nông nghiệp và tự nhiên khác nhau (Hình) Hình . Minh họa các mô hình giao lưu gen. A) Mô hình lục địa – đảo (Continent-island); B) Mô hình toàn đảo (Full island); C) Mô hình bắc cầu một hướng (One-dimensional stepping stone); và D) mô hình bắc cầu hai hướng (two-dimensional stepping stone). Kết quả cuối cùng của giao lưu gen là làm cho các quần thể trở nên giống nhau về mặt di truyền. Hình dưới cho thấy, các quần thể biệt lập về mặt địa lý có thể nhanh chóng hội tụ về cùng tần số allele khi các quần thể chứa 10% các các thể di cư từ nơi khác. Hình . Thay đổi tần số allele nhanh chóng qua các thế hệ của 5 quần thể có tốc độ di cư m=0.1 / thế hệ. Ví dụ giao lưu gen trong bệnh cây Có rất nhiều ví dụ về giao lưu gen trong quần thể tác nhân gây bênh qua khoảng cách xa ở qui mô vùng hoặc toàn cầu. Giao lưu gen ở qui mô toàn cầu đối với nấm mốc sương khoat tây (Phytophthora infestans). Dựa vào các kỹ thuật DNA fingerprints, Goodwin et al. (1992, 1994, 1997) đã cung cấp bằng chứng rõ ràng về sự giao lưu gen của nấm. Vụ dịch toàn cầu vào những năm 1840 làm khoảng 1.5 triệu người chết đói ở Bắc Âu là do sự di cư của một dòng nấm từ Mexico (là trung tâm khởi nguyên và đa dạng của nấm). Sau khi di chuyển tới Bắc Mỹ, nấm di chuyển tiếp sang châu Âu qua củ khoai tây bị nhiễm và tiếp theo phát tán khắp toàn cầu qua hàng hóa thương mại (khoai tây). Nấm yêu cầu 2 kiểu ghép cặp (A1 và A2) để sinh sản hữu tính. Vì chỉ có một dòng nấm thoát khỏi Mexico nên tất cả các quần thể nấm, được xác định cho tới gần đây, đều sinh sản vô tính. Bắt đầu cuối những năm 1970, các dòng nấm khác, kể cả kiểu ghép cặp còn lại “thoát khỏi” Mexico nên hiện nay mức độ đa dạng của nấm ngày càng tăng (cả về tính gây bệnh và tính kháng thuốc metalaxyl) do sinh sản hữu tính. Kiểu ghép cặp A2 đầu tiên được phát hiện thấy bên ngoài Mexico là tại Thụy Sĩ vào năm 1980. Hình Các sự kiện di cư của nấm bắt đầu từ một dòng nấm Phytophora infestans ban đầu (Goodwin 1997). Mối liên hệ giữa trôi dạt di truyền và giao lưu gen Các biến động di truyền do trôi dạt có thể được khắc phục nhờ giao lưu gen. Nếu có đủ số lượng cá thể được trao đổi giữa 2 quần thể đang trôi dạt di truyền độc lập thì các quần thể đang trôi dạt sẽ liên kết về di truyền và sự phân chia quần thể sẽ không xảy ra. Mối liên hệ này có thể được giải thích nhờ tham số Nem. Ne là kích thước quần thể hiệu quả (một phép đo của trôi dạt di truyền) và m là phần trăm của quần thể tiếp nhận nhưng chỉ bao gồm các cá thể nhập cư. Như vậy tích của 2 tham số = Nem là giá trị trung bình của các các thể nhập cư được trao đổi trong quần thể của mỗi thế hệ. Giá trị của Nem có thể được xác định dùng phép đo của phân chia quần thể gọi là FST, hay dùng các allele riêng (là các allele chỉ phát hiện trong một quần thể). Nếu Nem = 0, không có cá thể di cư nào trao đổi giữa các quần thể. Kết quả là các allele khác nhau có thể bị cố định do trôi dạt di truyền. Các quần thể trở nên khác nhau và xuất hiện phân chia quần thể. Nếu Nem >1, trung bình có 1 hoặc nhiều cá thể trao đổi giữa các quần thể qua mỗi thế hệ, do vậy quần thể sẽ không phân hóa bởi trôi dạt di truyền và chúng sẽ dần trở nên giống nhau. Rất ít giao lưu gen cần để chống lại trôi dạt di truyền Nếu Nem = 1, các ảnh hưởng của trôi dạt bị cân bằng lại chính xác bằng ảnh hưởng của giao lưu gen, quần thể sẽ không phân hóa cũng như không hội tụ Có thể minh họa nguyên lý trên qua ví dụ sau: Giả sử p = q = 0.5 (có nghĩa 2 allele tại một locus có mặt ở tần số bằng nhau). Với Ne = 10, ảnh hưởng của trôi dạt lớn: Var(p) = 0.0125 (s.e. 0.11). Trong quần thể này, một cá thể nhập cư (Nem = 1) tương ứng m = 0.10; Do vậy, 10 % quần thể là gồm các cá thể nhập cư. Để chống lại Ne nhỏ thì m phải tương đối lớn. Với Ne = 10,000, ảnh hưởng của trôi dạt là nhỏ: Var(p) = 0.0000125 (s.e. 0.0035). Trong quần thể này, một cá thể nhập cư (Nem = 1) tương ứng với m = 0.0001; do vậy 1 % quần thể là bao gồm các cá thể nhập cư. Để chống lại một Ne lớn thì chỉ cần m nhỏ. Khái niệm siêu quần thể và tác nhân gây bệnh Một siêu quần thể (metapopulation) là 1 tập hợp các quần thể địa phương liên hệ với nhau bởi sự di cư của các cá thể. Các quần thể địa phương có thể trải qua các chu trình diệt vong và tái phục hồi; trái lại siêu quần thể có thể tương đối ổn định. Một siêu quần thể là một quần thể của các quần thể. Để hiểu được siêu quần thể, cần nhớ rằng các quần thể thực sự chưa bao giờ cân bằng (ngoại trừ trong các mô hình toán). Do vậy chúng ta có thể xem một loài là một tập hợp các quần thể nhỏ chưa bao giờ cân bằng. Các mô hình siêu quần thể có thể giúp giải thích các tác nhân gây bệnh đã tiến hóa như thế nào trong hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt đối với các tác nhân gây bệnh nhóm biotroph – nhóm chỉ gây hại và tồn tại trên mô ký chủ sống. Trong hệ sinh thái nông nghiệp, một ổ sinh thái mới có thể hình thành đối với một tác nhân gây bệnh khi cánh đồng được trồng với một cây ký chủ mẫn cảm. Hiệu ứng nền xảy ra khi tác nhân gây bệnh gặp cây ký chủ mẫn cảm và phát triển số lượng. Ổ sinh thái này bị loại bỏ khi cây được thu hoạch. Sau khi cây ký chủ bị loại bỏ, tác nhân gây bệnh có thể bị diệt vong (tuyệt chủng) hoặc trải qua quá trình thắt cổ chai. Mô hình siêu quần thể nhìn chung không áp dụng cho các nhóm tác nhân gây bệnh luôn tạo ra các cấu trúc (dạng bảo tồn) lâu dài, có thể tồn tại qua đông hoặc chuyển vụ ngay tại chỗ. Một ví dụ rất tốt về mô hình siêu quần thể là mô hình bệnh gỉ sắt cây cốc (lúa mỳ, lúa miến và yến mạch (wheat, barley, and oats) hàng năm theo đường hướng Puccinia "Puccinia pathway" ở Bắc Mỹ.  Hình. Minh họa đường hướng puccinia của nấm gỉ sắt cây cốc ở Bắc Mỹ. Bào tử nấm gỉ sắt di chuyển lên phía bắc vào mùa xuân và mùa hè (mũi tên đen) và di chuyển lại xuống phía nam vào mùa thu (mũi tên đỏ) theo hướng gió Do việc loại bỏ cây ký chủ phụ là barberry nên giai đoạn qua đông chuyển vụ của nấm gỉ sắt thân lúa mỳ (Puccinia graminis f. sp. tritici ) không tồn tại trong vùng. Nhiều loài nấm gỉ sắt lại qua đông ở các bang miền nam như Texas hoặc ở Mexico. Bào tử sẽ theo gió di chuyển lên phía Bắc theo sự phát triển của cây cốc và tới Canada vào mùa hè - đúng lúc để xâm nhiễm trên cây cốc đã được trồng vào mùa xuân. Vào mùa thu, khi cây cốc được thu hoạch ở Canada và các bang Bắc mỹ thì bào từ nấm lại di chuyển xuống phương nam nhờ gió và nhiễm trên tàn dư cây cốc trên đồng ruộng. Mùa đông lạnh ở phương Bắc đảm bảo chắc chắn rằng không một bào tử nấm nào có thể tồn tại để bắt đầu một vụ dịch mới trong năm tiếp theo. Như vậy quần thể nấm địa phương miền bắc sẽ tuyệt chủng trong mùa đông nhưng cây cốc vụ tới vẫn bị xâm nhiễm bởi các bào tử di cư từ miền nam tới trong mùa hè. Hình dung một loạt các cánh đồng cây cốc của nông dân dọc theo “Puccinia pathway”. Cây cốc trên các cánh đồng này bị nhiễm bởi bào tử hạ của nấm. Các bào tử này có thể tới từ các cánh đồng cách xa (chẳng hạn từ miền nam USA hoặc Mexico) hay từ các cánh đồng lân cận. Trên mỗi cánh đồng, quần thể nấm địa phương có thể tuyệt chủng do: thu hoạch, phun thuốc hóa học, luân canh với cây – phi ký chủ, trồng giống kháng, điều kiện khắc nghiệt của một mùa đông lạnh. Sau khi sự tuyệt chủng xuất hiện, các cánh đồng này lại tái nhiễm khi nông dân trồng một vụ lua mỳ mới. Nguồn bệnh sơ cấp khởi đầu một sự nhiễm bệnh mới trên mỗi cánh đồng có thể tới từ các cánh đồng cách rất xa hoặc từ các cánh đồng lân cận. Như vậy các quần thể nấm địa phương dọc đường hướng này luôn trải qua qua trình diệt vong và tái xuất hiện nhưng toàn bộ quần thể nấm ở vùng Bắc Mỹ (siêu quần thể) vẫn ổn định. Hệ thống sinh sản/ghép cặp (Reproductive/Mating Systems) Đánh giá cấu trúc di truyền trong quần thể Trôi dạt di truyền, đột biến, di cư (giao lưu), chọn lọc và các lực khác làm thay đổi tần số gen của một quần thể phụ và ảnh hưởng tới cấu trúc di truyền của toàn quần thể. Để đánh giá cấu trúc di truyền của quần thể, người ta thường sử dụng chỉ số sai khác di truyền (index of genetic differenciation) hay còn gọi là chỉ số cố định F (fixation index). Chỉ số này cũng được ký hiệu là FST. Có nhiều cách diễn giải chỉ số sai khác di truyền thông qua các công thức tính. Cách diễn giải 1. Về mặt toán học, FST là xác suất mà 2 allele của một cặp gen trong một cá thể lưỡng bội giống nhau, có nghĩa chúng có nguồn gốc từ một tổ tiên chung trong các thế hệ trước. FST là phép đo sự sai khác (differentiation) của quần thể dựa trên các