Áp dụng phương pháp vntr – miru nh kiểu gene các chủng mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam

~ 1 ~ …………………………………………………………………………………………………. LỜI MỞ ĐẦU Y văn nhân loại đã ghi nhận sự tồn tại của bệnh lao từ thời cổ đại, lịch sử bệnh lao là lịch sử ghi lại những thách thức trong khoa học và y khoa. Bệnh lao vẫn đang là vấn đề nhức nhối cho sức khoẻ từng cá nhân và cộng đồng. Theo thống kê của WHO, hằng năm trên thế giới trung bình 8 triệu người bệnh lao mới được phát hiện, trong số đó 2 đến 3 triệu người chết vì lao. Năm 1993, WHO tuyên bố lao là vấn đề cấp bách trên toàn cầu. Cùng với HIV và sốt rét, lao là một trong những nguồn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất. Lao thật sự là gánh nặng y tế ở những nước đang phát triển, nhất là trong tình hình các chủng mycobacteria kháng thuốc trị lao ngày càng nhiều. Nhiều bệnh nhân lao mắc thêm HIV và nhiều bệnh nhân HIV nhiễm thêm bệnh cơ hội như lao; khi số lượng tế bào CD4 giảm từ 500 đến 250/mm3, nguy cơ nhiễm lao tăng từ 10 đến 30 lần (23). Chính tình hình cấp bách này đòi hỏi cộng đồng thế giới tìm ra chiến lược phòng chống lao đồng bộ và hiệu quả hơn. Bệnh lao là do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra. Từ sự phổ biến của một chủng lao ở Bắc Kinh (Trung Quốc), chủng lao ở New York có liên hệ mật thiết với kháng đa thuốc, vi khuẩn lao kiểu gene Beijing đã thu hút sự chú ý trong giới nghiên cứu khoa học cận lâm sàng. Số liệu thống kê cho thấy kiểu gene Beijing (chiếm 37% trong tổng số mẫu vi khuẩn phân lập tại Việt Nam) có thể có liên hệ với tính kháng thuốc (14), có thể là nhân tố góp phần vào tỉ lệ kháng thuốc cao trong thời gian dài, mặc dù Chương trình chống lao Quốc gia của Việt Nam đã được thiết lập và đưa vào hoạt động tốt từ vài thập kỉ qua. Kiểu gene Việt Nam, một kiểu gene trong nhóm Indo-Oceanic, chiếm khoảng 20% tổng số mẫu, không thể được phân biệt rạch ròi bằng các kỹ thuật định kiểu gene đang được áp dụng ở Việt Nam hiện nay. Kĩ thuật IS6110 – RFLP được sử dụng như kĩ thuật chuẩn định kiểu gene M.tuberculosis, nhưng không thể phân biệt các kiểu gene trong dòng Indo-Oceanic do bản chất những M.tb kiểu gene này có ít các bản sao IS6110. Spoligotyping là kĩ thuật định kiểu gene nhanh, đơn giản nhưng không thể phân biệt các chủng trong họ ~ 2 ~ …………………………………………………………………………………………………. Beijing. Như vậy cần có sự tìm tòi, áp dụng và phát triển một kĩ thuật có khả năng phân giải tốt để phân biệt các chủng vi khuẩn lao có nguồn gốc châu Á này. Kĩ thuật VNTR áp dụng trên 31 loci cho thấy một số dấu ấn sinh học có mức độ đa hình cao trên quần thể Nhật Bản (tổng số mẫu trong quần thể là 235 chủng, trong đó có 185 chủng là kiểu gene Beijing) (17), cho thấy khả năng áp dụng như kĩ thuật để phân tách kiểu gene trong tập hợp chủ yếu gồm họ Beijing và kiểu gene địa phương Việt Nam. Chiến lược lâu dài cho sự áp dụng và phát triển các kĩ thuật định kiểu gene phân tách chủng vi khuẩn lao có nguồn gốc châu Á: Trên 450 mẫu lâm sàng đã thu nhận được tại Tp