Bài giảng Các xét nghiệm trong Chẩn đoán trước sinh - Nguyễn Khắc Hân Hoan

1Các xét nghiệm trong Chẩn đoán trước sinh Nguyễn Khắc Hân Hoan Sức khỏe sinh sản và Di truyền người Khoa di truyền y học – Bệnh viện Từ Dũ Các bất thường bẩm sinh nặng  30% các bệnh lý phải nhập viện ở trẻ em  20% tử vong sơ sinh  50% tử vong ở trẻ em  Ảnh hưởng lên gia đình là không tính được  Chi phí cho các điều trị và chăm sóc cao  Chương trình phục hồi chức năng tốn kém 2Tần suất các bất thường bẩm sinh Loại bất thường % / tổng số sinh % / tổng số Btg Bất thường hình thái 3 60 Bệnh đơn gen 1,4 28 Rối loạn nhiễm sắc thể 0,6 12 Tổng số 5 100 Nguồn: Prenat Neonat Med 1999;4:157-164 Khuynh hướng xã hội  Kích thước gia đình nhỏ hơn trước  Tuổi làm mẹ tăng lên  Kiến thức của bệnh nhân tốt hơn  Sự kỳ vọng vào thai kỳ cao hơn  Phá thai được xã hội chấp nhận nhiều hơn  Chẩn đoán trước sinh ngày càng quan trọng 3Mục tiêu chẩn đoán di truyền trước sinh  Xác định chính xác tình trạng thai càng sớm càng tốt  Thông tin về tiên lượng, khả năng tái mắc ở thai sau  Tư vấn các lựa chọn cho thai kỳ  Chấm dứt thai kỳ  Điều trị trong tử cung Phương pháp sinh và chăm sóc chu sinh tối ưu Đối tượng chẩn đoán trước sinh  Tuổi làm mẹ cao ≥ 35 tuổi  Thai có bất thường đã được phát hiện  Đã có con bị bất di truyền (nhiễm sắc thể, gen)  Tiền sử gia đình  Bất thường nhiễm sắc thể  Bệnh lý gen  Khiếm khuyết ống thần kinh  Bất thường hình thái bẩm sinh  Có các yếu tố nguy cơ cao khác 4Nội dung chẩn đoán trước sinh  Tiền sử gia đình  Tuổi người mẹ khi mang thai  Marker siêu âm  Marker huyết học và sinh hóa  Thủ thuật chẩn đoán xâm lấn  Xét nghiệm nhiễm sắc thể và gen  Tư vấn trước sinh Tiền sử gia đình Tìm hiểu các nguy cơ có sẵn  Dị tật bẩm sinh: sứt môi, thừa ngón, bạch tạng  Bệnh đơn gen: thalassemia, hemophilia, Duchenne, SMA, Ethler Danlos, tăng cholesterol gia đình, chậm phát triển tâm thần  Hội chứng rối loạn NST: HC Down, Edwards, Di George  Cấp độ quan hệ bộ gen với thai phụ: 1, 2, 3 5Tuổi mẹ khi mang thai Khi tuổi mẹ  35, thai nhi có nguy cơ cao bị  Rối loạn di truyền • H/c Down (1 : 150 hay 0,67%) • Trisomy 18, Trisomy13, H/c Klinefelter (47,XXY), H/c Turner (45,X), • Các rối loạn khác thường gây ra sẩy thai tự nhiên hoặc thai chết lưu  DTBS: ống thần kinh, tim, đầu mặt, Tương quan Tuổi mẹ và Nguy cơ sinh con bất thường bẩm sinh> Nguồn: Thurmon TF (1999) A comprenhensive primer on med. genet. 6Tuổi mẹ khi mang thai Đa số thai phụ Việt Nam có tuổi dưới 35  70% H/c Down + các rối loạn khác : tuổi mẹ  35  30% các H/C Down : tuổi mẹ  35  Đừng quên nhóm thai phụ trẻ tuổi > = 35 tuổi 30% < 35 tuổi 70% Siêu âm 3 tháng đầu thai kỳ  Phát hiện DTBS giai đoạn sớm - Thai vô sọ - Holoprosencephaly - Tim ngoài lồng ngực - Thoát vị rốn  Khoảng mờ gáy (nuchal translucency measurement) • Siêu âm kiểm tra lúc 11 – 13 tuần 6 ngày • Tỉ lệ thuận với nguy cơ lệch bội NST: 21, 