số liệu đa hình di truyền (genetic polymorphism), chẳng hạn như đa hình nucleotid đơn (Single nucleotide polymorphisms (SNPs) hay đa hình microsatellites. Nó là một trường hợp đặc biệt của thống kê F. Thống kê F so sánh sự sai khác di truyền bên trong quần thể và giữa các quần thể. FST được tính như sau: Trong đó ΠBetween và ΠWithin trình bày số sai khác trung bình giữa 2 cá thể được lấy từ các quần thể khác nhau (ΠBetween) hay được lấy từ cùng quần thể (ΠWithin). Số sai khác trung bình giữa 2 cá thể trong cùng quần thể là tổng số sai khác giữa từng cặp cá thể chia cho tổng số cặp so sánh. Chú ý là giá thị ΠWithin nên được tính cho mỗi quần thể sau đó lấy trung bình. Cách diễn giải 2. FST là tỷ lệ lượng dị hợp tử (HS) trong các quần thể phụ trên lượng dị hợp tử kỳ vọng của toàn quần thể (HT) và được tính theo công thức FST = (HT – HS ) / HT = 1 – (HS / HT) Trong công thức này, HT là số lượng dị hợp tử (Heterozygote) kỳ vọng của toàn thể quần thể (Total population). HS là số lượng dị hợp tử (Heterozygote) quan sát trong quần thể phụ (Subpopulation). Có thể minh họa cách diễn giải này bằng hình sau. Quần thể (HT) Quần thể phụ 2 HS<HT Quần thể phụ 1 HS<HT Quần thể phụ 4 HS<HT Quần thể phụ 3 HS<HT Cách diễn giải 3. Cách diễn 3 cũng tương tự cách diễn giải 2 nhưng thay vì dùng khái niệm quần thể, ngườ ta dùng khái niệm locus với công thức tính như sau: FST = 1 – (Hobs / Hexp) Trong công thức này, Hobs là mức dị hợp tử trung bình quan sát thấy (observated) / locus và Hexp là tỷ lệ dị hợp tử kỳ vọng khi giả thiết quần thể giao phối ngẫu nhiên (Hexp tương tự như mức đa dạng gen của Nei, xem phần ) Dưới điều kiện tự thụ hoàn toàn, Hobs sẽ ~ 0 và FST sẽ ~ 1. Dưới điều kiện giao phối ngẫu nhiên, Hobs sẽ ~ Hexp và F sẽ ~ 0. Giá trị FST nằm giữa 0 và 1 cho biết các mức tự thụ khác nhau. Giá trị FST <0 cho biết các cá thể dị hợp tử chiếm ưu thế do giao phối không tương hợp di truyền hoặc do sự chiếm ưu thế của các dòng dị hợp tử đặc biệt thích nghi. Hệ thống sinh sản và ghép cặp của các tác nhân gây bệnh cây Tác nhân gây bệnh có thể sinh sản vô tính (bằng nguyên nhiễm) hoặc hữu tính (bằng giảm nhiễm) hoặc hỗn hợp cả sinh sản vô tính lẫn hữu tính. Vi khuẩn và virus có kiểu sinh sản vô tính. Nấm và VSV giống nấm có kiểu sinh sản hoặc vô tính, hoặc hữu tính hoặc hỗn hợp cả hai. Hệ thống ghép cặp (mating systems) chỉ thích hợp đối với các sinh vật có trải qua sinh sản hữu tính. Hệ thống ghép cặp có thể nằm trong phạm vi từ 100% tự thụ tới 100% giao phối chéo. Ví dụ nấm Phytophthora có sinh sản hữu tính, tuy nhiên có loài lại sinh sản hữu tính kiểu tự thụ (đồng tản), có loài lại sinh sản hữu tính kiểu giao phối chéo (dị tản) (bảng ). Hệ thống ghép cặp và sinh sản có ảnh hưởng đến cách các allele của cá thể kết hợp với nhau. Các sinh vật giao phối chéo tạo ra các tổ hợp gen mới một cách nhanh chóng dẫn tới có nhiều kiểu gen trong quần thể và cũng tạo ra mức độ đa dạng kiểu gen cao; hậu quả chúng có khả năng thích ứng tốt với sự thay đổi môi trường. Nếu một sinh vật có kiêu giao phối chéo bắt buộc thì việc tái tổ hợp thường xuyên có thể phá vỡ các tổ hợp allele đã cùng thích nghi. Điều này có thể là bất lợi đối với tác nhân gây bệnh nếu môi trường ổn định. Tác nhân gây bệnh tự thụ hoặc trải qua sinh sản vô tính có xu hướng giữ lại các tổ hợp gen cũ dẫn tới mức đa dạng di truyền giảm. Nếu một kiểu gen đã thích nghi tốt (chứa 1 tổ hợp các allele đã đồng thích nghi) thì tác nhân gây bệnh tự thụ hoặc sinh sản vô tính có xu hướng giữ lại các tổ hợp này trong thời gian lâu. Tuy nhiên, nếu môi trường thay đổi nhanh thì các sinh vật này phải mất thời gian lâu hơn để có được các tổ hợp allele mới cho phép chúng thích ứng với điều kiện môi trường mới. Các tác nhân có kiểu sinh sản/ghép căp hỗn hợp chứa cả ưu và nhược điểm của mỗi kiểu. Nấm đặc biệt mềm dẻo khi xét tới các kiểu sinh ghép cặp và sinh sản. Vi khuẩn và virus có thể tái tổ hợp không cần giảm nhiễm nhưng hệ thống sinh sản của chúng hoàn là vô tính Hệ thống ghép căp (Mating systems) thường được định nghĩa là lượng tự phối xuất hiện trong quần thể các sinh vật sinh sản hữu tính và được đánh giá bằng hệ số tự phối (inbreeding coefficient) thường được viết tắt là F (hay chỉ số cố định Fixation index = FST) FST = 1 FST = 0 FST = -1 Sinh sản vô tính Hữu tính: tự thụ Đa dạng kiểu gen thấp Chủ yếu các dòng Sinh sản hữu tính Giao phối (không tương hợp) Đa dạng kiểu gen cao Không có các dòng riêng biệt Sinh sản hỗn hợp Đa dạng kiểu gen trung gian Hình . Phạm vi sinh sản của tác nhân gây bệnh và ảnh hưởng có thể của kiểu sinh sản đến mức độ thuần nhất/đa dạng di truyền trong quần thể Khi FST = 1, chúng ta có kiểu ghép cặp tương hợp di truyền (genetic assortative mating). Các sinh vật có kiểu ghép cặp tương hợp di truyền có xu hướng ghép cặp giữa các cá thể có các allele giống nhau, như các họ hàng gần. Ví dụ về kiểu ghép cặp cực kỳ tương hợp di truyền là sự tự phối ở nhiều loài cây tự thụ. Đối với các cây tự phối nghiêm ngặt, FST =1. Một số tác nhân gây bệnh cũng có kiểu ghép cặp tương hợp di truyền. Một ví dụ là các loài nấm Phytophthoa nhóm đồng tản có nghĩa là tự thụ (bảng ). Kết quả của sự ghép cặp tương hợp di truyền là một quần thể có cấu trúc di truyền được đặc trưng bởi sự chiếm ưu thế của các cá thể đồng hợp tử và có mức đa dạng kiểu gen thấp. Nhiều chu kỳ tự phối sẽ tạo ra các dòng thuần nhất (clonal lines) trong các quần thể này. Ngược với kiểu ghép cặp tương hợp di truyền là kiểu ghép cặp không tương hợp di truyền. Các sinh vật có kiểu ghép cặp không tương hợp di truyền có xu hướng ghép cặp giữa các cá thể không có các allele giống nhau, có nghĩa chúng không có tổ tiên chung. Một ví dụ về kiểu ghép cặp cực kỳ không tương hợp di truyền là sự giao phối chéo bắt buộc ở các cây giao phấn và nhiều loài nấm. Ví dụ, môt số nấm đảm như Armillaria spp. có hệ thống ghép cặp tứ cực (tetrapolar) không cho phép chúng tự thụ. Hậu quả của sự ghép cặp không tương hợp di truyền là tạo ra các quần thể có cấu trúc di truyền gồm các các thể di hợp tử chiếm ưu thế và mức độ đa dạng kiểu gen cao. Ở dạng trung gian, chúng ta có kiểu ghép cặp ngẫu nhiên (random mating). Các sinh vật có kiểu ghép cặp ngẫu nhiên có xu hướng ghép cặp ngẫu nhiên với các cá thể khác trong quần thể (môt ví dụ điển hình là loài người). Kết quả của ghép cặp ngẫu nhiên là cân bằng di truyền theo định luật Hardy-Weinberg. Tần số đồng hợp tử và dị hợp tử quan sát thấy đối với bất kỳ locus cũng phù hợp với tần số tiên đoán với giả thiết là giao tử kết hợp một cách ngẫu nhiên để thành hợp tử. Hậu quả nữa của ghép cặp ngẫu nhiên là sư kết hợp ngẫu nhiên trong số các allele tại các locus khác nhau ở các sinh vật đơn bội, một trạng thái được gọi là cân bằng giao tử (gametic equilibrium). Hệ thống ghép cặp đã được nghiên cứu đối với nhiều tác nhân gây bệnh nấm. Đối với các loại nấm lưỡng bội như nấm Phytophthora, hệ thống ghép cặp xắp xếp từ tự phối (các loài đồng tản) tới giao phối chéo (các loài dị tản) với chỉ số cố định FST nằm trong phạm vi từ 1.0 tới -0.82 (Bảng). Đối với các tác nhân gây bệnh đơn bội, người ta không thể áp dụng định luật Hardy-Weinberg để đo cân bằng mà phải áp dụng cân bằng giao tử (gametic equilibrium). Nhiều loại nấm túi (ví dụ nấm đạo ôn Pyricularia oryzae) thuộc nhóm này. Các quần thể ghép cặp ngẫu nhiên thường có mức độ đa dạng kiểu gen cao. Tuy nhiên, nếu mức độ đa dạng gen trong quần thể thấp (chẳng hạn như đối với các quần thể bắt đầu từ một số lượng nhỏ cá thể = hiệu ứng nền) thì đa dạng kiểu gen cũng vẫn có thể thấp. Bảng. Chỉ số cố định của các loài Phytophthora (Goodwin, 1997) Loài Kích thước mẫu Số locus Lượng dị hợp tử FST Quan sát Kỳ vọng Các loài đồng tản P. boehmeriae 11 12 0.015 0.32 0.95 P. cactorum 47 18 0.056 0.037 -0.51 P. citricola 125 14 0.007 0.279 0.97 P. heveae 14 17 0.05 0.16 0.69 P. katsurae 16 17 0.00 0.11 1.0 P. sojae 48 15 0.00 — 1.0 Các loài dị tản P. botryosa 10 18 0.006 0.08 0.93 P. cambivora 25 18 0.060 0.071 0.15 P. capsici 84 18 0.019 0.20 0.91 P. cinnamomi Worldwide 81 18 0.098 0.134 0.27 Australia 165 20 0.010 0.049 0.80 Australia 280 19 0.051 0.115 0.56 PNG 18 20 0.058 0.088 0.34 P. citrophthora 43 18 0.107 0.20 0.47 P. infestans Tại Mexico 50 15 0.037 0.046 0.20 Bên ngoài 46 15 0.120 0.066 -0.82 P. meadii 33 18 0.066 0.12 0.45 P. megakarya 15 17 0.078 0.19 0.59 P. palmivora Worldwide 106 17 0.111 0.08 -0.39 East Asia 62 17 0.135 0.122 -0.11 P. parasitica 60 19 