Ảnh hưởng cửa nước dừa và sucroza lên sự tăng sinh mô sẹo và sự hình thành phôi vô tính ở loài lan hồ điệp [phalaenopsis amabilis (l.) blume] - Dương Tuấn Nhựt

77 31(1): 77-84 T¹p chÝ Sinh häc 3-2009 ¶NH H¦ëNG CñA N¦íC DõA Vµ SUCROZA L£N Sù T¡NG SINH M¤ SÑO Vµ Sù H×NH THµNH PH¤I V¤ TÝNH ë LOµI LAN Hå §IÖP [PHALAENOPSIS AMABILIS (L.) BLUME] D¦¥NG TÊN NHùT, HåNG NGäC TR¢M, NGUYÔN PHóC HUY, §INH V¡N KHI£M ViÖn Sinh häc T©y Nguyªn Trong nhiÒu n¨m qua, loµi lan hå ®iÖp Phalaenopsis amabilis (L.) Blume (hä Lan - Orchidaceae) lu«n ®−îc xem lµ lo¹i hoa c¾t cµnh vµ c©y hoa trång chËu quan träng. Nhê vÎ ®Ñp sang träng vµ quyÕn rò mµ loµi hoa nµy th−êng ®−îc −u tiªn trang trÝ trong nh÷ng dÞp lÔ héi trang träng. Gi¸ trÞ kinh tÕ cña lan hå ®iÖp rÊt lín nh−ng hiÖn nay nhu cÇu vÒ c©y gièng vÉn ch−a ®−îc ®¸p øng vÒ chÊt l−îng còng nh− sè l−îng. ë hÇu hÕt c¸c gièng lan, rÊt dÔ x¶y ra biÕn dÞ nªn viÖc gieo h¹t kh«ng thÓ t¹o ®−îc mét sè l−îng lín c©y con cã tÝnh ®ång nhÊt [1]. V× vËy, viÖc ¸p dông ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh ®Ó s¶n xuÊt c©y con ®ång nhÊt vÒ mÆt di truyÒn ®−îc thùc hiÖn. Khã kh¨n lín nhÊt trong nh©n gièng v« tÝnh lan hå ®iÖp lµ nguån mÉu rÊt h¹n chÕ do chóng lµ lo¹i c©y ®¬n th©n. NÕu sö dông chåi ®Ønh ®Ó nu«i cÊy nh− nhiÒu loµi lan kh¸c sÏ lµm tæn th−¬ng c©y mÑ [6]. H¬n n÷a, lan hå ®iÖp th−êng tiÕt nhiÒu hîp chÊt phenol tõ vÕt c¾t ra m«i tr−êng nu«i cÊy, g©y ®éc cho mÉu m« [2]. Gavino Rotor lµ ng−êi ®Çu tiªn thµnh c«ng trong viÖc nh©n gièng v« tÝnh in vitro c©y lan hå ®iÖp [15]. ¤ng ®d sö dông c¸c ®o¹n ph¸t hoa mang chåi dµi kho¶ng 2 cm ®Ó nu«i cÊy trªn m«i tr−êng Knudson C. Sau ®ã, nh÷ng nhµ nghiªn cøu kh¸c ®d t¹o ra nhiÒu quy tr×nh míi dùa theo ph−¬ng ph¸p nµy [5, 16]. Intuwong vµ Sagawa (1974) cho r»ng −u ®iÓm chÝnh cña ph−¬ng ph¸p nµy lµ c©y mÑ kh«ng bÞ tæn th−¬ng [6]. Tuy nhiªn, ph−¬ng ph¸p t¸i sinh chåi tõ ph¸t hoa cho hÖ sè nh©n rÊt thÊp, kh«ng ®¸p øng ®ñ nhu cÇu c©y gièng cho thÞ tr−êng. GÇn ®©y, mét sè ph−¬ng ph¸p nh©n gièng v« tÝnh lan hå ®iÖp th«ng qua thÓ gièng mÇm rÔ (PLB) ®d ®−îc thùc hiÖn thµnh c«ng. C¸c PLB cã thÓ ®−îc thu nhËn trùc tiÕp tõ viÖc nu«i cÊy m« l¸, chãp rÔ [16, 17], nèt ph¸t hoa [3] hoÆc toµn bé c©y con in vitro [18]. HÇu hÕt c¸c ph−¬ng ph¸p nµy ®Òu t¹o ®−îc nguån PLB rÊt thÊp vµ cÇn nhiÒu thêi gian ®Ó t¨ng sinh PLB. Kü thuËt nu«i cÊy trong b×nh ph¶n øng sinh häc (bioreactor) còng ®d ®−îc øng dông ®Ó t¨ng sinh PLB hiÖu qu¶ [13]; tuy nhiªn, thêi gian t¨ng sinh dµi sÏ dÔ x¶y ra biÕn dÞ h×nh th¸i trªn c©y gièng. Nh− vËy, yªu cÇu ®Æt ra lµ t¹o ®−îc sè l−îng lín PLB trong thêi gian ng¾n ®Ó ®¹t hiÖu qu¶ nh©n gièng cao. §Ó gi¶i quyÕt nh÷ng khã kh¨n trªn, chóng t«i nghiªn cøu sù h×nh thµnh