18, 13, X 3mm x 3 lần; 4mm x 18 lần; 5mm x 28 lần; 6mm x 36 lần • Kích thước tăng theo tuổi thai phải so sánh với kích thước thai (đường kính lưỡng đỉnh) Nguồn: Pandya PP, Nicolaides et al. (1995) Ultrasound Obstet Gynecol, 5:15-19 7Khoảng mờ gáy lớn – sàng lọc (+)  Khảo sát NST: karyotype, FISH • Trisomy 21, Trisomy 18 hoặc 13 • Monosomy X (45,X)  Kiểm tra bất thường hình thái lúc 18 tuần • Loạn sản bộ xương • Dị tật tim bẩm sinh • Thoát vị rốn • Thoát vị hoành 8Siêu âm 3 tháng giữa thai kỳ BV tuyến cuối BV tuyến trước SA thường qui <24 tuần 2679 (36.5%) 4648 (63.5%) Các dị tật được phát hiện 19/54 (35%) 8/64 (13%) Các loại dị tật Hệ TKTW 67% 40% Hệ niệu dục 50% 35% Sọ – mặt 50% 0% Hệ tiêu hóa 50% 0% Tim 18% 0% Cơ xương 25% 0% Nguồn: Crane JP, LeFevre ML, Winborn RC et al. Am J Obstet Gynecol 1994;171:392-399 Khả năng phát hiện các DTBS lớn ở thai bằng siêu âm Siêu âm 3 tháng giữa thai kỳ Marker Loại bất thường di truyền Dị tật tim Trisomy 13, 18, 21 Ngón tay chồng lên nhau Trisomy 18 Nang nước cổ, thai tích dịch H/c Turner Trisomy 13, 18, 21 Hẹp tá tràng Trisomy 21 Thoát vị rốn Trisomy 13, 18 Lòng bàn chân dầy Trisomy 18 TLTK: Mueller RF, Young ID (2002) Emery' s Elements of Medical Genetics, 11 edn. Churchill Livingstone, Sydney 9Marker Trisomy 21 trên âm thai 18 tuần  Nếp da gáy dầy > 6mm  Xương đùi ngắn: thực tế / lý tưởng < 0.91  Xương cánh tay ngắn  Dãn bể thận  Tâm thất lớn  Dấu hiệu mang dép sandal  Một động mạch rốn  Góc chậu rộng  Echo ruột dầy  Clinodactyly / thiểu sản đốt giữa ngón tay thứ 5  Có rãnh khỉ  Thất trái có ổ echo dầy 10 Giá trị các marker trisomy 21 / siêu âm quý 2 Dấu ấn Tần suất (n=420) Giá trị tiên đoán dương Nếp da gáy 15 (3,6%) 9/15 (60%) Xương cánh tay ngắn 16 (3,8%) 7/16 (44%) Bất thường cấu trúc 17 (4%) 7/17 (41%) Xương đùi ngắn 18 (4,3%) 4/18 (22%) Dãn bể thận 20 (4,7%) 4/20 (20%) Ngón tay thứ 5 13 (3,1%) 2/13(15,4%) Rốn có 2 mạch máu 3 (0,7%) 0/3 TLTK: Vintzileos AM, Campbell WA, et al. (1996) The use of second-trimester genetic sonogram in guiding clinical management of patients at increased risk for fetal trisomy 21. Obstet Gynecol, 87:948-952 Xét nghiệm triple test – quý 2 thai kỳ  uE3 + AFP + beta hCG tự do  Thai 14 – 21 tuần (15 – 18) tuần  Kết hợp tuổi mẹ + tiền sử  Nguy cơ cao ≥ 1/250  chọc ối, xét nghiệm NST hoặc gen 11 Xét nghiệm triple test – quý 2 thai kỳ Marker Thai Trisomy 21 MoM Trung bình KTC 95% MS-AFP 1140 0,73 0,71 – 0,75 uE3 613 0,73 0,70 – 0,76 beta-hCG tự do 477 2,30 2,13 – 2,49 hCG 850 2,02 1,91 – 2,13 TLTK: Cuckle H (2000) Biochemical screening for Down Syndrome. European Journal of Obstetrics and Gynaecology and Reproductive Biology 92:97-101 Xét nghiệm triple test – quý 2 thai kỳ Nhược điểm  Khả năng phát hiện 64%  Dương tính giả 5%  Độ chính xác phụ thuộc vào tuổi thai  Ít tin cậy khi song thai  Kết quả xác định cuối cùng tương đối trễ  Thai phụ có ít