0.079 0.11 0.28 Đa dạng gen và đa dạng kiểu gen Đa dạng di truyền gồm 2 thành phần là đa dạng gen và đa dạng kiểu gen. Đa dạng gen Đa dạng gen ám chỉ sự đa dạng về các allele của 1 gen hoặc locus nào đó trên 1 nhiễm sắc thể. Đa dạng gen có được là do sự khác nhau về trình tự DNA. Để đo đa dạng gen, tốt nhất là dùng các marker di truyền trung tính đa allele như isozymes, RFLPs, microsatellites, hoặc single nucleotide polymorphisms (SNPs). Tuy nhiên, đa dạng gen cũng có thể được đánh giá dùng các marker trội như AFLP. Lượng hóa đa dạng gen được dựa trên số lượng và tần số allele của một locus. Mức độ đa dạng sẽ tăng khi số lượng allele (tại 1 locus) tăng và khi tần số các allele phân bố đồng đều. Đa dạng gen bị ảnh hưởng của marker di truyền dùng để kiểm tra (các marker trung tính sẽ cho mức độ đa dạng cao hơn các marker chọn lọc), kích thước quần thể (quần thể càng lớn càng ít bị trôi dạt di truyền và có nhiều allele hơn), và tuổi quần thể (quần thể càng già càng có nhiều thời gian cho đột biến xảy ra và cho trôi dạt di truyền gia tăng tần số các đột biến trung tính). Phép đo đa dạng gen phổ biến nhất là do Nei (1973) đề xuất với công thức sau: h = 1- xj2 Trong đó, h là mức đa dạng gen tại một locus và xj là tần số allele thứ j tại locus đó. Đối với quần thể lưỡng bội đạt được cân bằng Hardy-Weinberg thì mức độ đa dạng gen bằng tần số dị hợp tử tại một locus kỳ vọng đạt được. Do vậy, mức độ đa dạng gen của quần thể lưỡng bội còn được gọi là mức dị hợp tử (heterozygosity). Mức độ đa dạng gen của Nei là xác suất để 2 phiên bản (copy) của cùng một gen được chọn ngẫu nhiên trong quần thể là 2 allele khác nhau. Hai copy này nên được chọn từ cùng cá thể lưỡng bội (trường hợp này là đo heterozygosity) hay từ 2 cá thể đơn bội khác nhau (trường hợp này là đo đa dạng gen). Đa dạng kiểu gen Đa dạng kiểu gen ám chỉ sự đa dạng về sự kết hợp của nhiều allele xuất hiện ở tất cả các locus được thử. Nói cách khác, đa dạng kiểu gen dựa trên số các cá thể khác biệt về di truyền trong 1 quần thể và tần số của nó. Đo đa dạng kiểu gen là vô nghĩa đối với các sinh vật chỉ có giao phối ngẫu nhiên (ví dụ như loài người) vì mỗi cá thể của chúng (ngoại trừ trường hợp sinh đôi) hoàn toàn khác nhau về di truyền, do đó đa dạng kiểu gen luôn luôn ở mức tối đa. Tuy nhiên, đa dạng kiểu gen lại rất quan trọng đối với tác nhân gây bệnh sinh sản vô tính hoặc sinh sản hỗn hợp. Đa dạng kiểu gen thường được đo dùng các kỹ thuật DNA fingerprinting (như AFLP) hoặc dùng các marker đa locus (như rep-PCR, RFLP dùng dò đa locus) đối với mỗi cá thể trong quần thể. Mức độ đa dạng kiểu gen được đo dựa trên số lượng và tần số các kiểu gen trong quần thể. Mức độ đa dạng tăng khi số lượng kiểu gen tăng và tần số kiểu gen phân bố đồng đều trong quần thể. Đa dạng kiểu gen bị ảnh hưởng bởi hệ thống ghép cặp (quần thể tự thụ có mức độ đa dạng kiểu gen thấp hơn quần thể giao phối), hệ thống sinh sản (sinh vật sinh sản hữu tính có mức độ đa dạng kiểu gen cao hơn sinh vật sinh sản vô tính) và chọn lọc. Nếu 1 hoặc 2 dòng tác nhân gây bệnh gia tăng tần số so với các dòng khác trên 1 cánh đồng do chọn lọc thì mức đa dạng kiểu gen chung trong quần thể sẽ giảm. Như vậy kiểu ghép cặp và sinh sản có tác động đáng kể đến đa dạng kiểu gen nhưng không nhất thiết có tác động lên đa dạng gen. Điều này có thể được minh họa qua 1 ví dụ dưới đây. Ví dụ đo đa dạng gen và đa dạng kiểu gen Đo đa dạng gen và đa dạng kiểu gen nên dựa trên kích thước mẫu gồm ít nhất 30 cá thể / quần thể. Để đơn giản hóa, ví dụ dưới đây chỉ gồm 8 cá thể /quần thể với 3 loci. Xét 2 quần thể đơn bội (điển hình cho phần lớn nấm, vi khuẩn gây bệnh cây) với 3 locus, mỗi locus gồm 2 allele. Locus A có 2 allele, A1 và A2. Locus B có 2 allele, B1 và B2. Locus C có 2 allele C1 và C2. Pop. 1 Pop. 2 A1 B1 C1A1 B1 C2A1 B2 C1A1 B2 C2A2 B1 C1A2 B1 C2A2 B2 C1A2 B2 C2 A2 B1 C2A2 B1 C2A2 B1 C2A2 B1 C2A1 B2 C1A1 B2 C1A1 B2 C1A1 B2 C1 8 genotypes 2 genotypes f(A1) = f(A2) = 0.5f(B1) = f(B2) = 0.5f(C1) = f(C2) = 0.5 f(A1) = f(A2) = 0.5f(B1) = f(B2) = 0.5f(C1) = f(C2) = 0.5 Trong trường hợp này, 2 quần thể đồng nhất về đa dạng gen vì mỗi quần thể có cùng số lượng allele với cùng tần xuất. Dùng công thức của Nei, chúng ta tính được đa dạng gen là 0.5 cho tất cả 3 locus ở cả 2 quần thể. Tuy nhiên đa dạng kiểu gen khác nhau đáng kể giữa 2 quần thể vì quần thể 1 có tổng số 8 kiểu gen và quần thể 2 có tổng số 2 kiểu gen. Các quần thể tác nhân gây bệnh sinh sản hữu tính thường xuyên xắp sếp lại kiểu gen của chúng dẫn tới các allele độc và các allele kháng thuốc có thể kết hợp lại với nhau nhanh chóng hơn (như ở quần thể 1). Các quần thể tác nhân gây bệnh sinh sản vô tính có thể có mức độ đa dạng gen cao như ở quần thể hữu tính nhưng mức độ đa dạng của các allele được phân bố trong các dòng vô tính của chúng thay vì trong các cá thể. Nói cách khác, chúng có mức độ đa dạng kiểu gen thấp hơn (như ở quần thể 2). Các marker di truyền trội dựa trên PCR như AFLP và RAPD (chỉ có 2 allele /locus) có mức đa dạng gen tối đa = 0.50 khi cả 2 allele có tần số tươg đương. Do vậy, sẽ không thích hợp khi so sánh đa dạng di truyền của các tác nhân gây bệnh khác nhau nếu phương pháp đánh giá khác nhau (vd RFLPs và AFLPs). Lợi thế của các kỹ thuật đánh giá đa allele như RFLPs, microsatellites, hoặc SNPs là ở chỗ chúng có thể tiến gần tới giá trị đa dạng gen tối đa lý thuyết =1 (bảng) và có thể cung cấp các thông tin bổ sung về đa dạng gen vì sự có mặt của các allele hiếm (rare allele) hoặc các allele riêng (private allele). Các allele hiếm và allele riêng có thể được sử dụng để xác định trung tâm đa dạng của tác nhân gây bệnh và để đánh giá sự di chuyển của các quần thể tác nhân gây bệnh theo không gian và thời gian. Tuy nhiên, các allele hiếm chỉ có thể đóng góp ít vào mức đa dạng gen chung (bảng)., Bảng Thay đổi mức đa dạng gen (h) theo số allele Số alleles h tối đa 2 0.50 3 0.67 4 0.75 5 0.80 6 0.83 7 0.86 Bảng Đa dạng gene theo tần số của 2 hay 3 allele. Chú ý h đạt tối đa với 3 allele = 0.67; h giảm mạnh khi allele chung nhất có tần số = 90% (vd allele 2) Quần thể Tần số allele 1 Tần số allele 2 Tần số allele 3 Nei's h 1 0.50 0.50 0.00 0.50 2 0.40 0.60 0.00 0.48 3 0.30 0.70 0.00 0.42 4 0.20 0.80 0.00 0.32 5 0.10 0.90 0.00 0.18 6 0.01 0.99 0.00 0.02 7 0.02 0.96 0.02 0.08 8 0.05 0.90 0.05 0.19 9 0.33 0.34 0.33 0.67 Chọn lọc tự nhiên Khái niệm Chọn lọc là một quá trình có định hướng dẫn tới tăng hoặc giảm tần số gen hay tần số kiểu gen. Chọn lọc xuất hiện nhằm phản ứng lại một yếu tố môi trường đặc biệt nào đó. Hậu quả của chọn lọc lên cấu trúc và tiến hóa của sinh vật là phức tạp. Chọn lọc có thể làm giảm biến dị di truyền trong quần thể sinh vật bằng giữ lại hoặc loại bỏ 1 gen hoặc 1 tổ hợp gen đặc biệt nào đó (chọn lọc có định hướng). Chọn lọc có thể làm tăng biến dị di truyền trong quần thể nhờ giữ lại nhiều gen hoặc tổ hợp gen đặc biệt nào đó và loại bỏ các dạng trung gian (chọn lọc ngắt quãng, chọn lọc cân bằng). Chọn lọc có thể dẫn tới biệt hóa loài nhờ tích lũy các biến dị di truyền thích nghi trong quần thể biệt lập về sinh sản. Chọn lọc có thể ngăn sự biệt hóa loài bằng cách đồng nhất cấu trúc di truyền của các quần thể tại các địa điểm khác nhau. Chọn lọc trong bệnh cây chủ yếu được xét trong phạm vi quá trình đồng tiến hóa gen-đối gen. Nó là quá trình làm tăng tần số allene kháng trong hệ sinh thái tự nhiên thông qua quá trình đồng tiến hóa, làm tăng tần số allele độc trong hệ sinh thái nông nghiệp qua chu trình “đỉnh – đáy” Hai mô hình chọn lọc Một câu hỏi quan trọng trong di truyền quần thể là biến dị di truyền lớn tới mức nào để có thể tồn tại trong 1 quần thể hay 1 loài. Có 2 mô hình chọn lọc các biến dị di truyền có thể trả lời câu hỏi này là mô hình cân bằng và mô hình trung tính. Mô hình cân bằng. Theo mô hình này, không có 1 allele nào là tốt nhất tại bất kỳ một locus nào mà thay vào đó bể gen của quần thể chứa một số lượng lớn các các allele khác nhau và có tần số khác nhau tại một locus. Do không có một allele nào tốt nhất nên các cá thể dị hơp tử trong 1 quần thể sẽ có ưu thế thích nghi hơn các cá thể đồng hợp tử. Đặc điểm này được gọi là siêu trội (overdominance). Theo mô hình cân bằng, quần thể sẽ có nhiều biến dị di truyền, và hầu hết cá thể là dị hợp tử tại một số lượng lớn loci. Tiến hóa trong các quần thể này xảy ra do sự thay đổi dần dần tần số allele hay tổ hợp allele thích nghi với điều kiện môi trường. Mô hình trung tính. Theo mô hình này, phần lớn các biến dị di truyền không có ảnh hưởng lên sự thích nghi. Đa số các đột biến là gây chết và nhanh chóng bị loại bỏ bởi chọn lọc nhưng các đột biến còn lại là trung tính hoặc gần trung tính nên tồn tại được trong bể gen của quần thể. Đột biến trung tính sẽ dẫn tới sự đa dạng mà ta có thể quan sát thấy ở mức protein hay DNA. Như vậy, mô hình trung tính tương phản với mô hình cân bằng ở chỗ mô hình cân bằng cho rằng mức độ biến dị di truyền cao, nhìn chung, sẽ làm tăng tính thích nghi của quần thể có lẽ do nó tạo ra một khả năng đêm (buffering) cho quần thể trước những thay đổi đột ngột của môi trường hay do nó tạo ra sự siêu trội (dị hợp tử có lợi thế thích nghi cao hơn đồng hợp tử).   