ph«i v« tÝnh ë lan hå ®iÖp ®Ó øng dông trong nh©n gièng v« tÝnh lo¹i lan nµy. Trong bµi b¸o nµy, ¶nh h−ëng cña n−íc dõa vµ sucroza lªn sù t¨ng sinh cña m« sÑo (embryogenic callus) vµ sù ph¸t sinh cña ph«i v« tÝnh gi¸n tiÕp ë lan hå ®iÖp ®−îc nghiªn cøu. Ngoµi ra, mét khi kh¶ n¨ng quang hîp cña c©y con in vitro cã thÓ ®iÒu khiÓn ®−îc vµ nÕu chóng cã kh¶ n¨ng sinh tr−ëng quang tù d−ìng th× tû lÖ sèng sãt cã thÓ ®−îc c¶i thiÖn ®¸ng kÓ trong suèt qu¸ tr×nh thÝch nghi. Mét trong nh÷ng gi¶i ph¸p cho vÊn ®Ò nµy lµ t¨ng c−êng kh¶ n¨ng quang hîp cña c©y con in vitro b»ng viÖc lµm cho hÖ thèng nu«i cÊy cã kh¶ n¨ng trao ®æi khÝ, cung cÊp thªm CO2, gi¶m ®é Èm vµ h¹ thÊp nång ®é sucroza. Nh÷ng nghiªn cøu nu«i cÊy quang tù d−ìng trªn c¸c ®èi t−îng c©y tr−íc ®©y kh«ng sö dông sucroza trong m«i tr−êng nu«i cÊy ch−a thu ®−îc thµnh c«ng [8]. Kozai vµ Iwanami [11] ®d thµnh c«ng trong viÖc ph¸t triÓn mét hÖ thèng b»ng c¸ch t¨ng c−êng ®ång thêi nång ®é CO2 vµ c−êng ®é ¸nh s¸ng. Tuy nhiªn, thµnh phÇn nguyªn vËt liÖu cña b×nh nu«i 78 cÊy (tetrafluoroethylene perfluoroalkyl vinyl ether copolymer hay tetrafluoro-ethylene hexafluoropropylene copolymer) vÉn rÊt ®¾t tiÒn. Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i sö dông p«-ly-ª-ty-len (PE), mét d¹ng ni-l«ng th«ng th−êng, ®Ó thiÕt kÕ hÖ thèng nu«i cÊy (hÖ thèng NF). HÖ thèng nµy cã kh¶ n¨ng trao ®æi khÝ tèt vµ cã gi¸ thµnh rÎ (0,003-0,005 USD/tói), v× vËy chóng cã kh¶ n¨ng øng dông cao trong nh©n gièng th−¬ng m¹i. Ngoµi ra, hÖ thèng nµy cßn cã mét sè ®Æc ®iÓm thuËn lîi cho sù sinh tr−ëng, ph¸t triÓn cña c©y còng nh− c¶i thiÖn chØ sè quang hîp cao h¬n so víi hÖ thèng nu«i cÊy truyÒn thèng (hÖ thèng C), gióp n©ng cao chÊt l−îng cña c©y gièng lan hå ®iÖp. I. PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU 1. Nguyªn liÖu Nh÷ng ph¸t hoa võa në hoa cña c©y lan hå ®iÖp tr−ëng thµnh trång trong nhµ l−íi ®−îc thu nhËn; chän c©y kháe m¹nh cho hoa ®Ñp lµm mÉu cÊy ®Ó t¹o chåi. C¾t ph¸t hoa thµnh tõng ®o¹n dµi 5 cm mang mét chåi bªn ë gi÷a ®o¹n. Röa s¹ch mÉu, xö lý víi cån 70o trong 30 gi©y, sau ®ã khö trïng ph¸t hoa víi HgCl2 0,1% trong 10 phót. Sau khi khö trïng, c¾t ph¸t hoa thµnh ®o¹n dµi 1,5 cm mang chåi bªn gi÷a ®o¹n vµ cÊy vµo m«i tr−êng 1/2 MS [12] (m«i tr−êng MS cã thµnh phÇn kho¸ng ®a l−îng vµ vi l−îng gi¶m cßn 1/2) cã bæ sung 0,5 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 20% (v/v) n−íc dõa vµ 9 g/l th¹ch ®Ó nghiªn cøu sù t¹o chåi. Sau 2 th¸ng, c¸c l¸ in vitro dµi 2 cm ®−îc thu tõ viÖc nu«i cÊy c¸c ®o¹n ph¸t hoa ®−îc sö dông lµm mÉu cÊy ®Ó nghiªn cøu kh¶ n¨ng t¹o PLB. C¾t l¸ thµnh 6 m¶nh nhá, nu«i cÊy mÉu l¸ trªn m«i tr−êng MS cã bæ sung 1 mg/l NAA, 10 mg/l BA, 20% (v/v) n−íc dõa