Bài giảng Công nghệ gen thực vật

BÀI 2CÔNG NGHỆ GEN THỰC VẬT I. BIẾN NẠP THỰC VẬT VỚI PLASMID Ti CỦA Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens là VK Gram (-), tạo nên các nốt sần trên cây trồng khi bị nhiễm. Việc tạo nên các nốt sần chính là kết quả của việc chuyển đoạn T-DNA của plasmid Ti vào bộ gen tế bào thực vật. Tùy thuộc vào chủng VK chiều dài của T-DNA có thể thay đổi từ 12 – 24kb. ? Các chủng A. tumefaciens không có plasmid Ti có thể tạo nên các nốt sần hay không II. CÁC HỆ VECTOR CÓ NGUỒN GỐC TỪ plasmid Ti Cách đơn giản nhất để chuyển gen vào thực vật bằng plasmid Ti là gì? 1. Hạn chế của plasmid Ti Các phytohormon được hình thành sẽ ngăn cản tế bào tái sinh thành cây -> loại bỏ các gen tổng hợp auxin và cytokinin khỏi plasmid Gen tổng hợp opin không cần thiết cho Tv chuyển gen -> loại bỏ Plasmid Ti có kích thước lớn (200-800kb) -> loại bỏ các đoạn DNA không cần thiết Plasmid Ti không tái sinh ở E.coli -> gắn thêm một vị trí khởi động dùng trong E.coli. 2. Công nghệ DNA tái tổ hợp: Để khắc phục các hạn chế của plasmid Ti, người ta đã thiết kế một số các vector dựa trên plasmid Ti gồm có các thành phần sau: Gen đánh dấu chọn lọc (neomycin phosphotransferase: giúp kháng kanamycine) Vùng khởi đầu sao chép DNA Trình tự biên phải của vùng T-DNA Cầu nối đa vị (vùng nhân dòng đa vị) Các vector này thiếu các gen vir -> có 2 cách giải quyết: sử dụng hệ vector kép Sử dụng vector đồng cài nhập III. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT Chuyển gen nhờ A.tumefaciens có hiệu quả ở một số loài nhưng gặp khó khăn đối với thực vật 1 lá mầm (lúa, lúa mì, ngô) Quy trình thí nghiệm: Nhúng phôi ngô chưa chín vào huyền dịch tế bào VK trong vài phút Ủ vài ngày ở nhiệt độ phòng Chuyển phôi vào môi trường có chứa kháng sinh chọn lọc Nuôi các tế bào này trong bóng tối vài tuần Chuyển sang môi trương sinh trưởng khác, có ánh sáng để phát sinh cây. 1. Chuyển gen nhờ virus và phage: Sử dụng virus và phage làm vector chuyển gen ở tế bào động vật và vi khuẩn có kết quả cao, phage λ được sử dụng phổ biến nhất. Trong một số trường hợp còn sử dụng các virus để làm vector chuyển gen ở thực vật và động vật như CaMV, BPV, SV40….. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các virus đã bị mất khả năng sao chép nhưng vẫn còn khả năng xâm nhiễm. Nhược điểm của phương pháp này là: đoạn gen chuyển phải có kích thước ngắn, virus phải đảm bảo tuyệt đối an toàn. 2. Kỹ thuật siêu âm Kỹ thuật siêu âm được sử dụng để chuyển gen vào tế bào trần. Siêu âm làm cho DNA ngoại lai dễ xâm nhập vào bộ gen của tế bào vật chủ. 3. Kỹ thuật điện xung Dùng thiết bị điện xung (electroporation) tạo điện thế cao khoảng 500V/cm với khoảng thời gian 4-5 phần nghìn giây tạo nên các lỗ trên màng tế bào trần, làm cho DNA lạ bên ngoài có thể xâm nhập vào bộ gen của tế bào. 4. Kỹ thuật PEG Polyethylen glycol (PEG) là chất có ái lực lớn với nước. Khi ở nồng độ cao, PEG làm cho DNA dính vào màng nguyên sinh chất của tế bào, tiếp đó tế bào trần “nuốt” DNA trên màng theo cơ chế amip. 5. Kỹ thuật vi tiêm Kỹ thuật vi tiêm được sử dụng rộng rãi, là kỹ thuật dùng trực tiếp một lượng DNA nhỏ tiêm vào tế bào hoặc tiêm vào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi 4 – 8 tế bào. 6. Kỹ thuật bắn gen Hạt đạn hình cầu kích thước 0,4 – 1,2μm (bằng vàng hay volfram) được bọc bởi DNA. Gia tốc hạt lên tốc độ 300-600m/s bằng súng bắn gen (dùng Heli áp suất cao). Khi vào trong tb, DNA tách khỏi hạt và có thể cài nhập vào DNA của cây. 7. Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt Kỹ thuật này đơn giản, dễ thực hiện, thường sử dụng để chuyển gen cho vi khuẩn có hiệu quả cao. 8. Kỹ thuật sử dụng tia laser Một tia uv-laser bước sóng ngắn hội tụ trong đường truyền ánh sáng của một kính hiển vi lõm có thể tạo được các lỗ trên màng và vách tế bào nhận. 9. Kỹ thuật chuyển gen nhờ sợi silicon carbide Phương pháp này được coi như là phương pháp trung gian giữa chuyển gen nhờ súng DNA và vi tiêm. Sử dụng các sợi silicon carbide để khuấy chung với DNA biến nạp và tế bào đích. Các sợi silicon này đã tạo ra các lỗ thủng trên vách và màng tế bào, DNA xâm nhập vào trong tế bào thông qua các lỗ thủng này. 10. Kỹ thuật dung hợp liposome và tiêm liposome Gen đi vào trong tế bào thực vật phải đi qua màng, tại đó nồng độ của các nuclease cao vì vậy gen cần phải được bảo vệ bằng cách bao bọc trong liposome. Sau đó, liposome hoà lẫn vào trong màng của tế bào đích và đi vào trong tế bào chất. Một cách khác là tiêm liposome vào trong không bào. 11. Ủ tế bào, mô và cơ quan chung với DNA Phương pháp ủ các mô và tế bào đích chung với DNA là phương pháp dễ nhất và rẻ nhất. IV. SỬ DỤNG GEN CHỈ THỊ Ở CÁC TẾ BÀO THỰC VẬT BIẾN NẠP Khả năng phát hiện DNA ngọai lai được cài nhập vào bộ gen TV và xác định các tế bào biến nạp là rất quan trọng. Gen chỉ thị : - gen đánh dấu chọn lọc - các gen mà protein của chúng cho phản ứng dễ phát hiện. Nhược điểm: Sự có mặt của gen chỉ thị và sản phẩm của chúng có thể làm hư hại sản phẩm thương mại. Gen chỉ thị có thể ảnh hưởng đến chức năng bình thường của cây.