Tương tác giữa các lực tiến hóa và cấu trúc di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh Hậu quả cuối cùng của sự tương tác giữa các lực tiến hóa là cấu trúc di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh. Cấu trúc di truyền có thể được xem như số lượng và phân bố của biến di di truyền bên trong và giữa các quần thể được hình thành do tổng ảnh hưởng (có sự tương tác) của tất cả các lực tiến hóa tác động lên quần thể theo thời gian. Các tương tác giữa các lực tiến hóa bao gồm Tương tác giữa đột biến và chọn lọc Tương tác giữa tái tổ hợp và chọn lọc Tương tác giữa trôi dạt di truyền, giao lưu gen và chọn lọc Tương tác giữa chọn lọc và giao lưu gen Tương tác giữa tái tổ hợp và giao lưu gen Tương tác giữa đột biến và chọn lọc Mặc dù nhiều lực có thể tương tác để xác định sự tiến hóa của quần thể thì tương tác giữa đột biến và chọn lọc được xem là quan trọng nhất nhằm giải thích sự tiến hóa của các tác nhân gây bệnh cây trải qua các chu trình “đỉnh – và – đáy, boom – and – bust”, trong đó mối quan hệ của cây ký chủ và tác nhân gây bệnh tuân theo quan hệ gen – đối - gen. Trong chu trình đỉnh và đáy, khi một giống cây với một gen kháng chủ (allele kháng 1) chống một tác nhân gây bênh nào đó được đưa vào trồng, nếu giống kháng này có các tính trạng nông học tốt và kháng bệnh tốt thì nó sẽ được nông dân trồng trên diện tích lớn. Đây là pha đỉnh (boom) của allele kháng 1. Tiếp theo, trong quần thể tác nhân gây bệnh, một đột biến từ không độc sang độc sẽ hình thành và tạo ra một chủng độc (chứa alellele độc 1) thoát khỏi sự nhận biết của ký chủ. Chọn lọc do tác động của giống kháng sẽ làm tăng tần số của chủng độc (chứa allele độc 1), thường “chậm” hơn so với sự gia tăng tần số của allle kháng 1 của ký chủ. Do chủng độc dần chiếm ưu thế (bởi giao lưu gen hay giao lưu kiểu gen) dẫn tới tính kháng dần dần mất hiêu quả hay nói cách kháng tính kháng bị bẻ gẫy. Hậu quả là nông dân không trồng giống kháng này nữa và tần số allele kháng 1 lại giảm dần. Đây là pha đáy “bust” của allele kháng 1. Chu trình lại tiếp tục bằng cách đưa giống chứa allele kháng 2 vào trồng. Hình. Đồ thị minh họa chu trình “ đỉnh – và – đáy”. Theo thời gian, tần số allele độc luôn “chậm” hơn tần số allele kháng do tác động chọn lọc của giống kháng.  Tương tác giữa tái tổ hợp và chọn lọc Ảnh hưởng của tái tổ hợp và chọn lọc lên sự đa dạng của 1 tác nhân gây bệnh có thể được minh họa qua trường hợp nấm gỉ sắt Puccinia graminis f. sp. tritici trên lúa mỳ ở Bắc Mỹ. Trước khi áp dụng một chương trình nhằm loại bỏ cây ký chủ phụ của nấm là cây barberry (~ 500 triệu cây đã bị loại bỏ trong vòng 50 năm), thì nấm đã tồn tại dưới dạng vô số (hàng trăm tới hàng ngàn) các kiểu gây bệnh (pathotypes) khác nhau. Sự đa dạng này có được là do nấm đã tái tổ hợp trên cây barberry (nấm gỉ sắt P. graminis f.sp. triciti là nấm gỉ săt chu trình lớn, dị chủ và chỉ sinh sản hữu tính trên cây ký chủ phụ là cây barberry). Việc loại bỏ cây ký chủ phụ đã dẫn tới nấm không còn khả năng tái tổ hợp và hậu quả là sự đa dạng di truyền của nấm cũng giảm theo. Sự chọn lọc, thông qua việc sử dụng các giống kháng đã dẫn tới nấm chỉ tồn tại dưới dạng một số các dòng khá thuần nhất và nguồn tạo ra sự đa dạng của nấm chỉ là do sự đột biến trong mỗi dòng nấm. Tương tác giữa trôi dạt di truyền, giao lưu kiểu gen và chọn lọc Mối tương tác này có thể được minh họa đối với quần thể nấm gỉ sắt lúa mỳ (Puccinia graminis f. sp. Tritici) ở Australia. Nấm đã được đưa vào Úc do người nhập cư châu Âu vào những năm 1780s. Lúc đầu, chỉ có một ít chủng nấm được đưa vào Úc dẫn tới hiệu ứng nền. Ở Úc không có cây barberry nên sự đa dạng do tái tổ hợp hữu tính không xảy ra. Hậu quả là nấm tồn tại dưới dạng các dòng thuần nhất mà sự tiến hóa của mỗi dòng chỉ do đột biến trong nội bộ mỗi dòng. Một dòng thuần (gọi là race 126) chiếm ưu thế trên các cánh đồng lúa mỳ của Úc từ 1921 – 1954. Năm 1954, một race mới xuất hiện (gọi là race 21) và thay thế hoàn toàn race 126. Race 21 đã tới Úc từ Tây Phi nhờ jet steam (một luồng không khí ở độ cao khoảng 10 km, di chuyển qua khoảng cách xa 1000-4000 km, với vận tôc ~ 100 km/giờ). Race 21 này có các allele độc mới, marker isozyme mới, đa hình DNA mới. Sự xuất hiện của Race 21 điển hình cho giao lưu kiểu gen, trong đó, các kiểu gen mới, thích nghi hơn thay thế cho kiểu gen cũ do hậu quả của chọn lọc có định hướng. Tương tác giữa chọn lọc và giao lưu kiểu gen Sự tương tác giữa chọn lọc và giao lưu kiểu gen có thể được minh họa dựa trên ví dụ bệnh héo Fusarium (Fusarium oxysporum). F. oxysporum là một loài nấm truyền qua đất rất đa dang, gây bệnh héo trên nhiều cây trồng khắp nơi. Quần thể tự nhiên nấm tấn công vỏ rễ nhưng thường không gây bệnh. Dạng hoang dại (wild-type) là nấm hoại sinh thực sự. Các quần thể có tính gây bệnh cho cây dường như sinh sản vô tính nghiêm ngặt. Các dạng chuyên hóa (Formae speciales, số nhiều) của nấm (gây bệnh trên một loài cây) xuất hiện khi trồng độc canh một loài cây nào đó. Việc trồng độc canh, chẳng hạn cà chua, dưa, chuối đã tạo điều kiện cho các đột biến gây bệnh hình thành các dạng chuyên hóa là F. oxysporum f.sp. lycopercisi, Foc f.sp. melonis và Foc f.sp. cubense. Nấm F. oxysporum trong cùng một dạng chuyên hóa có thể phân biệt thành các chủng (race, pathotype) khác nhau dựa theo phản ứng với các gen kháng chủ của cây. Các dòng (clone) nấm lại có thể được phân biệt dùng các nhóm tương hợp vô tính (vegetative compatibility groups (VCGs), isozymes, hoặc các marker DNA. Người ta đã quan sát thấy nhiều lần rằng cùng một race nấm có thể có nền di truyền khác nhau. Điều này có nghĩa các dòng nấm của cùng môt race đã tiến hóa hoàn toàn độc lập (Gordon and Martyn 1997). Trái lại, cũng có nhiều ví dụ cho thấy các race khác nhau lại có cùng nền di truyền có nghĩa là chọn lọc đã cho phép hình thành các thể đột biến mới từ không độc sang độc ở trong cùng một dòng nấm Một diễn giải về các quan sát trên là: một dạng chuyên hóa mới hình thành do áp lực chọn lọc cao của trồng độc canh một loài cây trong một hệ sinh thái, nơi mức độ đồng nhất cao của ký chủ đã tạo ra một nich sinh thái mới cho phép các thể đột biến (hiếm) có thể gây bệnh hình thành từ quần thể hoang dại hoại sinh vốn rất đa dạng trong đất. Các dạng chuyên hóa có khả năng gây bệnh di chuyển sang các cánh đồng mới, thậm chí qua các khoảng cách xa khắp thế giới qua cây hay đất nhiễm nấm gây bệnh. Các dạng chuyên hóa có thể có nguồn gốc độc lập từ các hệ sinh thái khác nhau tạo ra các chủng gây héo có nền di truyền độc lập (khác) nhau. Một ví dụ là dạng chuyên hóa F. oxysporum f. sp. cubense (gây bệnh héo Panama trên chuối). Dạng này có bản chất đa nguồn gốc (polyphyletic). Hai dòng nấm có nguồn gốc độc lập đã di chuyển khắp thế giới (Koenig et al. 1997). Sự giải thích trên cũng phù hợp với các quan sát về nhiều dạng chuyên hóa của nấm F. oxysporum khác như các dạng chuyên hóa gây hại trên cẩm chướng, coca, cọ dầu, cà chua, lily, đậu… Như vậy, các dạng chuyên hóa nấm nấm F. oxysporum gây bệnh héo hình thành một cách tự phát trên các cây trồng độc canh và là vật liệu cho giao lưu kiểu gen. Tương tác giữa tái tổ hợp và giao lưu gen Tương tác giữa tái tổ hợp và giao lưu gen có thể được minh họa đối với nấm Mycosphaerella graminicola (giai đoạn vô tính là Septoria tritici) gây bệnh đốm lá lúa mỳ. Các phân tích RFLP cho thấy quần thể nấm khắp thế giới có mức độ đa dạng kiểu gen cao (trong tổng số 1673 mẫu nấm thử/15 quần thể khắp thế giới, có tới 1327 kiểu gen khác nhau) chứng tỏ có vai trò của tái tổ hợp thông qua sinh sản hữu tính. Minh họa về mức độ đa dạng kiểu gen có thể thấy ở hình…. Các marker RFLP trung tính cho thấy mức độ tương đồng