vµ 9 g/l th¹ch ®Ó t¹o PLB. Sau 8 tuÇn sÏ thu ®−îc kho¶ng 15 PLB tõ 6 mÉu l¸ ®Æt cÊy ban ®Çu. C¸c PLB nµy ®−îc sö dông lµm vËt liÖu ®Ó t¹o m« sÑo. Sö dông m«i tr−êng MS cã bæ sung 0,1 mg/l BA; 0,01 mg/l 2,4-D; 0, 20, 40% (v/v) n−íc dõa vµ 30 g/l sucroza (lÇn l−ît t−¬ng øng víi c¸c m«i tr−êng C0, C1 vµ C2). C¸c PLB t¸i sinh tõ m« l¸ in vitro sÏ ®−îc c¾t ®«i vµ ®Æt óp trªn m«i tr−êng. Sau 8 tuÇn, ghi nhËn kÕt qu¶ vÒ kh¶ n¨ng h×nh thµnh m« sÑo cña c¸c mÉu PLB nu«i cÊy. §Ó kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña n−íc dõa vµ sucroza lªn sù t¨ng sinh cña m« sÑo vµ ph¸t sinh ph«i v« tÝnh, m« sÑo sÏ ®−îc nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr−êng MS cã bæ sung 2 mg/l BA kÕt hîp víi 0,5 mg/l NAA; 1 g/l than ho¹t tÝnh; 20% (v/v) n−íc dõa vµ 0, 30, 60 g/l sucroza (lÇn l−ît t−¬ng øng víi c¸c m«i tr−êng C3, C4 vµ C5). Sau ®ã, c¸c PLB ®−îc c¶m øng t¹o thµnh tõ ph«i v« tÝnh. Hai mÉu ph«i v« tÝnh 10 tuÇn tuæi ®−îc nu«i cÊy trªn m«i tr−êng phï hîp nhÊt (cã träng l−îng t−¬i 0,25 ± 0,05 g) ®−îc cÊy vµo m«i tr−êng cã thµnh phÇn t−¬ng tù trong tói ni-l«ng vµ b×nh thñy tinh. PLB thu ®−îc sau 1,5 th¸ng vµ 3 th¸ng nu«i cÊy. §Ó t¸i sinh c©y con, nh÷ng PLB mµu xanh ®−îc chuyÓn sang m«i tr−êng Hyponex 3 g/l (6,5 N - 6 P - 19 K; Hyponex corporation, Marysville, Ohio 43041 U.S.A.) cã bæ sung 0,5 mg/l IBA, 2 mg/l BA, 30 g/l ®−êng sucrose, 15% (v/v) n−íc dõa vµ 9 g/l th¹ch; ®iÒu chØnh ®é pH cña m«i tr−êng vÒ 5,3. 10 PLB (cã ®−êng kÝnh 1,20 ± 0,05 mm) ®−îc cÊy vµo m«i tr−êng trong tói ni-l«ng vµ b×nh thñy tinh. C¸c c©y con thu ®−îc sau 3 th¸ng nu«i cÊy ®−îc chuyÓn ra trång ë v−ên −¬m. TÊt c¶ c¸c m«i tr−êng ®−îc lµm ®Æc víi 9 g/l th¹ch, chØnh ®é pH cña m«i tr−êng vÒ 5,7; riªng m«i tr−êng t¸i sinh c©y tõ PLB cã ®é pH 5,3. M«i tr−êng ®−îc hÊp khö trïng ë nhiÖt ®é 121oC, 1 atm trong 35 phót. 2. Ph−¬ng ph¸p Chóng t«i bè trÝ 6 nghiÖm thøc ®Ó kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña n−íc dõa vµ sucroza lªn kh¶ n¨ng t¨ng sinh vµ ph¸t sinh ph«i cña m« sÑo lan hå ®iÖp. ThÝ nghiÖm ®−îc lÆp l¹i 3 lÇn, mçi lÇn sö dông 10 b×nh thñy tinh vµ mçi b×nh thñy tinh ®−îc cÊy 70 mg m« sÑo. Sau 4 tuÇn, 5 tuÇn vµ 11 tuÇn, träng l−îng t−¬i m« sÑo vµ h×nh th¸i cña ph«i h×nh thµnh trªn c¸c m«i tr−êng ®−îc ghi nhËn. ThÝ nghiÖm ®èi víi lan hå ®iÖp ®−îc lÆp l¹i 3 lÇn; kÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®−îc ph©n tÝch b»ng Duncan’s test (Duncan, 1995) víi a = 0,05. S¬ ®å tãm t¾t thÝ nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë h×nh 1. 79 H×nh 1. S¬ ®å tãm t¾t quy tr×nh thÝ nghiÖm a1, a2, a3. t¹o l¸ in vitro tõ ph¸t hoa; b1, b2, b3. t¹o PLB tõ l¸ in vitro; c1, c2, c3, c4. t¹o m« sÑo tõ PLB; e. t¨ng sinh m« sÑo; f. t¹o PLB tõ m« sÑo; g. t¸i sinh c©y con tõ PLB; h. chuyÓn c©y con ra v−ên −¬m. II. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 1. Sù t¨ng sinh cña m« sÑo lan hå ®iÖp a. ¶nh h−ëng cña n−íc dõa lªn sù t¨ng sinh cña m« sÑo lan hå ®iÖp N−íc dõa lµ nguån dinh d−ìng dåi dµo, cung cÊp nguån ®¹m (tõ nhiÒu lo¹i acid amin, axit h÷u c¬) vµ cacbohydr¸t (nh− glucoza, fructoza, sucroza). Ngoµi ra, trong n−íc dõa, cßn chøa mét sè chÊt ®iÒu hoµ sinh tr−ëng, ®−îc biÕt ®Õn nhiÒu nhÊt lµ zeatin [1]. Do vËy, n−íc dõa th−êng ®−îc bæ sung vµo m«i tr−êng nu«i cÊy lan ®Ó ®¹t hiÖu qu¶ mong muèn. Trong tr−êng hîp nµy, n−íc dõa ®−îc bæ sung vµo m«i tr−êng nu«i cÊy m« sÑo ë nång ®é 20% (v/v), gióp t¨ng sinh m« sÑo hiÖu qu¶; 70 mg m« sÑo ban ®Çu sÏ t¹o ®−îc 1286 mg sau 4 tuÇn (b¶ng 1). B¶ng 1 ¶nh h−ëng cña n−íc dõa lªn sù t¨ng sinh cña m« sÑo lan hå ®iÖp sau 4 tuÇn M«i tr−êng N−íc dõa (% v/v) Träng l−îng t−¬i cña m« sÑo (mg) C0 – 498,3c* C1 20 1286,0a C2 40 532,9b Ghi chó: *. Nh÷ng mÉu tù kh¸c nhau ®−îc nªu trong c¸c cét trªn biÔu diÔn sù kh¸c nhau cã ý nghÜa víi a = 0,05 trong Duncan’s test. Khi kh«ng bæ sung n−íc dõa vµo m«i tr−êng, m« sÑo cña lan hå ®iÖp t¨ng sinh chËm; mét sè hãa n©u vµ chÕt. Nh− vËy, m« sÑo cña lan hå ®iÖp cÇn n−íc dõa cung cÊp nguån ®¹m vµ cacbohydr¸t ®Ó t¨ng sinh. KÕt qu¶ nµy phï hîp víi nghiªn cøu cña mét sè t¸c gi¶ tr−íc ®ã [10]. Trªn m«i tr−êng chøa 40% (v/v) n−íc dõa, m« sÑo t¨ng sinh chËm, mét sè m« sÑo ho¸ n©u trªn m«i tr−êng. Nh− vËy, trong m«i tr−êng cã bæ sung 40% (v/v) n−íc dõa, cã thÓ ®d cung cÊp 80 hµm l−îng ®¹m vµ cacbohydr¸t cao, do ®ã kh«ng phï hîp cho m« sÑo cña lan hå ®iÖp t¨ng sinh. Hµm l−îng ®¹m vµ cacbohydr¸t cao trong m«i tr−êng sÏ øc chÕ sù t¨ng sinh cña m« sÑo; hµm l−îng cacbohydr¸t cao lµm t¨ng ¸p suÊt thÈm thÊu cña m«i tr−êng, g©y øc chÕ sù sinh tr−ëng cña tÕ bµo m« sÑo. Tõ kÕt qu¶ thÝ nghiÖm nµy, cã thÓ chän ®−îc nång ®é n−íc dõa thªm vµo m«i tr−êng t¨ng sinh khèi m« sÑo lµ 20% (v/v). b. ¶nh h−ëng cña sucroza lªn sù t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ cña m« sÑo lan hå ®iÖp KÕt qu¶ kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña sucroza lªn sù t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ cña m« sÑo lan hå ®iÖp ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 2. B¶ng 2 ¶nh h−ëng cña sucroza lªn sù t¨ng sinh cña m« sÑo lan hå ®iÖp Träng l−îng t−¬i cña m« sÑo (mg) M«i tr−êng Sucroza (g/l) 5 tuÇn 11 tuÇn C3 – – – C4 30 1455,0a* 6080,0a C5 60 751,4b 1049,6b Ghi chó: nh− b¶ng 1. Trong nu«i cÊy m« thùc vËt, khi bæ sung nguån cacbon d−íi d¹ng ®−êng vµo m«i tr−êng, sÏ gióp m« vµ tÕ bµo thùc vËt tæng hîp nªn c¸c chÊt h÷u c¬, gióp tÕ bµo ph©n chia vµ t¨ng sinh khèi mµ kh«ng