Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm ngọc linh (panax Vietnamensis ha et grushv.) - Lê Kim Cương

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276 265 ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH MÔ SẸO “XỐP” VÀ BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt* Viện Sinh học Tây Nguyên, (*)duongtannhut@gmail.com TÓM TẮT: Ảnh hưởng của 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), -naphthaleneacetic acid (NAA), thành phần khoáng, giá thể, nguồn mẫu, điều kiện nuôi cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh đã được trình bày trong nghiên cứu này. Kết quả cho thấy, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” với tỷ lệ tạo mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô cao nhất ở nồng độ kết hợp giữa 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và cao gấp 1,6 lần so với khi chỉ bổ sung riêng rẽ 2,4-D. Môi trường khoáng MS là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp”. Mặc dù, mẫu cấy tăng sinh tốt trên giá thể gelrite và agar, tuy nhiên, agar vẫn là giá thể phù hợp được chọn nhằm tiết kiệm chi phí nhưng vẫn đạt hiệu quả cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” cao. Mẫu cuống lá được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày cho khả năng cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” tốt nhất. Để tạo huyền phù tế bào, sau 8 tuần nuôi cấy, các mô sẹo “xốp”, mọng nước được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy dịch huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyền sang môi trường MS lỏng có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và được lắc ở tốc độ 100 vòng/phút. Huyền phù tế bào tăng sinh nhanh và thu được sinh khối lớn nhất vào ngày thứ 14 (23,67 mg/ml). Từ khóa: Panax vietmamensis, 2,4-D, huyền phù tế bào, mô sẹo “xốp”, NAA, tăng sinh mô sẹo. MỞ ĐẦU Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một trong những cây dược liệu quý cần được bảo tồn có trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [5]. Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng, 0,1% tinh dầu. Tại hội nghị quốc tế về sâm, loài sâm này được xếp vào nhóm các loài sâm quý trên thế giới cùng với sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolium)... [21]. Hiện nay, nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh còn rất hạn chế do loài sâm này chỉ được trồng tập trung ở vùng núi Ngọc Linh và thời gian từ lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến 5-6 năm. Chính vì hàm lượng dược tính cao, giá trị kinh tế lớn mà sâm Ngọc Linh đã sớm cạn kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng do việc khai thác quá mức. Do đó, yêu cầu tìm ra những kỹ thuật mới giúp thu được sinh khối sâm nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết. Hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân sinh khối các loài sâm khác đã được mở rộng như thu nhận sinh khối rễ sâm Triều Tiên (Panax ginseng) [13], thu nhận sinh khối từ huyền phù tế bào sâm Triều Tiên (Panax ginseng) [25], thu nhận sinh khối từ huyền phù tế bào trên cây sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium) [28]. Tuy nhiên, đối với sâm Ngọc Linh thì các nghiên cứu về việc thu nhận sinh khối từ huyền phù tế bào còn hạn chế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào việc khảo sát các yếu tố như chất điều hòa sinh trưởng thực vật, thành phần chất dinh dưỡng, giá thể, nguồn mẫu cấy, điều kiện nuôi cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu sử dụng nguồn mô sẹo “xốp” này để nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) với mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu ban đầu cho việc nhân giống in vitro; thu sinh khối tế bào ở quy mô công nghiệp, cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho ngành sản xuất dược liệu ở nước ta; đồng thời, phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn ở mức độ tế bào: dung hợp tế bào trần, chuyển gien trên đối tượng sâm Ngọc Linh. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Nguồn mẫu Nguồn mẫu là các cây sâm Ngọc Linh in vitro 3 tháng tuổi, cao khoảng 4,5 cm hiện có tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng (Viện Sinh học Tây Nguyên). Lá và cuống Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut 266 lá của cây sâm in vitro được sử dụng làm nguồn mẫu. Lá được cắt thành những mẫu có kích thước khoảng 1 x 1 cm, cuống lá cắt thành từng đoạn dài khoảng 1 cm. Môi trường nuôi cấy Môi trường dinh dưỡng khoáng MS [17], ½MS (môi trường MS có thành phần khoáng đa lượng giảm đi một nửa), SH [23] có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar (ngoại trừ thí nghiệm khảo sát giá thể). Tùy theo thí nghiệm mà các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được sử dụng (2,4-D, NAA). Các thí nghiệm được điều chỉnh pH về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở 121ºC, 1 atm trong 30 phút. Mẫu được cấy vào bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường, mỗi công thức 50 mẫu (5 mẫu/bình, 3 lần lặp lại) đối với các thí nghiệm khảo sát mô sẹo. Huyền phù tế bào được nuôi cấy trong bình thủy tinh 250 ml chứa 50 ml môi trường lỏng, đặt trên máy lắc (100 vòng/phút) (Hermle, Đức). Phương pháp Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và NAA lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh từ mẫu cấy cuống lá in vitro Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l), 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D với nồng độ tốt nhất thu được ở thí nghiệm trên kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0 và 2,0 mg/l), 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh từ mẫu cấy cuống lá in vitro Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên môi trường MS, ½MS, SH, bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l agar với nồng độ 2,4-D, NAA tốt nhất ở thí nghiệm trên. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng tối ưu ở thí nghiệm trên và sử dụng các loại giá thể khác nhau: agar (8 g/l), gelrite (2 g/l), bông gòn (kích thước 4  4 cm, khoảng 1,95 ± 0,46 g) nhằm tìm ra giá thể thích hợp nhất cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Mẫu cấy lá (1 × 1 cm) và cuống lá (1 cm) được cấy vào môi trường tốt nhất thu được ở các thí nghiệm trên. Sau đó, các mẫu cấy được đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m-2.s-1 hoặc tối hoàn toàn. Bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh Sau khi tìm ra môi trường nuôi cấy với nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, giá thể, nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng phù hợp thì các mẫu mô sẹo “xốp”, bở được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào. Mô sẹo “xốp” có khối lượng tươi 1 g được nuôi cấy trên môi trường lỏng với thành phần khoáng, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, điều kiện nuôi cấy tối ưu ở các thí nghiệm trên. Huyền phù tế bào sau khi thu nhận được tái sinh lại trên môi trường rắn với thành phần dinh dưỡng tương tự như môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào. Phương pháp xác định sinh khối Xác định khối lượng mô sẹo Mẫu mô sẹo được lấy ra khỏi bình nuôi cấy và cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức) để xác định khối lượng tươi. Sau đó, tiến hành sấy mẫu mô sẹo ở 60ºC cho đến khi khối lượng không đổi để xác định khối lượng khô. Xác định mật độ tế bào Huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh được thu nhận và được nhuộm bằng thuốc nhuộm carmine-iodine với tỷ lệ 2:1 (dịch huyền phù tế bào:thuốc nhuộm carmine-iodine). Sau đó, hút 5 µl dịch huyền phù đã nhuộm bằng micropipette TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276 267 trải lên lamelle. Đặt lên lame lõm, quan sát dưới kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản) và đếm tế bào dưới vật kính ×10. Xác định khối lượng tươi và khối lượng khô sinh khối Tiến hành cân eppendorf, hút 1 ml dịch huyền phù tế bào cho vào eppendorf. Sau đó, dịch huyền phù tế bào này được ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Nhẹ nhàng hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần cặn lắng đã được ly tâm. Cân eppendorf có chứa sinh khối tế bào lắng ở đáy để xác định khối lượng tươi. Khối lượng tươi sinh khối là độ lệch giữa hai lần cân. Sau đó, tiến hành xác định khối lượng khô bằng cách sấy eppendorf chứa huyền phù tế bào (đã ly tâm và hút bỏ dịch nổi) trong tủ sấy ở 60ºC đến khi khối lượng không đổi. Khối lượng khô sinh khối là độ chệnh lệch giữa lần cân cuối và lần cân đầu tiên. Điều kiện thí nghiệm Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 23±2ºC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m-2.s-1 (đối với các thí nghiệm có chiếu sáng) và độ ẩm trung bình 75-80%. Chỉ tiêu theo dõi và thống kê xử lý số liệu Các thí nghiệm khảo sát về sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo bao gồm các chỉ tiêu sau: tỷ lệ tạo thành mô sẹo “xốp” (%), khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) được thu nhận sau 8 tuần nuôi cấy. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào, chúng tôi tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu như mật độ tế bào, khối lượng tươi, khối lượng khô của sinh khối huyền phù tế bào sau 7, 14, 21 và 28 ngày nuôi cấy. Số liệu được xử lý và phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan test với α = 0,05 [8]. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” từ mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” trên môi trường có chứa 2,4-D sau 8 tuần nuôi cấy được thể hiện qua bảng 1, hình 1a. Sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo khác nhau ở các nồng độ 2,4- D khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Sự khác nhau đó được thể hiện qua tỷ lệ tạo mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô của mô sẹo. Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo “xốp” đạt 100% ở các công thức có bổ sung 1,0 mg/l, 2,0 mg/l 2,4-D (bảng 1). Khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo cũng đạt cao nhất ở công thức có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D (268,4 mg/mẫu và 9,4 mg/mẫu), mô sẹo tạo thành “xốp”, mọng nước và có màu trắng trong (bảng 1, hình 1a). Ở công thức bổ sung nồng độ 2,4-D thấp (0,5 mg/l), mẫu cấy hầu như không cảm ứng tạo thành mô sẹo mà cảm ứng tạo thành rễ; còn ở nghiệm thức không bổ sung 2,4-D thì mẫu cấy hóa nâu và chết. Điều đó chứng tỏ 2,4-D có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng và tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh. Kết quả này tương tự với kết quả của một số nghiên cứu về chi Panax như trên cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Meyer) [25, 6], cây sâm Mỹ (Panax quinquefolium) [27], mẫu cấy cảm ứng hình thành mô sẹo mềm, “xốp” và tăng sinh nhanh khi bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D vào môi trường nuôi cấy. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Sự kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l) vào trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng một cách đáng kể đến sự cảm ứng và tăng sinh của mô sẹo “xốp”. Ở nghiệm thức có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA thì 100% mẫu cấy tạo thành các mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong với khối lượng tươi (434,2 mg/mẫu) và khối lượng khô (22,8 mg/mẫu) cao nhất so với các nghiệm thức còn lại, cao gấp 1,6 lần so với nghiệm thức không bổ sung NAA (bảng 2, hình 1b). Trong khi đó, nghiệm thức có bổ sung NAA ở nồng độ thấp hoặc cao hơn 1,0 mg/l cũng không làm tăng khả năng tăng sinh của mô sẹo. Sự kết hợp của hai loại auxin trong quá trình cảm ứng mô sẹo cũng đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác nhau. Trên cây Thu thảo Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut 268 kê (Pogonatherum paniceum) khi bổ sung kết hợp 2,4-D và NAA với các nồng độ khác nhau, mẫu cấy cũng cảm ứng và tạo thành mô sẹo có hình thái khác nhau; bên cạnh sự xuất hiện của các mô sẹo “xốp”, mềm, màu trắng xanh hay vàng nhạt còn có các mô sẹo cứng, chắc, màu vàng đậm [29]. Ở cây Ngũ trảo (Vitex negundo) khi bổ sung 2,4-D kết hợp với NAA ở nồng độ thấp (dưới 1,0 mg/l) tạo thành mô sẹo bở, màu trắng; nồng độ 2,4-D và NAA khoảng 1,0 mg/l - 2,0 mg/l mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo “xốp”, bở, mọng nước, màu trắng. Khi bổ sung ở nồng độ NAA và 2,4-D cao hơn 2,0 mg/l mô sẹo hình thành bở, có màu vàng hoặc trắng xanh [10]. Như vậy, trên đối tượng cây sâm Ngọc Linh, tỷ lệ cảm ứng tạo thành mô sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô đạt cao nhất khi nuôi cấy mẫu cuống lá trên môi trường có sự kết hợp của 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và cao gấp 1,6 lần so với môi trường chỉ bổ sung 2,4-D riêng rẽ. Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh 2,4-D (mg/l) Tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (%) Khối lượng tươi (mg/mẫu) Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo 0,0 0 14,8d 1,6b Mẫu hóa nâu và chết 0,5 2 70,6c 7,0a Hầu hết mẫu cảm ứng tạo rễ trực tiếp, một số mẫu tạo mô sẹo có màu xanh nhạt, hơi “xốp” 1,0 100 268,4a 9,4a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong 2,0 100 193b 9,2a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong, một số mẫu xuất hiện phôi Bảng 2. Ảnh hưởng của 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh NAA (mg/l) Tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (%) Khối lượng tươi (mg/mẫu) Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo 0,0 100 270,0b 10,0b Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong 0,5 100 87,4c 8,0b Mô sẹo vàng “xốp”, một số mẫu cảm ứng tạo rễ 1,0 100 434,2a 22,8a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong 2,0 100 203,8b 11,0b Mô sẹo “xốp”, mọng nước, trắng trong, một số mẫu hình thành phôi Các chữ cái a,b, thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử Duncan. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” từ các mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh Các mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh đều cảm ứng và tăng sinh thành mô sẹo “xốp” trên các môi trường khoáng MS, ½MS, SH. Ở cả ba loại môi trường tỷ lệ mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo “xốp” gần như không có sự khác biệt (bảng 3). Tuy nhiên, các chỉ tiêu khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo lại khác nhau khi nuôi cấy trên các nguồn khoáng khác nhau. Khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo cao nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS (431,6 và 20 mg/mẫu), tiếp TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276 269 theo là môi trường ½MS (302,2 và 16,4 mg/mẫu) và cuối cùng là môi trường SH (194 và 8,2 mg/mẫu) (bảng 3). Các mẫu mô sẹo được hình thành trên môi trường MS thì “xốp”, mọng nước và có màu trắng trong. Trên môi trường ½MS và SH, mô sẹo cũng có hình thái tương tự, nhưng một số mẫu lại cảm ứng hình thành rễ (hình 1c). Hình 1. Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA, nguồn khoáng, giá thể, nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) a. Nồng độ 2,4-D (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l, từ phải qua trái); b. Nồng độ NAA (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l, từ phải qua trái); c. Nguồn khoáng ½MS, MS, SH (từ phải qua trái); d. Giá thể bông gòn, gelrite, agar (từ phải qua trái); Mẫu cấy lá (e1) và cuống lá (e3) ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày; Mẫu cấy lá (e2) và cuống lá (e4) ở điều kiện tối hoàn toàn; thanh đo: 25 mm Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut 270 Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Môi trường Tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (%) Khối lượng tươi (mg/mẫu) Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo ½MS 90 302,2b 16,4ab Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong, một số mẫu cảm ứng tạo rễ MS 100 431,6a 20a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong SH 96 194b 8,2b Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong, một số mẫu cảm ứng tạo rễ Trong nuôi cấy in vitro, thành phần khoáng có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng, tăng sinh và phát sinh hình thái mô sẹo. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả năng cảm ứng và tăng sinh mô sẹo cho thấy, mô sẹo được hình thành từ mẫu cấy lá sâm Ngọc Linh thì cứng và chắc, có khối lượng tươi cao nhất khi được nuôi cấy trên môi trường SH, còn trên môi trường MS và ½MS lại cho kết quả thấp hơn [19]. Trong khi đó, mô sẹo sâm Triều Tiên (Panax ginseng) lại tăng sinh tốt trên môi trường khoáng ½MS [7], còn mô sẹo sâm Mỹ (Panax quinquefolium) lại tăng sinh tốt trên môi trường khoáng MS [1]. Do đó, môi trường khoáng thích hợp là điều kiện tất yếu cho sự cảm ứng hình thành mô sẹo “xốp” của sâm Ngọc Linh. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trường khoáng MS là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo “xốp” và tăng sinh cao nhất. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Bên cạnh chất tạo đông được sử dụng phổ biến như agar, gelrite trong nuôi cấy mô thực vật thì việc sử dụng các giá thể có cấu trúc xốp, thông thoáng khí lại tiết kiệm được chi phí đang được chú ý. Trong nghiên cứu này, các mẫu cấy cuống lá đều cảm ứng tạo mô sẹo “xốp” trên các giá thể nuôi cấy khác nhau (100%) (bảng 4). Tuy nhiên, khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo lại có sự khác biệt rõ rệt. Trên giá thể agar và gelrite, mô sẹo tăng sinh nhiều hơn so với giá thể bông gòn (bảng 4). Mô sẹo cảm ứng trên giá thể agar và gelrite đều “xốp”, mọng nước và có màu trắng trong, còn trên giá thể bông gòn mô sẹo có màu vàng nhạt (hình 1d). Các mô sẹo màu trắng trong, mọng nước thường “xốp”, rời rạc hơn và dễ phân tán trong môi trường lỏng so với các mô sẹo có màu vàng. Do đó, các mô sẹo này thích hợp làm nguyên liệu tạo huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh. Trong nghiên cứu này, giá thể agar thích hợp cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh. Trong giá thể agar có chứa Ca, Mg, K và Na [18] có thể là yếu tố cần thiết cho mô sẹo “xốp” cảm ứng và tăng sinh. Giá thể bông gòn tuy dẫn truyền chất dinh dưỡng tốt nhưng lại không thích hợp cho mẫu mô sẹo “xốp” tăng sinh. Mặc dù, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tốt trên giá thể agar và gelrite, nhưng xét về hiệu quả kinh tế thì agar vẫn là giá thể được chọn nhằm tiết kiệm chi phí, nhưng vẫn đảm bảo cho hiệu quả cao. Bảng 4. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Giá thể Tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp”(%) Khối lượng tươi (mg/mẫu) Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo Agar 100 426,8a 22,2a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong Gelrite 100 355,8ab 18,2a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng trong Bông gòn 100 137,8b 8,4b Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu vàng nhạt TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276 271 Ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Mô sẹo có thể được tạo ra từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Khả năng cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” ở các mẫu cấy có nguồn gốc khác nhau là khác nhau. Tùy theo từng loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo thành mô sẹo [20]. Trong nghiên cứu này, các mẫu cuống lá được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày và trong điều kiện tối hoàn toàn đều cảm ứng tạo thành mô sẹo với tỷ lệ là 100%. Tuy nhiên, khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo thu được trong điều kiện sáng cao hơn so với điều kiện tối (bảng 5). Các chỉ tiêu như khối lượng tươi, khối lượng khô của mô sẹo hình thành từ cuống lá (453 mg/mẫu và 23 mg/mẫu) cũng cao hơn so với mô sẹo hình thành từ lá (286,25 mg/mẫu và 26,25 mg/mẫu) (bảng 5). Ở điều kiện chiếu sáng, mô sẹo hình thành từ các mẫu cuống lá thì “xốp”, mọng nước và có màu trắng trong (hình 1e3); còn trong điều kiện tối thì mô sẹo “xốp”, mọng nước nhưng lại có màu vàng đục (hình 2e4). Đối với các mẫu cấy lá trong điều kiện sáng cũng cho tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (96%), khối lượng tươi (286,25 mg/mẫu), khối lượng khô (26,25 mg/mẫu) cao hơn so với các mẫu cấy lá được đặt trong tối (bảng 5). Các mẫu lá được nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn đều chuyển sang màu vàng, mô sẹo hình thành hơi “xốp” và có màu vàng đục (hình 1e2) khác với mẫu mô sẹo hình thành từ mẫu cấy lá ở điều kiện sáng có màu trắng đục và hơi “xốp” (hình 1e1). Kết quả của nghiên cứu này tương tự một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại cơ quan khác nhau và điều kiện chiếu sáng đến khả năng khởi tạo, biệt hóa và tăng sinh mô sẹo trên các đối tượng thuộc chi Nhân sâm. Lim & Lee (1997) [15] sử dụng lá, trụ thượng diệp, cuống hoa và rễ từ cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) nuôi cấy in vitro; tất cả các mẫu cấy đều tạo thành mô sẹo cứng, chắc với tỷ lệ cao (100%) và có khả năng tạo rễ bất định khi nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Trên đối tượng sâm Mỹ (Panax quinquefolium) thì mô sẹo được hình thành từ các mẫu cấy ban đầu là rễ sau 2-3 tuần nuôi cấy, mô sẹo cứng, chắc, màu vàng nhạt, tạo phôi soma sau 3 tháng nuôi cấy [26]. Khi nuôi cấy một số các cơ quan như rễ, lá, cuống lá, trụ hạ diệp... thì sự tạo thành mô sẹo trong điều kiện tối tốt hơn ngoài sáng [3, 11, 12, 24]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt hơn trong điều kiện chiếu sáng. Trên mẫu cấy lá cây Vải (Litchi chinensis), mô sẹo cảm ứng và tăng sinh tốt ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày [16]. Khối lượng tươi đạt cao nhất khi nuôi cấy mô sẹo phát sinh từ lá cây Cuccumis sativus ở điều kiện chiếu sáng là 16 giờ/ngày [9]. Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, mẫu cấy cuống lá được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày là thích hợp cho quá trình cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh. Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Điều kiện chiếu sáng Nguồn mẫu Tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (%) Khối lượng tươi (mg/mẫu) Khối lượng khô (mg/mẫu) Hình thái mô sẹo Sáng Lá 96 286,25b 26,25a Mô sẹo hơi “xốp”,trắng đục Cuống lá 100 453a 23a Mô sẹo “xốp”, mọng nước, trắng trong Tối Lá 76 51,25d 6,25b Mô sẹo hơi “xốp”, màu vàng đục Cuống lá 100 164,25c 6,75b Mô sẹo “xốp”, mọng nước, vàng đục Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut 272 Nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo “xốp” cây sâm Ngọc Linh Nuôi cấy huyền phù tế bào thích hợp cho việc nhân giống in vitro và sản xuất sinh khối tế bào ở quy mô công nghiệp. Bên cạnh đó, việc nuôi cấy tế bào đơn còn có nhiều ứng dụng khác như nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau; thu nhận các chất trao đổi thứ cấp; chọn dòng tế bào, tuyển chọn các đặc tính thích hợp để phục vụ cho nhu cầu sống của con người mà đặc biệt là các kỹ thuật chuyển gien, dung hợp tế bào cũng như các thao tác ở mức tế bào [22]. . Hình 2. Sự sinh trưởng và phát triển của sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau; MĐTB: mật độ tế bào (tế bào/5 µl); KLT: khối lượng tươi sinh khối (mg/ml); KLK: khối lượng khô sinh khối (mg/ml) Qua nghiên cứu này, bước đầu ghi nhận được đường cong sinh trưởng của tế bào cây sâm Ngọc Linh (hình 2; hình 3a, b, c, d). Mô sẹo được đưa vào môi trường nuôi cấy từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 7 là giai đoạn thích ứng với môi trường nuôi cấy. Thời gian để các tế bào thích ứng với môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi mẫu, khối lượng mẫu và các điều kiện nuôi cấy. Từ ngày nuôi cấy thứ 7 đến khoảng ngày thứ 12 các tế bào bước sang giai đoạn phân chia nhanh theo hàm số mũ (20 tế bào/5 µl). Sự phân chia tế bào đạt cao nhất được ghi nhận vào ngày thứ 14 (23,67 mg/ml). Hình 2 cho thấy, đỉnh của đường cong sinh trưởng tế bào tương đối hẹp, điều này chứng tỏ pha ổn định của tế bào khá ngắn (vào khoảng ngày nuôi cấy thứ 12 đến ngày thứ 16). Sau đó, sự sinh trưởng của tế bào giảm đi đáng kể, tế bào bước vào giai đoạn suy thoái và chết nếu không được cấy chuyền (hình 2). Vì vậy, việc duy trì huyền phù tế bào phải được thực hiện vào giai đoạn đầu của pha ổn định, vào lúc các tế bào phân chia và phát triển nhanh chóng, nếu vượt qua giai đoạn này thì sức sống của huyền phù tế bào sẽ giảm xuống. Do đó, ngày nuôi cấy thứ 14 là thời điểm thích hợp cho việc cấy chuyền huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu bước đầu này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh. Kết quả cũng cho thấy pha ổn định của tế bào tương đối ngắn, do đó, các nghiên cứu tiếp theo về đường cong sinh trưởng tế bào cần tiến hành ghi nhận sinh khối tế bào ở những khoảng thời gian ngắn hơn (cứ mỗi 1 hoặc 2 ngày tiến hành thu số liệu 1 lần). M ật đ ộ tế b ào (t ế bà o/ 5 µ l) K hố i l ượ ng si nh k hố i t ươ i v à kh ô (m g/ m l) TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276 273 Hình 3. Hình thái tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính x40 a. Tế bào đơn sâm Ngọc Linh; b. Tế bào đang phân chia; c. Cụm 3 tế bào; d. Cụm 4 tế bào; e. Mô sẹo tái sinh từ huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh Các giai đoạn sinh trưởng của tế bào cũng phụ thuộc từng loại cây khác nhau. Trên cây Lộc vừng hoa vàng (Barringtonia racemosa), thời gian thích ứng với môi trường nuôi cấy kéo dài đến 14 ngày và sinh khối tế bào đạt cao nhất vào ngày thứ 32 [4]. Giai đoạn thích nghi của tế bào cây Ớt chuông (Capsicum annuum L.) chỉ kéo dài 5 ngày, sinh khối tế bào thu được vào ngày nuôi cấy thứ 20 là cao nhất [14]. Bên cạnh đó, đường cong sinh trưởng của các loài khác nhau trong cùng một chi cũng đã được nghiên cứu như trên cây Origanum vulgare và O. Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut 274 syriacum giai đoạn thích nghi của tế bào, giai đoạn ổn định và giai đoạn suy vong của hai loài này lại có sự khác biệt. Sinh khối tế bào thu được cao nhất ở Origanum vulgare L. là vào ngày thứ 18 và ở O. syriacum L. là vào ngày thứ 21 [2]. Những kết quả này cho thấy, đường cong sinh trưởng của tế bào ở các loài khác nhau không giống nhau. Huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh sau khi cấy chuyền 4-6 lần được trải lên môi trường MS rắn có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar. Sau 4 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của các mô sẹo từ dịch huyền phù (hình 3e). Điều này chứng tỏ, khả năng sống sót và tái sinh khá tốt của huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh, mở ra tiển vọng mới trong việc nhân giống và thu nhận sinh khối trên quy mô lớn. KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, mẫu cấy cuống lá sâm Ngọc Linh được cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” tốt nhất trên môi trường khoáng MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, pH = 5,8 ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Mô sẹo “xốp” được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose để tạo huyền phù tế bào; sinh khối tế bào thu được cao nhất (23,67 mg/ml) vào ngày nuôi cấy thứ 14. Nghiên cứu này bước đầu thu nhận được sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh dùng làm nguyên liệu ban đầu cho việc nhân giống in vitro; tiến đến việc thu nhận sinh khối tế bào ở quy mô công nghiệp và cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho ngành sản xuất dược liệu ở nước ta. Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andrew S. W., 1990. Callus induction and plant regeneration of American ginseng. Hort. Sci., 25(5): 571-572. 2. Arafeh R. M., Shibli R. A., Mahmoud M. A. and Shatnawi M. A., 2006. Callusing, cell suspension culture and secondary metabolites production in persian oregano (Origanum vulgare L. ) and arabian oregano (O. syriacum L.). Jordan J. Agric. Sci., 2(3): 274-282. 3. Arya S., Arya I. D. I. and Eriksson T., 1993. Rapid multiplication of adventitious somatic embryos of Panax ginseng. Plant Cell Tiss. Org., 34: 157-162. 4. Behbahani M., Shanehsazzadeh M. and Hessami M. J., 2011. Optimization of callus and cell suspension cultures of Barringtonia racemosa (Lecythidaceae family) for lycopene production. Sci. Agric. (Piracaba, Braz), 68(1): 69-76. 5. Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2007. Sách Đỏ Việt Nam, phần II: Thực vật. Nxb. Khoa học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, trang 516. 6. Bonfill M., Cusidó R. M., Palazón J., Canut E., Piňol T. and Morales C., 2003. Relationship between peroxidase activity and organogenesis in Panax ginseng calluses. Plant Cell Tiss. Org., 73: 37-41. 7. Choi K. T., Kim M. W., Shin H. S., 1982. Induction of callus and organ in tissue culture of ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer). Kor. J. Ginseng Sci., 6: 162-167. 8. Duncan D. B., 1955. Multiple range and multiple F test. Biometrics, 11: 1-42. 9. Elmeer K. M. S. and Hennerty M. J., 2008. Observations on the combined effects of light, NAA and 2,4-D on somatic embryogenesis of cucumber (Cucumis sativus) hybrids. Plant Cell Tiss. Org., 95: 381-384. 10. Farzana B. C., Safiul A. F. M., Maruf H. M., Farhana I. J., Anita R. C., Syeda S., Zubaida K. and Mohammed R., 2011. Studies with callus induction of Vitex negundo: an aromatic medicinal plant. Am.- Eurasian J. Sustain. Agric., 5(1): 6-14. 11. Gao X., Zhu C., Jia W., Gao W., Qiu M., Zhang Y. and Xiao P., 2005. Induction and characterization of adventitious roots TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276 275 directly from the explants of Panax notoginseng. Biotechnol. Lett., 27: 1771- 1775. 12. Kim J. H., Chang E. J. and Oh H. I., 2005. Saponin production in submerged adventitious root culture of Panax ginseng as affected by culture conditions and elicitors. Asia Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol., 13(2): 87-91. 13. Kim Y. S., Hahn E. J., Murthy H. N. and Paek K. Y., 2004. Effect of polyploidy induction on biomass and ginsenoside accumulations in adventitious roots of ginseng. J. Plant Bio., 47(4): 356-360. 14. Kittipongpatana N., Maneerat P., Pattanakitkosol P. and Kittipongpatana O. S., 2007. Effect of some factors on the growth of Capsicum annuum L. cell suspension culture and biotransformation of hydroquinone to arbutin. CMU. J. Nat. Sci., 6(2): 207-218. 