cao trong số các quần thể nấm khắp thế giới chứng tỏ đã có giao lưu gen trong các quần thể (hình). Người ta đã chứng minh rằng có sự cân bằng giữa sinh sản hữu tính và di cư đối với nấm này. Khi bắt đầu vụ trồng, mức độ đa dạng chủ yếu do các bào tử phát tán từ nơi khác tới (di cư). Vào cuối vụ trồng, sự đa dạng lại chủ yếu từ tái tổ hợp do sinh sản hữu tính từ các isolate trong cùng ruộng (Zhan et al. 1998). Hình. DNA fingerprints của nấm các isolate nấm Mycosphaerella graminicola được lấy mẫu tại 5 vị trí (site) cách nhau 10 m trên một cánh đồng. Kết quả cho thấy nấm rất đa dạng về kiểu gen. Các kiểu gen đồng nhất (mũi tên) chỉ phát hiện thấy trong một vài trường hợp (ví dụ 2 dòng nấm phân lập từ 2 quả cành khác nhau nhưng trên cùng 1 vết bệnh (site C); hoặc 2 dòng nấm phân lập từ 2 lá khác nhau nhưng trong cùng 1 ví trí cách nhau vài mét (site E)). Hình. Phân tích RFLP tại 3 locus: A) Locus pSTL10, B) Locus pSTL31 và C) Locus pSTS14. D) Locus pSTS192A của nấm Mycosphaerella graminicola. Sự xuất hiện của các băng AFLP giống nhau ở các quần thể khác nhau chứng tỏ có sự giao lưu gen giữa các quần thể (Zhang et al. 2003) Ứng dụng di truyền quần thể để đánh giá các nguy cơ do tiến hóa của tác nhân gây bệnh Các nhà bệnh cây nghiên cứu tiến hóa của tác nhân gây bệnh vì chúng tiến hóa để khắc phục gen kháng của ký chủ hay trở nên kháng với thuốc trừ bệnh. Tác nhân gây bệnh tiến hóa nhanh nhất sẽ có nguy cơ nhất trong việc khắc phục các gen kháng chủ hoặc chống lại các biện pháp phòng chống hóa học. Các tác nhân gây bệnh có tốc độ đột biến cao có nguy cơ lớn hơn các tác nhân gây bệnh có tốc độ đột biến thấp vì tốc độ đột biến cao làm tăng xác suất đột biến từ không độc sang độc hoặc từ tính mẫn cảm thuốc sang tính kháng thuốc. Nhìn chung, tốc độ đột biến là thấp dù chúng có thể khác nhau theo loci và theo loại tác nhân gây bệnh. Quần thể tác nhân gây bệnh có yếu tố di động (transposable elements) hoạt động sẽ có nguy cơ hơn quần thể không có yếu tố di động hoạt động. Cần chú ý rằng một đột biến hình thành nhưng thiếu tác động của các lực tiến hóa khác thì chưa chắc sẽ xuất hiện ở một tốc độ đủ cao để có thể tạo ra những thay đổi có thể phát hiện được trong tần số allele. Tác nhân gây bệnh với kích thước quần thể lớn có tiềm năng tiến hóa hơn tác nhân gây bệnh với kích thước quần thể nhỏ vì chúng có nhiều allele đột biến hơn. Các tác nhân gây bệnh trải qua sự suy giảm nhanh, đều đặn kích thước quần thể (chẳng hạn do hậu quả của luân canh hoặc điều kiện thời tiết cực bất thuận) sẽ kém đa dạng hơn do hậu quả của trôi dạt di truyền và kém thích nghi hơn so với tác nhân gây bệnh duy trì được kích thước quần thể quanh năm. Hai cách đơn giản để làm giảm kích thước quần thể tác nhân gây bệnh là luân canh cây thường xuyên và tránh trồng các cây quá mẫn cảm mà chúng cho phép tác nhân gây bệnh bùng nổ về kích thước quần thể. Các tác nhân gây bệnh với khả năng giao lưu gen cao có nguy cơ lớn hơn tác nhân gây bệnh với khả năng giao lưu gen thấp do 2 lý do: (1) Chúng có kích thước quần thể lớn hơn và do vậy duy trì nhiều allele hơn. (2) Chúng có khả năng cao hơn trong việc truyền các đột biến kháng thuốc hoặc đột biến độc qua các khoảng cách địa lý xa hơn. Sự di chuyển của nguồn bệnh sinh sản vô tính (giao lưu kiểu gen) có nguy cơ cao hơn sự di chuyển của nguồn bệnh sinh sản hữu tính (giao lưu gen) vì nguồn bệnh sinh sản vô tính chứa toàn bộ các gen đồng thích nghi (coadapted) đã được chọn lọc từ trước về tính gây bệnh trên cây nơi nó hình thành. Trái lại các nguồn bệnh sinh sản hữu tính (chẳng hạn các bào tử túi, mặc dù có các tổ hợp allele mới nhưng chưa được chọn lọc về tính gây bệnh trên cây). Chúng ta không thể kiểm soát được sự giao lưu gen./kiểu gen do sự phát tán tự nhiên của tác nhân gây bệnh nhờ gió, nước, côn trùng nhưng chúng ta có thể hạn chế khả năng giao lưu qua qua khoảng cách xa do con người như mang vật liệu cây, đất, dụng cụ nhiễm bệnh từ quần thể tác nhân gây bệnh này sang quần thể tác nhân gây bệnh khác vốn biệt lập. Các biện pháp cụ thể là kiểm dịch thực vật hoặc loại bỏ các ký chủ mẫn cảm đóng vai trò như cầu nối sống giữa các quần thể tác nhân gây bệnh hoặc trồng các giải cây kháng bệnh có vai trò như rào cản giữa các quần thể ký chủ mẫn cảm. Các tác nhân gây bệnh trải qua tái tổ hợp thường xuyên (qua phân bào giảm nhiễm ở nấm, tuyến trùng, giao nạp – conjugation ở vi khuẩn hoặc tái tổ hợp ở virus do cây bị nhiễm hỗn hợp, dung hợp sợi nấm (anastomosis) hoặc tái tổ hợp vô tính (parasexual recombination) ở nấm) đều có có nguy cơ cao hơn các tác nhân gây bênh không hoặc ít tái tổ hợp vì có thể nhanh chóng tạo ra các tổ hợp allele mới có tính độc cao hơn, chống lại nhiều gen kháng cùng một lúc. Vì lý do này, thậm chí một chiến lược dựa vào qui tụ gen kháng (gen pyramid) cũng chưa chắc tạo ra tính kháng bền vững đối với các tác nhân có khả năng tái tổ hợp thường xuyên. Các tác nhân gây bệnh có kiểu sinh sản hỗn hợp (cả vô tính và hữu tính) sẽ có nguy cơ tiến hóa cao hơn vì chúng nhận được lợi thế của cả 2 kiểu sinh sản. Tái tổ hợp qua sinh sản hữu tính cho phép nhiều tổ hợp allele mới hình thành và được thử về khả năng gây bệnh tại điều kiện địa phương. Sinh sản vô tính cho phép các kiểu gen thích nghi nhất phát triển thành các dòng thuần nhất, duy trì các tổ hợp allele thích nghi nhất và phát tán các kiểu gen/tổ hơp alalle trên diện rộng nếu tác nhân gây bệnh mang chúng có thể di chuyển qua khoảng cách xa. Các quần thể tác nhân gây bệnh được đặt dưới áp lực chọn lọc có định hướng mạnh qua nhiều thế hệ có nguy cơ cao hơn các quần thể được đặt dưới áp lực chọn lọc yếu hoặc được đặt dưới áp lực chọn lọc không liên tục (do phân bố theo không gian và thời gian của lực chọn lọc). Chọn lọc là lực tiến hóa dễ dàng được kiểm soát bởi con người và do đó là điểm thực tiễn nhất mà con người có thể can thiệp vào quá trình tiến hóa của tác nhân gây bệnh. Các hệ sinh thái nông nghiệp dựa trên sử dụng rông rãi các gen kháng chủ, đơn (trồng độc canh, đồng nhất về di truyền) sẽ tạo ra áp lực chọn lọc có định hướng mạnh lên quần thể tác nhân gây bệnh. Các hệ sinh thái nông nghiệp trồng hỗn hợp hoặc luân phiên các cây mang gen kháng khác nhau sẽ làm giảm hiệu quả của chọn lọc hoặc tạo ra áp lực chọn lọc ổn định và thấp, hoặc không liên tục dẫn tới làm giảm tốc độ gia tăng tần số các đột biến độc. Đóng góp của mỗi lực tiến hóa vào nguy cơ gây bệnh do tiến hóa của tác nhân gây bệnh có thể được tổng kết ở bảng sau. Bảng. Mức nguy cơ do tiến hóa của tác nhân gây bệnh nhằm khắc phục các biện pháp phòng chống Nguy cơ cao Nguy cơ thấp Tốc độ đột biến cao, Các yếu tố di động hoạt động Tốc độ đột biến thấp, Không có các yếu tố di động Kích thước quần thể lớn. Quần thể qua đông lớn Quần thể địa phương hiếm khi tuyệt chủng Không có trôi dạt di truyền Không bị mất allele Kích thước quần thể nhỏ. Không có quần thể qua đông Quần thể địa phương thường xuyên tuyệt chủng Trôi dạt di truyền đáng kể Bị mất allele Giao lưu gen/kiểu gen cao Nguồn bệnh vô tính phát tán qua khoảng cách xa (nhờ gió) Phát tán nhờ con người qua khoảng cách xa phổ biến Giao lưu gen/kiểu gen thấp Nguồn bệnh vô tính thuộc nhóm truyền qua đất Kiểm dịch thực vật hiệu quả Sinh sản kiểu hỗn hợp (vô tính + hữu tính): Tạo cả nguồn bệnh hữu tính và vô tính hàng năm Chỉ sinh sản vô tính: chỉ tạo nguồn bệnh vô tính Chọn lọc có định hướng, mạnh Cây mang gen kháng R được trồng độc canh, đồng nhất giống, liên tục, trên diên rộng Chọn lọc không liên tục. Cây mang gen kháng R được trồng theo kiểu hỗn hợp giống, giống nhiều dòng; được trồng luân canh (thời gian) hoặc xen canh (không gian) Dựa vào đánh giá nguy cơ do tến hóa của tác nhân gây bệnh, chúng ta có thể xây dựng được một sơ đồ cho phép hướng dẫn sử dụng các chiến lược tạo và sử dụng giống kháng dựa trên hiểu biết về di truyền quần thể của tác nhân gây bệnh Mức đa dạng di truyền của quần thể tác nhân gây bệnh CAO Sinh sản hữu tính, hỗn hợp / giao phối Giao lưu gen Giao lưu gen THẤP THẤP CAO Sinh sản vô tính / tự phối TKD (qui tụ) TKD (đơn gen) TKN + TKD (dùng hỗn hợp giống & giống nhiều dòng) (pyramid) CAO THẤP TKN + TKD (theo vùng) VD: Phytophthora sojae Rhizoctonia solani VD: Phytophthora infestans Blumeria VD: Nấm gỉ sắt sinh sản vô tính (Puccinia maydis) ở VN? VD: Fusarium oxysporum Hình Sơ đồ hướng dẫn sử dụng các chiến lược tạo và sử dụng giống kháng dựa trên hiểu biết về di truyền quần thể của tác nhân gây bệnh. TKN : tính kháng ngang (tuân theo mô hình gen-đối-gen). TKD: tính kháng dọc. Chương 2. Lựa chọn vùng gen của tác nhân gây bệnh Bộ gen của tác nhân gây bệnh Tùy theo nhóm tác nhân gây bệnh, kích thước bộ gen cũng như số lượng gen của chúng thay đổi đáng kể (bảng ). Bảng . Ví dụ kích thước bộ gen một số sinh vật Nhóm Ví dụ Kích thước bộ gen (1000 bp) Số gen Số NST Viroid Potato spindle viroid 0.36 0 Vệ tinh virus DNA-β 1.35 1 Virus Begomoviruses (gen đơn) 2.7 6 Virus Papaya ringspot potyvirus 10 10 Virus Rice grassy stunt oryza virus 25 12 Vi khuẩn Ca. Phytoplasma asteris 700 708 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae 4900 4400 Vi khuẩn Ralstonia solanacearum 5800 5000 Nấm Pyricularia oryzae 40000 - 6 Nấm Puccinia graminis 80000 - 18 Nấm noãn Phytophthora infestans 240000 - 10 Thực vật Arabidopsis thaliana 157000 39.000 5 Thực vật Oryza sativae (japonica) 420000 40.000 12 Côn trùng Drosophila melanogaster 165000 14.000 4 Tuyến trùng Caenorhabditis elegans 98000 20.000 6 Người Homo sapiens 840000 33.000 24 Một số điểm khi chú ý về bộ gen của tác nhân gây bệnh là: Bộ gen viroid Đây là nhóm tác nhân gây bệnh rất đặc biệt, bộ gen của chúng chỉ là các phân tử RNA sợi đơn dạng vòng, kích thước cực kỳ nhỏ khoảng 250 - 350 nts (có thể xem là nhóm tác nhân gây bệnh có kích thước nhỏ nhất). Chúng không mã hóa một protein nào nhưng có thể gây bệnh cho cây thông qua can thiệp vào hệ thống gene silencing của cây. Việc nghiên cứu đa dạng cũng như phân loại nhóm tác nhân gây bệnh này dựa vào trình tự toàn bộ bộ gen của chúng. Bộ gen virus Virus thực vật có bộ gen cũng rất nhỏ, mã hóa ít gen. Mặc dù bộ gen virus rất đơn giản nhưng cực kỳ đa dạng. Khoảng 25% số virus thực vật có bộ gen dạng DNA dạng vòng, sợi đơn hoặc kép. Các gen trên bộ gen virus có thể được mã hóa cùng chiều hay ngược chiều kim đồng hồ. Khoảng 75% các virus thực vật còn lại là các virus RNA. Các virus RNA cũng có thể có bộ gen sợi đơn hoặc sợi kép. Bộ gen của chúng có thể được gọi là cực (+) nếu được dịch mã trên sợi virus hoặc cực (-) nếu được dịch mã trên sợi trung gian trong quá trình tái sinh, hoặc lưỡng cực. Phần lớn virus thực vật có bộ gen RNA sợi đơn, cực +. Bộ gen của virus có thể phân mảnh hoặc không phân mảnh. Đối với các virus có bộ gen phân mảnh thì các phân tử genome của chúng có thể được lắp ráp trong cùng một phân tử hoặc được lắp ráp trong các phân tử khác nhau. Các gen của virus không chứa intron. Đối với một số virus, protein của chúng có thể có thể được xử lý hậu dịch mã để hình thành các protein chức năng. Một số virus RNA trong quá trình tái sinh có thể hình thành các phân tử RNA có kích thước nhỏ hơn kích thước bộ gen virus gọi là bộ gen phụ (subgenomic). Các phân tử bộ gen phụ này cũng mã hóa các protein như của bộ gen chính. Một số virus (cả DNA và RNA) có thể có các phân tử vệ tinh (satellite). Các phân tử vệ tinh này phải nhờ virus để tái sinh và phát tán. Một số ví dụ 1. Các begomovirus nhóm bộ gen đơn (gây bệnh xoăn vàng lá cà chua): bộ gen sợi vòng đơn (gọi là DNA-A), kích thước ~ 2.7 kb; bộ gen gồm 6 gen mã hóa theo 2 chiều ngược nhau. 2. Banana bunchytop virus (BBTV, chi Babuvirus, gây bệnh chùn ngọn chuối): bộ gen phân mảnh gồm 6 phân tử DNA sợi vòng đơn, mỗi phân tử có kích thước khoảng 1.35 kb. và được lắp ráp riêng rẽ. Trên mỗi sợi chứa 1 ORF mã hóa 1 protein khác nhau. 3. Cauliflower mosaic virus (CaMV) gây bệnh trên nhiều cây, rice tungro bacilliform virus (RTBV) gây bệnh tungro trên lúa): Bộ gen là 1 phân tử DNA sợi vòng kép, kích thước khoảng 8 kb. Bộ gen gồm 4 gen mã hóa theo 1 chiều. 5. Các potyvirus như papaya ringspot virus (PRSV), potatovirus Y (PVY): bộ gen RNA sợi đơn cực dương, kích thước khoảng 10 kb, chứa 1 đầu 5’UTR và 1 đầu 3’UTR. Đầu 3’UTR tận cùng bằng 1 chuỗi polyadenine. Bộ gen chứa 1 ORF lớn mã hóa 1 polyprotein và được xử lý sau dịch mã thành 10 protein chức năng. Bộ gen vi khuẩn và phytoplasma Bộ gen của vi khuẩn và phytoplasma có cấu trúc đơn giản. Phần lớn chúng có bộ gen là một phân tử DNA sợi kép dạng vòng. Gần đây người ta đã chứng minh một số vi khuẩn có bộ gen dạng sợi thẳng (chẳng hạn phần lớn vi khuẩn thuộc chi Streptomyces). Ngoài DNA genome, đa số vi khuẩn còn mang một hoặc nhiều phân tử plasmid. Bộ gen vi khuẩn nhìn chung có kích thước nhỏ (trong phạm vi từ 0.5 tới 10 Mb). Bộ gen không chứa intron dẫn tới các gen có thể được gọi là các ORF. Một số gen có thể gối lên nhau. Một số gen có kích thước rất nhỏ (<60 bp). Ví dụ. Bô gen của Ralstonia solanacearum (gây bệnh héo xanh vi khuẩn nhiều loại cây trồng). Bộ gen của R. solanacearum gồm 2 phân tử DNA vòng có kích thước lớn. Phân tử thứ nhất là nhiễm sắc thể của vi khuẩn (có kích thước 3.7 Mb) còn phân tử kia gọi là siêu plasmid (megaplasmid, có kích thước 2.1 Mb). Phân tử plasmid này cũng mã hóa nhiều gen quan trọng của vi khuẩn. Bộ gen nấm Nấm là các sinh vật nhân thật, các gen cũng được mã hóa trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Phần lớn nấm có kích thước bộ gen nhỏ hơn so với thực vật. Kích thước bộ gen trung bình của nấm khoảng 14 Mb. So với thực vật và động vật bậc cao, nấm có tỷ lệ DNA không mã hóa thấp hơn nhiều (chỉ khoảng 10 – 20 %). Khoảng 30 % bộ gen nấm chứa các chuỗi lặp. Các chuỗi lặp này có tiềm năng là marker phân tử vì chúng có số copy cao. Một điểm rất quan trọng (khi xét đến việc lựa chọn marker phân tử): ngoại trừ nấm đảm (ví dụ như nấm than đen, gỉ sắt), thì ở các loại nấm khác, giai đoạn đơn bội (haploid) chiếm ưu thế trong chu kỳ phát triển. Ngoài ra, bộ nhiễm sắc thể của nấm có thể rất đa dạng. Ở nhiều loài nấm, thậm chí số lượng và kích thước nhiễm sắc thể có thể khác nhau giữa các isolate (vd như đối với nấm Colletotrichum type B và Fusarium oxysporum fsp.cubense). Chọn vùng gen nghiên cứu Về cơ bản, việc chọn vùng gen nghiên cứu đối với tác nhân gây bệnh cây cũng dựa theo đặc điểm bộ gen của 3 nhóm sinh vật là: virus/viroid, prokaryote (vi khuẩn, phytoplasma) và eurkaryote (nấm, tuyến trùng…). Chọn vùng gen virus Virus nói chung có kích thước bộ gen rất nhỏ, mã hóa chỉ một số ít gen chịu trách nhiệm nhiều chức năng sống của virus trong đó có 4 chức năng quan trọng là cấu trúc (lắp ráp phân tử virus), tái sinh, di chuyển (trong nội bộ tế bào, giữa các tế bào và hệ thống trong cây). Một trong các gen được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng và phân loại đối với virus thực vật là gen mã hóa vỏ protein (CP gen). Thông thường, gen của virus là một protein đa chức năng, trong đó chức năng chủ yếu nhất là cấu trúc. Ví dụ, đối với potyvirus, nhóm virus chiếm tới 20% tổng số virus thực vật, người ta thường nghiên cứu mức đa dạng dựa trên phân tích chuỗi gen CP. DNA ribosome DNA ribosome (rDNA), đặc biệt là vùng mã hóa các tiểu phần rRNA và các spacers liên quan của nó, là một trong các vùng DNA được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu đa dạng đối với sinh vật nhân thật (karyote) và tiền nhân (prokaryote). Cấu trúc và chức năng RNA ribosome Ribosome.Ribosomes là cơ quan tử cần cho tổng hợp protein. Một tế bào có thể chứa hàng ngàn ribosome. Ribosome ở cả sinh vật tiền nhân và nhân thật gồm 2 tiểu phần có kích thước không ngang bằng (tiểu phần lớn và tiểu phần nhỏ). Mỗi tiểu phần gồm ít nhất một phân tử rRNA nhiều tiểu phần protein ribosome (rprotein). Ở sinh vật tiền nhân, ribosome là 70S (tiểu phần lớn là 50S và tiểu phần nhỏ là 30S) Tiểu phần lớn 50S gồm rRNA 23S (~3000 nts) + rRNA 5S (120 nts0 + khoảng 30 protein ribosome. Tiểu phần nhỏ 30S gồm rRNA 16S (~1500 nts) + khoảng 20 protein ribosome Ở sinh vật nhân thật, ribosome là 80S (tiểu phần lớn là 60S và tiểu phần nhỏ là 40S) Tiểu phần lớn 60S gồm rRNA 28S (~4700 nts) + rRNA 5.8S (160 nts) + khoảng 50 protein ribosome. Tiểu phần nhỏ 40S gồm rRNA 18S (~1900 nts) + khoảng 35 protein ribosome RNA ribosome (rRNA) Các gen không mã hóa protein cũng phải được phiên mã, chẳng hạn phiên mã thành rRNA. Vùng DNA mã hóa rRNA được gọi là DNA ribosome (rDNA). Các rDNA được tổ chức thành các đơn vị phiên mã. Mỗi đơn vị phiên mã có thể được lặp lại nhiều lần trên bộ genome. Số lượng lặp cũng như cấu trúc của các đơn vị phiên mã khác nhau giữa giữa sinh vật nhân thật và sinh vật tiền nhân (hình) Ở sinh vật tiền nhân, số đơn vị phiên mã có thể chỉ là 1 hoặc lặp lại rải rác trên bộ gen (chẳng hạn bằng 7 ở E. coli). Về cấu trúc, mỗi đơn vị phiên mã của prokaryote gồm các gen xếp theo thứ tự là 16S-23S-5S. Ở 2 đầu của