cÇn quang hîp. Sucroza lµ nguån cacbohydr¸t th−êng ®−îc sö dông trong nu«i cÊy m« thùc vËt; ®©y lµ lo¹i ®−êng ®«i khã ph©n huû. Trªn m«i tr−êng cã bæ sung 30 g/l sucroza, m« sÑo cã kh¶ n¨ng t¨ng sinh tèt; sau 5 tuÇn nu«i cÊy, sÏ thu ®−îc 1455 mg m« sÑo tõ 70 mg ban ®Çu. Träng l−îng t−¬i cña m« sÑo tiÕp tôc t¨ng sau 11 tuÇn; m« sÑo trªn m«i tr−êng t¬i xèp cã mµu vµng s¸ng, xuÊt hiÖn nhiÒu côm l«ng. Trªn m«i tr−êng cã chøa 60 g/l sucroza, m« sÑo t¨ng sinh yÕu; nhiÒu m« sÑo bÞ th©m tÝm, ho¸ ®en vµ chÕt. Nguyªn nh©n do khi sucroza hiÖn diÖn ë nång ®é cao, ®d lµm t¨ng ¸p suÊt thÈm thÊu cña m«i tr−êng; c¸c tÕ bµo m« sÑo cña lan hå ®iÖp trªn m«i tr−êng lóc nµy bÞ mÊt n−íc vµ rèi lo¹n biÕn d−ìng; nh− vËy, nång ®é 60 g/l sucroza trong m«i tr−êng kh«ng phï hîp cho tÕ bµo m« sÑo lan hå ®iÖp sinh tr−ëng. 2. Sù ph¸t sinh ph«i v« tÝnh cña m« sÑo lan hå ®iÖp a. ¶nh h−ëng cña n−íc dõa lªn sù ph¸t sinh ph«i v« tÝnh cña m« sÑo ë lan hå ®iÖp Nguån ®¹m cã ¶nh h−ëng ®Æc biÖt ®Õn sù ph¸t sinh ph«i. Khi nång ®é ®¹m trong m«i tr−êng gi¶m, ph«i v« tÝnh sÏ h×nh thµnh [14]. Nguån ®¹m dåi dµo th−êng ®−îc dïng lµ n−íc dõa, do trong n−íc dõa chøa rÊt nhiÒu axÝt amin. Theo quan s¸t kÕt qu¶ thÝ nghiÖm, trªn m«i tr−êng C3, m« sÑo t¨ng sinh chËm vµ kh«ng chuyÓn thµnh ph«i sau 15 tuÇn nu«i cÊy. Sau 11 tuÇn, ph«i ®d h×nh thµnh trªn m«i tr−êng C1. Nh−ng ®èi víi m«i tr−êng C2 lµ sau 15 tuÇn. Nh− vËy, khi gi¶m hµm l−îng n−íc dõa trong m«i tr−êng, sÏ gióp kÝch thÝch sù h×nh thµnh ph«i v« tÝnh cña m« sÑo lan hå ®iÖp (b¶ng 1). KÕt qu¶ nµy phï hîp víi nghiªn cøu cña Price vµ Smith [14]. b. ¶nh h−ëng cña sucroza lªn sù ph¸t sinh ph«i v« tÝnh cña m« sÑo lan hå ®iÖp B¶ng 3 Träng l−îng t−¬i cña PLB sau 5 tuÇn vµ 11 tuÇn nu«i cÊy Träng l−îng t−¬i cña PLB (mg) M«i tr−êng Sucroza (g/l) 5 tuÇn 11 tuÇn C3 – 1841,0 a* 3426,0 a C4 30 – – C5 60 – – Ghi chó: nh− b¶ng 1. 81 H×nh 2. ¶nh h−ëng cña sucroza lªn sù t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ cña m« sÑo lan hå ®iÖp 1a, 1b. PLB cña lan hå ®iÖp h×nh thµnh tõ m« sÑo sau 5 tuÇn vµ 11 tuÇn nu«i cÊy; 2a, 2b. m« sÑo cña lan hå ®iÖp trªn m«i tr−êng cã chøa 30 g/l sucroza sau 5 tuÇn vµ 11 tuÇn nu«i cÊy; 3a, 3b. m« sÑo cña lan hå ®iÖp trªn m«i tr−êng cã chøa 60 g/l sucroza sau 5 tuÇn vµ 11 tuÇn nu«i cÊy. Trªn c¸c m«i tr−êng cã chøa 30 g/l sucroza vµ 60 g/l sucroza, m« sÑo cã mµu vµng s¸ng vµ kh«ng ph¸t sinh h×nh th¸i. Sau 11 tuÇn nu«i cÊy, mét sè m« sÑo n»m phÝa ngoµi khèi m« sÑo trªn m«i tr−êng cã chøa 30 g/l sucroza chuyÓn mµu xanh (h×nh 2). Trong khi ®ã, trªn m«i tr−êng kh«ng bæ sung sucroza, toµn bé m« sÑo chuyÓn thµnh mµu xanh vµ h×nh thµnh PLB sau 5 tuÇn nu«i cÊy. Trong nhiÒu tr−êng hîp, sucroza cã t¸c dông øc chÕ sù tæng