Hồ Chí Minh, kĩ thuật VNTR – MIRU trên 31 loci được tối ưu hoá các điều kiện thí nghiệm như nhiệt độ bắt cặp, nồng độ mồi… Từ những thông tin đó, nhận diện những loci mang tính đa hình cao và áp dụng lên tập hợp mẫu lớn thu thập từ Chương trình chống lao Quốc gia được thu nhận theo chiến lược phân tầng rồi bốc ngẫu nhiên, rút ra 100 mẫu tiêu biểu đại diện toàn bộ tập hợp mẫu cho dự án giải toàn bộ bộ gene. Mục tiêu đề tài Một phần trong chiến lược lâu dài đó, phạm vi luận văn để giải quyết việc áp dụng kĩ thuật VNTR - MIRU với 31 loci trên 95 mẫu đại diện đầu tiên trong tập hợp mẫu thu nhận được tại Tp HCM để hoàn thiện phương pháp trong điều kiện áp dụng phòng thí nghiệm tại địa phương, loại bỏ những loci không có tính đa dạng, tìm kiếm những loci cho thông tin ổn định mà vẫn mang tính phân biệt giữa các chủng trong họ Beijing và Việt Nam: - Tiến hành tối ưu hoá 31 PCR với các bộ mồi gắn màu - Điều chỉnh các điều kiện điện di mao quản trên hệ thống máy DNA analyzer Applied Biosystems Inc. 3130xl - Thiết lập qui trình xử lí thông tin bằng phần mềm GeneMapper v3.0 - Phân tích độ tương đồng kiểu gene giữa các chủng bằng phần mềm BioNumerics v4.0 (Applied Maths, Belgium) ~ 3 ~ …………………………………………………………………………………………………. - Đánh giá độ đa dạng allele trên từng vị trí loci theo chỉ tiêu PIC, khả năng phân biệt các chủng theo chỉ tiêu HGI bằng các cách phối hợp loci khác nhau. - Kết luận những loci, những cách kết hợp loci nào đủ khả năng để phát triển nghiên cứu trên một diện mẫu lớn hơn, có tính đại diện và đa dạng cao hơn Tính cấp thiết, ý nghĩa lí luận, và thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu này đóng góp vào quá trình tìm hiểu sinh bệnh học phân tử và cơ chế gây độc do vi khuẩn lao M.tuberculosis. Trước đây vài thập kỉ người ta cho rằng vi khuẩn lao rất đồng nhất về mặt di truyền học, những kết quả phân tích kiểu gene bằng phương pháp VNTR – MIRU cho thấy việc phân biệt kiểu gene M.tb là vấn đề hoàn toàn khả thi. Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử bệnh viện lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch cho thấy mối liên hệ giữa tính kháng thuốc và sự nhiễm phổ biến ở các thanh niên 15-24 tuổi(8). Việc áp dụng phương pháp định kiểu gene sẽ giúp phân tách các nhóm nhỏ có thể có mối liên hệ nhân quả với những độc tính này, tạo thuận lợi cho các nghiên cứu cơ bản xa hơn. Các chủng vi khuẩn lao thường được nhắc đến như BCG (chủng được sử dụng làm ra vaccine), H37Rv (chủng vi khuẩn lao thường được dùng như chủng chứng trong phòng thí nghiệm) đều có kiểu gene nguồn gốc châu Âu. Trong khi đó, các M.tb kiểu gene Beijing gần đây cho thấy có mối liên hệ với độc tính cao lại có kiểu gene nguồn gốc châu Á. Việc phân giải tốt M.tb kiểu gene Beijing là nền tảng cho việc hiểu rõ đáp ứng vaccine với việc ngăn ngừa nhiễm các loại kiểu gene gây bệnh khác nhau. Bên cạnh đó, các nghiên cứu sự tương tác giữa kiểu gene vật chủ và kiểu gene tác nhân gây bệnh đòi hỏi độ phân giải chi tiết kiểu gene M.tb nhờ phương pháp VNTR - MIRU.