đơn vị phiên mã là các vùng 5’ và 3’ ETS (external transcribed spacer); còn ở 2 đầu của gen 23S là 2 vùng ITS (internal transcribed spacer). Một đoạn mã hóa tRNA thường nằm ở vùng ITS giữa gen 16S và 23S (và cũng thường nằm ở vùng 3’ETS). Chú ý là các đoạn spacer sẽ bị loại bỏ sau khi phiên mã để tạo ra các RNA chức năng. Ở sinh vật nhân thật, các đơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm đơn vị phiên mã. Số đơn vị lặp trong một cụm thường nhiều (ở nấm men là 100 – 200 lần). Các cụm đơn vị phiên mã cũng lại lặp lại nhiều lần trên các nhiễm sắc thể khác nhau (ở người có thể tới 5 cụm). Về cấu trúc, một đơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S. Tương tự như ở prokaryote, xung quanh vùng mã hóa của các gen RNA của eukaryote cũng là các vùng spacer. Do các đơn vị phiên mã của eukaryote lặp xếp liền kề nhau nên vùng spacer giữa các đơn vị lặp còn được gọi là vùng IGS (intergenic spacer). Vai trò của rDNA trong phân loại và nghiên cứu đa dạng và chẩn đoán rDNA là một vùng gen quan trọng trong nghiên cứu đa dạng và phân loại vì Là một vùng gen có mặt ở tất cả các đối tượng có cấu tạo tế bào. Các gen nằm trên rDNA có cả cùng bảo thủ lẫn vùng biến động và do vậy có thể được dùng để so sánh các chi khác nhau. Các vùng spacer biến động hơn rất nhiều và do vậy có thể dùng để so sánh các loài khác nhau, và trong một số trường hợp có thể ở mức dạng chuyên hóa. Về mặt kỹ thuật, trên rDNA của có nhiều vị trí cắt giới hạn, do vậy tạo điều kiện thuận lợi cho cloning. Các nghiên cứu đầu tiên đối với rDNA thường áp dụng kỹ thuật RFLP + lai hóa bằng dò + DNA tổng số được cắt bằng RE Gần đây hơn (khoảng 1990>+, các kỹ thuật trên được thay thế bằng PCR và có thể được sử dụng ngay trên mẫu cây nhiễm tác nhân gây bệnh (nấm, vi khuẩn) Cả vùng ITS và IGS đã được sử dụng để thiết kế các mồi đặc hiệu loài nhằm phát hiện tác nhân gây bệnh ngay trên cây bị nhiễm. Hiện nay, người ta quan tâm nhiều hơn đến việc giải trình tự toàn bộ đơn vị phiên mã rDNA để có được thông tin về tất cả các vùng trong đơn vị. Mặc dù vậy, người ta vẫn có thể có thông tin hữu ích dựa vào các băng đa hình cắt bằng RE đối với sản phẩm PCR khuyếch đại từ 1 vùng nào đó của đơn vị phiên mã. Cách này rất đơn giản, thường tạo 1 – 4 băng. Cần chú ý phân tích RFLP dựa vào rRNA chỉ dựa trên sự sai khác ở chuỗi nhận biết của RE nên nếu một phân tích (1) tạo ra 2 mô hình RFLP khác nhau cho biêt 2 mẫu là khác nhau nhưng (2) tạo ra 2 mô hình RFLP giống nhau không có nghĩa các vùng gen còn lại của cụm rRNA là giống nhaug nhau. (tham khảo: www.mendel.berkeley.edu/boletus/boletus.html; www. biology.duke.edu/fungi/). Gen mã hóa Có rất nhiều gen mã hóa đã được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng của tác nhân gây bệnh. Đối với nấm, một số gen phổ biến đã được sử dụng là các gen mã hóa actin, tubulin, yếu tố qui định sự tăng trưởng chiều dài sợi (elongation factors), cytochromes, proteases, và nhiều protein khác. Các gen này nhìn chung bảo thủ cao thậm chí gữa các sinh vật thuốc các đơn vị phân loại khác nhau. Tuy nhiên, vì chúng chứa các chuỗi intron ngắn rất biến động về số lượng cũng như vị trí trên gen nên có thể được sử dụng làm marker phân tử nhằm nghiên cứu các sinh vật có quan hệ gần. Ví dụ: nhiều nấm đã được nghiên cứu dựa trên các gen mã hóa là Fusarium, Ascochyta, và Phoma. Đối với vi khuẩn, nhiều loại gen mã hóa có thể được sử dụng. Một số ví dụ là gen virD2 (Agrobacterium), gen mã hóa pectate lyase (pel) (Erwinia carotovora), gen mã hóa protein không độc avrBS2 (Xanthomonas). Các chuỗi lặp Trên bộ gen của prokaryote và eukaryote có nhiều chuỗi lặp thường được sử dụng trong phân loại và đánh giá đa dạng. Đối với karyote, các chuỗi lặp này thường chiếm 1 tỷ lệ rất cao trong bộ gen của các eukaryote (ví dụ khoảng 50 % DNA của người là các chuỗi lặp). Các chuỗi lặp có thể được chia thành: Các chuỗi lặp liền kề (tandem repetitive sequences) Chuỗi DNA vệ tinh đơn (satellite DNA). Gồm các đoạn 5 – 10 bp, lặp lại khoảng 100 lần Minisatellites. Gồm các đoạn 15-100 bp, lặp lại khoảng 20-50 lần VNTR (variable number tandem repeat): gồm các đoạn lặp có chiều dài rất thay đổi ( ~ 1-2000 bp) Microsatellites: gồm các đoạn lặp 2-4 bp, lặp lại khoảng 20-50 lần. Các microsatellite là các các chuỗi lặp rất quan trọng, đặc biệt trong nghiên cứu đa dạng của eukaryote nên được trình bày riêng. Các chuỗi lặp phân bố rải rác (Dispersed repetitive sequences) Đây là các chuỗi DNA có kích thước khác nhau và lặp lại nhiều lần nhưng không liền kề nhau mà phân bố rải rác khắp bộ gen. Một ví dụ điển hình là các yếu tố di động (mobile elements = gen nhảy). Đối với eukaryote, các chuỗi lặp phân bố rải rác có thể có kích thước ngắn (Short interspersed elements, SINES) từ 150 - 300 bp (ví dụ chuỗi lặp Alu ở người có kích thước 300 bp, lặp lại từ 0.5 – 1 triệu lần trong bộ gen, chiếm ~5% tổng DNA). Các chuỗi lặp có thể có kích thước dài (Long interspersed elements (LINES)) với kích thước 5000 - 7000 bp. Đối với prokaryote, bộ gen của chúng cũng chứa nhiều loại chuỗi lặp phân bố rải rác. Một số chuỗi lặp có ý nghĩa trong nghiên cứu đa dạng và phân loại vi khuẩn là: Các chuỗi lặp đối song (REP, repetitive extragenic palindromic) có kích thước 35 - 40 bp. Các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (ERIC, enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp. Nguyên tố BOX có kích thước 54-bp. DNA ti thể (mitochondrial DNA) DNA ti thể (mitochondrial DNA = mt DNA) đã được sử dụng nhiều trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh cây (nấm). DNA ti thể là một phân tử DNA vòng di truyền chủ yếu theo dòng mẹ. Đối với nấm, mtDNA có đặc điểm sau: Kích thước từ 17-121 Kb Chiếm từ 1 – 20 % DNA của tế bào Các vùng không mã hóa chiếm một tỷ lệ cao Chứa nhiều các chuỗi lặp và intron. Đặc điểm này làm cho mtDNA của các sinh vật quan hệ gần có một mức đa dạng đáng kể. Số lượng copy trong tế bào có thể khá lớn Ở một số loài nấm có thể có sự tái tổ hợp mtDNA .Có thể được chuyển (độc lập với bộ gen nhân) sang tế bào khác thông qua dung hợp Có thể chứa các chuỗi lặp đối song giàu GC Chứa cả các vùng bảo thủ và vùng biến động nên thông tin về trình tự chuỗi có thể rất có ích trong phân biệt nấm ở nhiều mức phân loại. Trong một số trường hợp, các loài có qua hệ gần gũi có thể có bộ gen mt DNA rất khác nhau. Ví dụ các loài nấm men Saccharomyces có mtDNA biến động từ 24 – 78 kb. Chương 3. Các kỹ thuật CNSH trong nghiên cứu bệnh cây Chương này nhằm hệ thống lại các kỹ thuật CNSH dựa trên phân tích băng điện di được sử dụng trong bệnh cây. Hầu hết các kỹ thuật quan trọng đã được mô tả chi tiết trong nhiều tài liệu CNSH. Vì tác nhân gây bệnh cây rất đa dạng bao gồm các eukaryote, prokaryote, virus và viroid nên trong tài liệu này, người đọc nên chú ý đến đặc điểm, ưu nhược điểm của mỗi phương pháp nhằm áp dụng kỹ thuật phù hợp với đối tượng nghiên cứu. Các marker di truyền Định nghĩa Một marker di truyền có thể được định nghĩa theo 1 trong các cách sau: Một dấu hiệu trên nhiễm sắc thể hoặc allele cho phép xác đinh một vùng DNA đặc biệt. Một đoạn DNA đặc biệt với vị trí đã biết trên genome Một gen mà biểu hiện kiểu hình của nó thường được phân biệt dễ dàng, được sử dụng xác định một cá thể hoặc 1 tế bào mang nó, hoặc như một dò để đánh dấu 1 nhân, nhiễm sắc thể hay locus (King and Stansfield, 1990). Phân loại Marker di truyền có thể được chia làm 3 nhóm chính: Các tính trạng hình thái có thể quan sát bằng mắt. Các marker sinh hóa dựa trên sản phẩm gen (isozyme, allozyme, acit béo…) Các marker phân tử dựa trên các thử nghiệm liên quan đến DNA. Chú ý là các marker phân tử không nên được xem là các gen thông thường mà nên được xem như các dấu hiệu cố định trên genome. Chúng là các chuỗi DNA có thể xác định được, nằm tại một vị trí đặc biệt trên genome và có thể truyền được sang thế hệ sau. Vì có quá nhiều kỹ thuật phân tử với nguyên lý khác hẳn nhau nên người nghiên cứu phải cẩn thân trong việc lựa chọn kỹ thuật phù hợp Các loại marker phân tử Có rất nhiều các loại marker phân tử khác nhau như liệt kê ở bảng dưới đây Bảng. Các loại marker phân tử TT Tên đầy đủ Viết tắt 1 allele specific oligo ASO 2 allele specific polymerase chain reaction AS-PCR 3 amplified fragment length polymorphism AFLP 4 anchored microsatellite primed PCR AMP-PCR 5 arbitrarily primed PCR AP-PCR 6 cleaved amplified polymorphic sequence CAPS 7 degenerate oligonucleotide primed PCR