hîp diÖp lôc tè cña m« nu«i cÊy, ch¼ng h¹n ë rau diÕp [4], ë thuèc l¸ [9]. §èi víi lan hå ®iÖp, nång ®é 20 g/l sucrose sÏ g©y øc chÕ sù tæng hîp diÖp lôc tè cña tÕ bµo [10]. Nh− vËy, sucroza hiÖn diÖn trong m«i tr−êng ë nång ®é 30 g/l ®d øc chÕ tÕ bµo m« sÑo tæng hîp diÖp lôc tè, tõ ®ã m« sÑo kh«ng cã kh¶ n¨ng ph¸t sinh h×nh th¸i. Trªn m«i tr−êng kh«ng chøa sucroza, m« sÑo cã kh¶ n¨ng tæng hîp diÖp lôc tè, ph¸t triÓn lôc l¹p vµ biÖt ho¸ thµnh PLB. KÕt qu¶ nµy phï hîp víi nghiªn cøu cña nhiÒu t¸c gi¶ tr−íc ®ã [7, 13]. Nh− vËy, khi chuyÓn sang m«i tr−êng kh«ng bæ sung sucroza (C3), toµn bé m« sÑo sÏ h×nh thµnh PLB. M«i tr−êng nµy ®−îc chän ®Ó t¹o PLB tõ m« sÑo cña lan hå ®iÖp (h×nh 2 vµ b¶ng 3). c. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn sù ph¸t sinh ph«i v« tÝnh c¶m øng t¹o PLB tõ ph«i v« tÝnh cña m« sÑo lan hå ®iÖp B¶ng 4 ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn sù c¶m øng t¹o PLB tõ ph«i v« tÝnh Th¸ng HÖ thèng nu«i cÊy Träng l−îng t−¬i cña PLB (mg) Sè l−îng PLB Sè l−îng c©y con Ghi chó NF 2019c* 107,4d 14,8b Ph«i cã d¹ng cÇu, mµu xanh ®Ëm 1,5 C 1927d 113,0c 7,3d Ph«i cã d¹ng cÇu, mµu xanh ®Ëm NF 3268b 161,5b 30,1a Ph«i mµu xanh ®Ëm, cã l«ng tr¾ng, xuÊt hiÖn mét vµi chåi 3 C 3410a 166,8a 13,5c Ph«i mµu xanh ®Ëm, cã l«ng tr¾ng, xuÊt hiÖn mét vµi chåi Ghi chó: nh− b¶ng 1. 82 Sau 4 tuÇn nu«i cÊy, ph«i cã mµu xanh ®Ëm, träng l−îng t−¬i cã sù gia t¨ng. Sau 1,5 th¸ng vµ 3 th¸ng nu«i cÊy, träng l−îng t−¬i vµ sè l−îng PLB h×nh thµnh trong hÖ thèng NF gÇn nh− ngang b»ng víi hÖ thèng C. Sè l−îng c©y con h×nh thµnh trùc tiÕp tõ PLB trong hÖ thèng NF gÊp kho¶ng 2 lÇn sè l−îng trong hÖ thèng C (b¶ng 4 vµ h×nh 3). H×nh 3. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn sù ph¸t sinh ph«i v« tÝnh vµ sù c¶m øng t¹o PLB tõ ph«i v« tÝnh cña m« sÑo lan hå ®iÖp a1, a2. PLB h×nh thµnh trong hÖ thèng NF sau 1,5 th¸ng vµ 3 th¸ng nu«i cÊy; b1, b2. PLB h×nh thµnh trong hÖ thèng C sau 1,5 th¸ng vµ 3 th¸ng nu«i cÊy. 0 1000 2000 3000 4000 5000 NF C NF C 1 tháng 2 tháng (mg) Trọng lượng tươi (mg) 0 50 100 150 200 NF C NF C 1 tháng 2 tháng cây con Số lượng cây con H×nh 4. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn sù t¸i sinh c©y con tõ PLB cña lan hå ®iÖp 3. T¸i sinh c©y con tõ PLB vµ chuyÓn c©y con ra v−ên −¬m a. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn sù t¸i sinh c©y con tõ PLB ë lan hå ®iÖp C¶ träng l−îng t−¬i vµ sè l−îng c©y con h×nh thµnh trùc tiÕp tõ PLB sau 1 th¸ng vµ 2 th¸ng nu«i cÊy trong hÖ thèng NF ®Òu cao h¬n trong hÖ thèng C (h×nh 4). b. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn kh¶ n¨ng sèng sãt vµ ph¸t triÓn cña c©y con lan hå ®iÖp Sau 3 th¸ng nu«i cÊy, c©y con lan hå ®iÖp cã nguån gèc tõ viÖc nu«i cÊy trong hÖ thèng NF, cã tû lÖ sèng cao (95%) h¬n so víi trong hÖ 83 thèng C (70%) sau 4 tuÇn ®−îc chuyÓn ra v−ên −¬m vµ träng l−îng t−¬i cña nh÷ng c©y con cã nguån gèc tõ viÖc nu«i cÊy trong hÖ thèng NF còng cao h¬n trong hÖ thèng C (h×nh 5, h×nh 6). 0 10 20 30 40 NF C gam Trọng lượng tươi (g) 0 20 40 60 80 100 NF C % Tỷ lệ sống sót (%) H×nh 5. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn kh¶ n¨ng sèng sãt vµ ph¸t triÓn cña c©y con lan hå ®iÖp H×nh 6. ¶nh h−ëng cña hÖ thèng nu«i cÊy lªn sù t¸i sinh c©y con tõ PLB vµ kh¶ n¨ng sèng sãt, ph¸t triÓn cña c©y con lan hå ®iÖp a1, a2. sù t¸i sinh c©y con lan hå ®iÖp tõ PLB nu«i cÊy trong hÖ thèng NF sau 3 th¸ng nu«i cÊy vµ sau 4 tuÇn ®−îc chuyÓn ra v−ên −¬m; b1, b2. sù t¸i sinh c©y con lan hå ®iÖp tõ PLB nu«i cÊy trong hÖ thèng C sau 3 th¸ng nu«i cÊy vµ sau 4 tuÇn ®−îc chuyÓn ra v−ên −¬m III. KÕT LUËN Sau 5 tuÇn nu«i cÊy, m« sÑo cña lan hå ®iÖp [Phalaenopsis amabilis (L.) Blume] sÏ t¨ng sinh vµ ®¹t ®−îc träng l−îng t−¬i 1455 mg tõ 70 mg m« sÑo ban ®Çu khi nu«i cÊy trªn m«i tr−êng MS cã bæ sung 0,5 mg/l NAA, 2,0 mg/l BA, 20% (v/v) n−íc dõa, 1 g/l than ho¹t tÝnh vµ 30 g/l sucroza (C4). Trªn cïng m«i tr−êng kh«ng cã bæ sung sucroza, toµn bé m« sÑo sÏ ®−îc chuyÓn thµnh PLB sau 5 tuÇn. C¸c PLB t¹o ®−îc tõ m« sÑo cã thÓ øng dông vµo nhiÒu môc ®Ých nghiªn cøu nh− t¹o h¹t nh©n t¹o, chuyÓn gen c©y trång. Chóng t«i còng ®d thµnh c«ng trong viÖc sö dông hÖ thèng tói ni-l«ng (hÖ thèng NF) nh− mét hÖ thèng nu«i cÊy míi víi gi¸ thµnh thÊp khi so s¸nh víi hÖ thèng nu«i cÊy truyÒn thèng (hÖ thèng C) vµ ®d sö dông cho viÖc vi nh©n gièng còng nh− gióp c¶i thiÖn chÊt l−îng cña c©y con lan hå ®iÖp. KÕt qu¶ cho thÊy sè l−îng c©y con thu ®−îc ë hÖ thèng NF (185 c©y) cao h¬n so víi ë hÖ thèng C (109 c©y) sau 2 th¸ng nu«i cÊy. C©y con lan hå ®iÖp cã nguån gèc tõ viÖc nu«i cÊy trong hÖ thèng NF cã tû lÖ sèng cao (95%), kh«ng x¶y ra biÕn dÞ h×nh th¸i trªn l¸ vµ rÔ sau 4 tuÇn ®−îc chuyÓn ra v−ên −¬m. Trong t−¬ng lai, quy tr×nh nµy cã thÓ ®−îc sö dông cho môc ®Ých s¶n xuÊt c©y gièng th−¬ng m¹i. 84 TµI LIÖU THAM KH¶O 1. Arditti, 1992: Fundamentals of orchid biology - John Wiley and Sons Inc., New York, U.S.A. 2. Fast G., 1979: Die Orhidee, 30: 241-244. 3. Haas-von Schumde N. F., 1983: Die Orchidee, 34: 242-248. 4. Hildebrandt A. C., Wilmar J. C., Johns H., Ricker A. J., 1963: Am. J. Bot., 50: 248-254. 5. Intuwong O., Kunisaki J. T., Sagawa Y., 1972: Hawaii orchid J., 1: 13-18. 6. Intuwong O., Sagawa Y., 1974: Am. Orchid Soc. Bull., 43: 893-895. 7. Ishii Y., Takamura I., Goi M., Tanaka M., 1997: Plant Cell Rep., 17: 446-450. 8. Grout B. W. W., Grisp P., 1977: Acta Horticulturae, 78: 289-296. 