thời gian để quyết định nếu kết quả bất thường TLTK: Medical Services Advisory Committee (2002) Nuchal translucency measurement in the first trimester of pregnancy for screening of trisomy 21 and other autosomal trisomies., MSAC Conference 04 edn 12 Marker sinh hóa quý 1 thai kỳ Nghiên cứu Meta-analysis của 44 nghiên cứu khác nhau trong chẩn đoán Trisomy 21 Marker Trung bình (MoM) Marker Trung bình (MoM)   hCG tự do (n = 579) 1,98  PAPP-A (n = 439)  AFP (n = 243) 0,79  6 – 8 tuần 0,35  uE3 (n = 226) 0,74  9 – 1 1 tuần 0,40  12 – 14 tuần 0,2  > 14 tuần 0,94 TLTK: Cuckle H, van Lith JMM (1999) Appropriate biochemical parametters in first-trimester screening for Down syndrome. Prenatal Diagnosis 19:505-512 Khả năng sàng lọc Trisomy 21 của các marker Marker Độ nhạy (%) Thai 10 – 13 tuần (5% (+) giả) Khoảng mờ gáy (NT) 77 - 82 PAPP-A + beta hCG tự do (double test) 65 NT + PAPP-A + beta hCG tự do 86 NT + PAPP-A + beta-hCG tự do + AFP / uE3 87 NT + PAPP-A + beta hCG tự do+ AFP + uE3 88 Thai 16 – 20 tuần AFP + beta hCG + uE3 (triple test) 64 TLTK: Medical Services Advisory Committee (2002) Nuchal translucency measurement in the first trimester of pregnancy for screening of trisomy 21 and other autosomal trisomies., MSAC Conference 04 _ 13 Thủ thuật chẩn đoán trước  Sinh thiết gai nhau  Chọc ối  Chọc máu cuống rốn Chỉ định  Xét nghiệm nhiễm sắc thể  Phân tích chẩn đoán DNA  Các phân tích chẩn đoán Enzyme Sinh thiết gai nhau  Thai 11 - 13 tuần dưới siêu âm dẫn đường  Qua thành bụng hoặc qua ngã âm đạo  Khối lượng gai nhau lấy ~25mg  Tuổi thai nhỏ  Chấm dứt thai kỳ dễ  Thai phụ có nhiều thời gian để suy nghĩ  Có thể theo dõi xác định thêm  Khối lượng tế bào thu thập được nhiều 14 Sinh thiết gai nhau ngã âm đạo  Khối lượng gai nhau 25mg 15 Nhược điểm của sinh thiết gai nhau  Đòi hỏi sự khéo léo cao  Đôi khi có tình trạng khảm khu trú của bánh nhau  Tai biến  Sẩy thai: 1% sẩy thai do thủ thuật 2 – 3% sẩy thai nền / thai 10 - 12 tuần Phụ thuộc vào kỹ năng của thủ thuật viên  Biến chứng: tật ngắn chi ???  !? Bất đồng nhóm máu Rhesus Tình trạng khảm ở nhau Khảm: hiện diện nhiều dòng tế bào (bộ gen khác nhau) trong 1 cơ tổ chức 16 Dị tật ngắn chi sau sinh thiết gai nhau Nguy cơ bị tật ngắn chi trong cộng đồng là 1:2000 “WHO: Nguy cơ bị tật ngắn chi sẽ không tăng nếu thủ thuật được thực hiện bởi người có kinh nghiệm từ tuần lễ thứ 10 trở đi” Nguồn: WHO committee on CVS Safety. Lancet 1994;343:1420 WHO/PAHO Consultation on CVS (1999) Evaluation of chorionic villus sampling safety. Prenatal Diagnosis 19:97-99 Chọc hút dịch ối  Thai 16 – 20 tuần dưới siêu âm dẫn đường  Qua thành bụng  Dễ thực hiện, thuận lợi khi song thai  Nguy cơ sẩy thai do thủ thuật: thấp, 0,5% / Tỉ lệ sẩy thai nền ~1%  Có thể khảo sát các marker sinh hóa trong dịch ối  Nhược điểm  Chẩn đoán khi tuổi thai trễ  Khối lượng tế bào thu thập được nhiều 17  Thực hiện ở thai