DOP-PCR 8 DNA amplification fingerprinting DAF 9 expressed sequence tags EST 10 inter-simple sequence repeat ISSR 11 inverse PCR IPCR 12 Microsatellite primed PCR MP-PCR 13 multiplexed allele-specific diagnostic assay MASDA 14 random amplified microsatellite polymorphisms RAMP 15 random amplified microsatellites RAM 16 Random amplified polymorphic DNA RAPD 17 selective amplification of microsatellite polymorphic loci SAMPL 18 sequence characterized amplified regions SCAR 19 sequence specific amplification polymorphisms SSAP 20 sequence tagged microsatelite site STMS 21 sequence tagged site STS 22 short tandem repeats STR 23 simple sequence length polymorphism SSR 23 single nucleotide polymorphism SNP 25 single primer amplification reactions SPAR 26 Single stranded conformational polymorphism SSCP 27 site-selected insertion PCR SSI 28 strand displacement amplification SDA 29 variable number tandem repeat VNTR 30 Repetitive element based PCR = repetitive sequence primed PCR = repetitive sequence based PCR Rep-PCR Một số loại marker rất giống nhau như ASAP, ASO và AS-PCR. Một số là đồng nghĩa như ISSR, RAMP, RAM, SPAR, AMP-PCR, MP-PCR và ASSR. Một số là đồng nhất như SSLP, STMS, STR và SSR. Các loại marker trên có thể được phân loại theo các nhóm sau: Kiểu di truyền: gen nhân cả bố và mẹ, gen nhân qua mẹ, cơ quan tử qua mẹ, cơ quan tử qua bố Kiểu hoạt động của gen: trội hay đồng trội Phương pháp phân tích: dựa trên lai phân tử (ví dụ RFLP) hay dựa trên PCR (ví dụ rep-PCR, SSR) Kỹ thuật dựa trên lai phân tử: RFLP RFLP (Restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1975 để xác định đa hình DNA nhằm lập bản đồ di truyền của một đột biến mẫn cảm nhiệt độ của các serotype của adenovirus. Kỹ thuật dựa trên việc cắt bằng RE toàn bộ bộ gen của vi sinh vât. Mặc dù 2 cá thể cùng loài nhìn chung có bộ gen đồng nhất thì chúng vẫn khác nhau một số nucleotide do các nguyên nhân sau: đột biến điểm, thêm/mất, chuyển vị trí, đảo vị trí và lặp (duplication) nucleotide. Hậu quả là sản phẩm cắt DNA sẽ có số lượng và kích thước thay đổi. Qui trình RFLP nhìn chung gồm các bước sau: Cắt DNA mẫu bằng 1 hoặc nhiều RE Tách sản phẩm cắt bằng điện di agarose Chuyển các sản phẩm đã tách từ gel agarose sang màng bằng Southern bloting. Phát hiện các đoạn bằng lai DNA với dò (probe) thích hợp. Hình ảnh hóa (autoradiography) phụ thuộc nhãn dò (bức xạ hay huỳnh quang) RFLP: các chú ý về kỹ thuật Chất lượng DNA phải rất sạch vì phản ứng cắt băng RE yêu cầu chất lượng DNA cao RE: có thể có đoạn nhận biết 4, 6, 8 bp (vd ECoRI có chuỗi nhận biết là 6 (5’…GAATTC…3’). Việc lựa chọn RE phụ thuộc mức độ phân giải. Nếu RE có chuỗi nhận biết = 4 thì mức độ phân giải cao nhất (số băng hình thành nhiều nhất, kích thước băng nhỏ). Trái lại nếu dùng RE có chuỗi nhận biết bằng 8 thì sẽ tạo ít băng DNA hơn, kích thước băng lớn và do vậy phải yêu cầu điều kiện điện di phức tạp. Thông thường, người ta hay dùng RE có chuỗi nhận biết bằng 6 (sẵn có hơn, rẻ hơn, thường tạo các đoạn DNA có kích thước từ 200 – 20.000 bp nên dễ tách bằng điện di agarose) Điện di: có thể điện di agarose hoặc polyacrylamide phụ thuộc RE (RE-4 tạo đoạn quá nhỏ nên phải dùng polyacrylamide. Trái lại RE = 6 không thể tách =polyacrylamide nên phải dùng agarose) Dò: dò có thể đặc hiệu loài, đặc hiệu môt locus đơn (single locus RFLP), đặc hiệu nhiều locus (multiple locus RFLP) (thường dùng các chuỗi lặp làm dò). Dò có thể là các clone DNA hoặc cDNA. Dò có thể gán nhãn phóng xạ hoặc gán nhãn huỳnh quang Phần trăm gel để tách các sản phẩm DNA sợi thẳng Agarose Polyacrylamide Nồng độ gel (%) Phạm vi tách (bp) Nồng độ gel (%) Phạm vi tách (bp) 0.5 1000 - 30000 3.5 100 – 1000 0.7 800 – 12000 5.0 80 – 500 1.0 500 – 10000 8.0 60 – 400 1.2 400 – 7000 12.0 40 – 200 1.4 200 – 4000 20.0 5 - 100 2.0 50 - 2000 RFLP: Các ưu điểm chính Có khả năng lặp lại cao (giữa các phòng thí nghiệm) Xác định được di truyền đồng trội Marker có tính đặc hiệu locus (nên trình tự bảo thủ của các gen của các sinh vật có quan hệ gần gũi có thể được xác định) Không yêu cầu thông tin chuỗi Dễ ghi điểm do kích thước các băng thường khác nhau đáng kể RFLP: Các hạn chế chính Yêu cầu số lượng và chất lượng DNA cao Việc xây dựng bộ dò khá phức tạp Không thể tự động hóa được (nên tốn công sức và chi phí) Mức độ đa hình thấp, chỉ một số ít locus được nghiên cứu trong một lần thử Tốn thời gian, lao động và đắt Dò yêu cầu gán nhãn bức xạ nên độc hại (hiện nay thường gán nhãn huỳnh quang an toàn hơn nhưng đắt) Các kỹ thuật dựa trên PCR Từ khi được phát minh bởi Kary Mullis năm 1983 (đoạt giả Nobel năm 1993), PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất trong sinh học phân tử. Các kỹ thuật dựa trên PCR có một số lợi thế là Lượng DNA yêu cầu nhỏ (trong nhiều trường hợp không cần chất lượng cao) Không cần gán nhãn bức xạ ở phần lớn các kỹ thuật Khả năng nhân chuỗi DNA từ mô bảo quản Không yêu cầu trang thiết bị quá phức tạp Nhiều kỹ thuật không cần biết trước trình tự chuỗi gen cần phân tích (AP-PCR, RAPD, DAF, AFLP và ISSR. Mức độ đa hình cao cho phép tạo nhiều marker di truyền trong thời gian ngắn Khả năng kiểm tra nhiều gen đồng thời Các lợi thế trên, tuy nhiên, có thể thay đổi tùy kỹ thuật đặc biệt. Phụ thuộc loại mồi sử dụng, các kỹ thuật dựa trên PCR có thể chia làm 2 nhóm chính Các kỹ thuật dùng mồi tùy ý (hoặc bán tùy ý). Do mồi tùy ý nên không cần biết trước thông tin chuỗi của đối tượng nghiên cứu (Vd:AP-PCR, DAF, RAPD, AFLP, ISSR). Các kỹ thuật dùng mồi đặc hiệu được thiết kế từ các chuỗi đã biết (Vd: EST, CAPS, SSR, SCAR, STS, Rep-PCR). Các kỹ thuật dựa trên PCR dùng mồi tùy ý: RAPD, AP-PCR và DAF RAPD (random amplified polymorphic DNA), AP-PCR (arbitrarily primed PCR) và DAF (DNA amplification fingerprinting) là 3 kỹ thuật phổ biến thường được gọi chung là MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling). Sự khác nhau chủ yếu của các kỹ thuật MAAP là biến đổi mô hình băng điện di bằng cách thay đổi trình tự và độ dài mồi, Ta, số chu trình PCR, enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và cắt khuôn DNA hay sản phẩm PCR bằng RE; kỹ thuật tách và nhuộm sản phẩm PCR. Các kỹ thuật này tạo các profile khác nhau đáng kể, thay đổi từ khá đơn giản (RADP) tới rất phức tạp (DAF). Cả 3 kỹ thuật RAPD, AP-PCR và DAF sử dụng một mồi tùy ý đê nhân DNA với sản phẩm nhìn chung có kích thước < 3000 bp. RAPD RADP thường dùng 1 mồi có kích thước khoảng 10 bp có nhiệt độ gắn mồi Ta thấp (34 – 37 OC). Mặc dù trình tự mồi là tùy ý nhưng cần đảm bảo 2 chỉ tiêu cơ bản: hàm lượng GC tối thiểu = 40% (thông thường 50 – 80 %) và phải không chứa các chuỗi đối song (palindromic). Để đảm bảo sự thống nhất giữa các phòng thí nghiệm, các mồi RADP có thể được mua từ một số nguồn khác nhau như University of British Colombia ( hoặc từ hãng Operon Biotechnologies ( Sản phẩm PCR có thể được điện di trên gel agarose 1.5-2.0 % agarose (nhuộm với ethidium bromide) hoặc polyacrylamide (nhuộm với AgNO3 hoặc sử dụng mồi gán nhãn phóng xạ hoặc huỳnh quang). Mặc dù mức độ phân giải thấp nhưng do tính đơn giản, nhanh và chỉ cần sử dụng điện di gel agarose rẻ hơn nên RADP được sử dụng phổ biến hơn AP-PCR và DAF Phần lớn các đoạn RAPD hình thành từ một locus nên 2 loại đa hình sẽ xuất hiện: (1) có hay không có băng và (2) độ đậm của băng. Vì độ đậm của băng có thể hình thành từ số copy hoặc số lượng của khuôn nên dựa theo độ đậm, người ta có thể phân biệt được cá thể trội đồng hợp tử với cá thể dị hợp tử. Tuy nhiên điều này không luôn luôn đúng vì độ đậm của băng còn phụ thuộc vào mức độ mismatch tại vị trí gắn mồi; do vậy nhiều tác giả không tính mức độ đậm nhạt của băng. RAPD: nhược điểm Tính lặp lại thấp. Do kỹ thuật dựa vào PCR nên nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả RADP: chất lượng và số lượng khuôn DNA, nồng độ MgCl2, Ta, nguồn Taq, nguồn máy PCR. Hậu quả là RADP có thể cho các dấu hiệu (+) giả hoặc (-) giả. Di truyền trội. Do các marker RAPD là marker của các allele trội nên không thể phân biệt được các các cá thể đồng hợp tử trội và các cá thể dị hợp tử. Tính cùng nguồn (homology) đôi khi không rõ. Do kết quả được thường được đánh giá dựa trên điện di agarose nên các nhược điểm của điện di agarose cũng cần tính đến. Chẳng hạn, nhìn chung, các băng DNA di chuyển cùng mức trên gel agarose thường được xem là cùng locus. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy ở các loài đa bội, các băng