9. Kaul K., Sabharwal P., 1971: Plant Physiol., 47: 691-695. 10. Kim S. Y., 1994: Somatic embryogenesis of Phalaenopsis - Ph. D. Thesis. Uni. of Hawaii, U.S.A. 11. Kozai T., Iwanami Y., 1988: Journal of Japanese Society for Horticultural Sciences, 57: 279-288. 12. Murashige T., Skoog F., 1962: Physiol. Plant, 15: 473-497. 13. Park S. Y., Murthi H. N., Paek K. Y., 2000: Plant Cell Tiss. Org. Cult., 63: 67-72. 14. Price H. J., Smith R. H., 1979: Planta, 145: 305-307. 15. Rotor J. G., 1949: Am. Orchid Soc. Bull., 18: 738-739. 16. Tanaka M., Sakanishi Y., 1977: Am. Orchid Soc. Bull., 46: 733-737. 17. Tanaka M., Senda Y., Hasegawa A., 1976: Am. Orchid Soc. Bull., 45: 1022- 1024. 18. Zimmer K., Pieper W., 1979: Phalaenopsis-zur vegetativen vermehrung. Grtebrse und Gartenwelt, 79: 258-260. INFLUENCES OF THE COCONUT WATER AND SUCROSE ON THE EMBRYOGENIC CALLUS INDUCTION AND THE CLONAL EMBRYO FORMATION OF PHALAENOPSIS AMABILIS (L.) BLUME DUONG TAN NHUT, HONG NGOC TRAM, NGUYEN PHUC HUY, DINH VAN KHIEM Summary Phalaenopsis amabilis (L.) Blume (Orchidaceae) is one of many commercial valuable orchids as cut flowers and potted plants throughout the world. Considerable difficulties have been encountered in the clonal propagation of this orchid due to the characteristics ununiform and the limited plantlets number. In this paper, an established method of the Phalaenopsis amabilis propagation through embryogenesis callus was described. The in vitro leaves emerging from the flower stalk nodes were used for protocorm-like bodies (PLBs) induction. These PLBs were used for the embryogenesis callus (callus) induction. About 1455 mg calli without any morphological change were harvested from 70 mg calli on 30 ml MS medium supplemented with 2 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 20% (v/v) CW, 1 g/l activated charcoal (AC), 30 g/l sucrose and 9 g/l agar after 5 culture weeks of. On the same medium without sucrose, 70 mg calli produced 1841 mg PLB (approximately 200 PLBs) after 5 weeks of culture; data also showed that PLB fresh weight and quantity in the nylon film culture system (NF) were almost equal to that in conventional system (C). The hyponex medium supplemented with 0.5 mg/l NAA, 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 1 g/l AC and 15% (v/v) CW was used for the plantlet regeneration from PLB. The results showed that plantlet quantity obtained in NF system (185 plantlets) was higher than that in C system (109 plantlets) after 2 culture months. Phalaenopsis amabilis plantlets in NF system had much high survival rate (95%) than that in C system (70%) after 4 weeks transferred in the greenhouse. Ngµy nhËn bµi: 20-11-2008