từ 18 tuần  Chẩn đoán nhanh và điều trị thai  Xét nghiệm • Huyết học: huyết đồ, nhóm máu, Coombs • Di truyền: NST, gen • Sinh hóa: enzyme, điện di Hb Tai biến  Nhịp tim thai chậm / suy thai  Sẩy thai tự nhiên, sinh non, thai chết lưu Tỉ lệ sẩy thai 1 - 2% trên nền tỉ lệ cơ bản Chọc máu cuống rốn 18 Siêu âm định tuổi thai (8 – 10 TUẦN) Sàng lọc 11 - 13 tuần Đo độ mờ da gáy ± Xét nghiệm máu Sinh thiết gai nhau (11 – 13 tuần) Triple test (15 – 18 tuổiI) Chọc ối (15 – 19 TUẦN) Lấy máu cuống rốn (18 – 20 tuần) Siêu âm kiểm tra (>18 tuần) THỤ THAI SINH Xét nghiệm nhiễm sắc thể  Bệnh phẩm: tế bào dịch ối, gai nhau, máu thai  Các phương pháp xét nghiệm Karyotype Tiêu chuẩn vàng, toàn bộ NST 2 – 3 tuần, home brew FISH Nhanh, > 24 giờ, IVD Nhiều công, thủ công QF-PCR Nhanh, hàng loạt, KLg mẫu ít, IVD Nguy cơ ngoại nhiễm DNA MLPA Nhanh, hàng loạt Tam bội (-), không có IVD Array CGH Toàn bộ NST, phát hiện được mức độ nhỏ Đắt tiền, chưa đủ thông tin 19 Xét nghiệm NST - Karyotype Xét nghiệm NST - FISH 20 Xét nghiệm NST – QF-PCR Xét nghiệm NST – MLPA 21 Xét nghiệm gen tìm đột biến  Thalassemia  Duchenne  Hemophilia  Hội chứng Di George  Các bệnh khác Xét nghiệm thalassemia  Bệnh thalassemia • GIẢM / KHÔNG tổng hợp chuỗi GLOBIN để tạo HEMOGLOBIN • Thiếu máu tan huyết nặng • Bệnh đơn gen phổ biến nhất • Di truyền gen lặn theo quy luật Mendel  Alpha thalassemia & Beta thalassemia: phổ biến nhất 22 Alpha Thalassaemia 3’ 30kb20kb10kb-40kb 0 2 1 2 1 12  3’HVRInter  HVR 40kb HS40 5’ (/) Người bình thường (--/--) Phù thai, thai chết lưu trong tử cung (--/-) Bệnh Hb H, thiếu máu nặng (--/ ; -/-) thiếu máu nhẹ, truyền bệnh cho thế hệ sau (-/) Người lành mang gene bệnh Beta thalassaemia Exon 1 Exon 2 Exon 3IVS-1 IVS-2 5’ 3’ -28 cd17A>T Cd26G>A IVS1- 1G>T Cd4142-TCTT Cd7172+A Cd95+A IVS2-654 Các đột biến gen beta thalassemia phổ biến ở Việt Nam / Người bình thường Không biểu hiện lâm sàng Thiếu máu nhẹ Hồng cầu nhỏ và nhược sắc MCH < 28 pg, MCV < 80fL TRUYỀN BỆNH CHO THẾ HỆ SAU Thiếu máu nặng Khởi bệnh sớm Điều trị phức tạp & tốn kém: truyền máu, cắt lách, thải sắt, ghép tủy TỬ VONG KHI CÒN TRẺ /M Đột biến 1 gen M/M Đột biến 2 gen 23 Thalassemia - Kiểu Di Truyền Giao tử N / M N / M N : normal – M : mutated N M N M N / M N / M M / MN / N N/M : mang gene bệnh, nhưng không bệnh N/N : người bình thường M/M : biểu hiện bệnh Người mang 1 gen bệnh:  Thiếu máu: hồng cầu nhỏ, nhược sắc MCV < 80fL, MCH < 28pg không biểu hiện lâm sàng không cần điều trị  Có thể có con bị thalassemia nặng nếu lấy người mang 1 gene bệnh 24 Phân bố thalassemia Nguồn: WHO (1983) Community control of hereditary anaemias. Bulletin of the World Health Organization, 61: 63-80; Hoan NKH (2005) Thalassaemia and a model of prevention in Vietnam. Master thesis. Sydney Uni. WHO 1983: thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng của thế giới Tần suất cao ở các vùng sốt rét  Chống sốt rét Hiện bệnh lưu hành khắp nơi do di dân 269 triệu người mang một gen bệnh (carriers) 160.000 sơ sinh mắc bệnh mỗi năm, hầu hết ở vùng Đông Nam Á VIỆT NAM 5,1 triệu người mang gen bệnh 1700 trẻ sơ sinh mỗi năm bệnh Phương pháp sàng lọc  Sàng lọc tình trạng mang gen thalassemia ◦ Xác định thiếu máu nhược sắc: XN huyết đồ ◦ Loại trừ do thiếu sắt: XN Ferritin ◦ Định hướng loại bệnh thalassemia: Điện di hemoglobin Sàng lọc dương tính khi  MCV < 80fl hoặc MCH < 28pg  Ferritin bình thường  Tỉ lệ hemoglobin bất thường, hoặc có sự hiện diện của loại hemoglobin bất thường 25 Phương pháp chẩn đoán  Chẩn đoán trước sinh tìm đột biến gen thalassemia Chỉ thực hiện khi sàng lọc dương tính  Kỹ thuật ◦ Sử dụng các kỹ thuật dựa trên phương pháp PCR  beta thalassemia: multiplex ARMS-PCR, giải trình tự DNA  alpha thalassemia: gap-PCR, enzyme giới hạn, MLPA MLPA: Phân tích định lượng gen alpha globin phát hiện đột biến Alpha thalassemia, tương ứng với kiểu gen đột biến Thai/N THAI deletion 26 MLPA: Phát hiện đột biến ALPHA thalassemia cho thấy thai có kiểu gen đột biến SEA/DUCTH2  tiên lượng bệnh Hb Bart’s (phù thai và nhau). 16 p1 3, 6 0 Kb te lo m er ic o f H S4 0 H S- 40 H S- 40 9. 3 kb u ps tre am H BZ 3. 5 kb u ps tre am H BZ Be tw ee n H BZ a nd H BZ P Be tw ee n H BZ a nd H BZ P Be tw ee n H BA 2P a nd H BA 1P Be tw ee n H BA 1P a nd H BA 2 Be tw ee n H BA 1P a nd H BA 2 Be tw ee n H BA 1P a nd H BA 2 Be tw ee n H BA 1P a nd H BA 2 H BA 1 +H BA 2 e xo n 1 H BA 2 in tro n 2 H BA 2 in tro n 2 H BA 1+ H BA 2 ex on 3 En d of H BA 2 ex on 3 Be tw ee n H BA 2 an d H BA 1 Be tw ee n H BA 2 an d H BA 1 Be tw ee n H BA 2 an d H BA 1 Be tw ee n H BA 2 an d H BA 1 0. 2 kb d ow ns tre am H BA 1 0. 5 kb d ow ns tre am H BA 1 2. 4 kb d ow ns tre am H BA 1 3. 7 kb d ow ns tre am H BA 1 c c c c c c c c c c c c0 0.5 1 1.5 2 Mapview Location Ra tio THAI deletion SEA deletion Tình huống 1  Hà (nữ): ◦ MCV 66.8 ◦ MCH 21.5 ◦ Ferritin 164.8 ◦ Hb A2 6.1 ◦ Hb E 0 ◦ Hb F 2.8  Ngọc (nam): MCV 78.0 MCH 26.3 Ferritin 164.8 Hb A2 2.8 Hb E 24.4 Hb F 0 Codon 17AAGTAG/wt HbE/wt Thai Codon 17AAGTAG/HbE 27 Tình huống 2  Hà (nữ): ◦ MCV 73.3 ◦ MCH 22.1 ◦ Ferritin 164.8 ◦ Hb A2 2.3 ◦ Hb E 0 ◦ Hb F 2.3  Sành (nam): MCV 64.5 MCH 21.2 Ferritin 45.2 Hb A2 2.3 Hb E 0 Hb F 0 --SEA/wt --SEA/wt Thai --SEA/--SEA Xét nghiệm Duchenne  Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy, DMD) là một bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính.  Bệnh DMD chiếm tỷ lệ cao nhất trong số nhóm bệnh di truyền về thần kinh cơ (1/3500 trẻ trai).  Nhược cơ xuất hiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiến triển nhanh, mất khả năng đi lại và chết ở lứa tuổi 20 do vì tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp. Bệnh nhân DMD Người bình thường 28 Bệnh Duchenne (DMD) Các vùng cơ bị loạn dương & teo đi trong bệnh DMD Xin cám ơn !