15. Lim H. T. and Lee H. S., 1997. Regeneration of Panax ginseng C.A. Meyer by organogenesis DNA analysis of regenerants. Plant Cell Tiss. Org., 49: 179- 187. 16. Ma X. N, Yi G. J., Huang X. L. and Zeng J. W., 2009. Leaf callus induction and uspension culture establishment in lychee (Litchi chinensis Sonn.) cv. Huaizhi. Acta Physiol. Plant, 31: 401-405. 17. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15: 473-497. 18. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006. Công nghệ tế bào. Nxb. Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 375. 19. Nhut D. T., Huy N. P., Luan V. Q., Binh N. V, Nam N. B., Thuy L. N. M., Ha Đ. T. N., Chien H. X., Huong T. T., Cuong H. V., Cuong L. K., Hien V. T., 2011. Shoot regeneration and micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv. from ex vitro leaf-derived callus. Afr. J. Biotechnol., 10(84): 19499-19504. 20. Pal A., Banerjee A. and Dhar K., 1985. In vitro organogenesis and somatic embryogenesis from leaf explants of Leucosceptum canum Sm. Plant Cell Rep., 4: 281-284. 21. Phai D. N., Chinh N. N., Duc N. M., Cam T. T. V., Trung L. T. and Cang N. M., 2002. Cultivation and development of Vietnamese ginseng and preliminary results of the study on cultivated Vietnamese ginseng. Spec. Iss. Med. Res., 6(1): 12-18. 22. Pierik R. L. M., 1987. ln vitro culture of higher plants, Martinus Nijhoff, Boston pp. 747. 23. Schenk R. U. and Hildebrandt A. C., 1972. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can. J. Bot., 50: 199-204. 24. Teng W. L., Sin T. and Teng M. C., 2002. Explant preparation affects culture initiation and regeneration of Panax ginseng and Panax quinquefolius. Plant Cell Tiss. Org., 68: 233-239. 25. Thanh N. T. and Paek K. Y., 2010. Cell suspension culture Panax ginseng C. A. Meyer: Role of plant growth regulators and medium composition on biomass and ginsenoside production. Tạp chí Khoa học, 26: 191-196. 26. Tirajoh A., Kyung T. S. and Punja Z. K., 1998. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in American ginseng (Panax quinquefolium L.). In Vitro Cell. Dev. Biol., 34: 203-211. 27. Wang J., Gao W. Y., Zang J., Huang T., Cao Y. and Zhao Y. X., 2010. Dynamic change of metabolites and nutrients in suspension cells of Panax quinquefolium L. in bioreactor. Acta Physiol. Plant, 32: 463- 467. 28. Wang J., Gao W. Y., Zhang J., Zuo B. M., Zhang L. M. and Huang L. Q., 2012. Production of ginsenoside and polysaccharide by two-stage cultivation of Panax quinquefolium L. cells. In Vitro Cell Dev. Bio. Plant, 48: 107-112. Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut 276 29. Wang W., Zhao X., Zhuang G., Wang S. and Chen F., 2008. Simple hormonal regulation of somatic embryogenesis and/or shoot organogenesis in caryopsis cultures of Pogonatherum paniceum (Poaceae). Plant Cell Tiss. Org., 95: 57-67. EFFECTS OF SOME FACTORS ON FRIABLE CALLUS INDUCTION AND CELL SUSPENSION CULTURE OF Panax vietmamensis Ha et Grushv. Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut Tay Nguyen Institute of Biology, VAST SUMMARY In the present study, the effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), -naphthaleneacetic acid (NAA), mineral salt formulations, explant sources, cultural conditions on friable callus induction and cell suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv. were investigated. The results showed that the friable callus induction rate, fresh weight and dry weight were 1.6-fold higher when calli were cultured on media supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D and 1.0 mg/l NAA than those cultured on media with 2,4-D alone. The best medium for friable callus proliferation was Murashige and Skoog (MS) supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D and 1.0 mg/l NAA. Petiole explants cultured under 16/8 h light/dark photoperiod resulted in the best friable callus induction rate, fresh weight and dry weight (100%, 453 mg/explant, 23 mg/explant, respectively). After 8 weeks of culture, friable calli were transferred to MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D, 1.0 mg/l NAA and 30 g/l sucrose. The suspension cell cultures were maintained on a rotary shaker at 100 rpm. The maximum cell biomass of 23.67 mg/ml fresh weight was obtained after 14 days of culture. Key words: Panax vietnamensis, cell suspension, growth curve, friable callus, petiole, 2,4-D, NAA. Ngày nhận bài: 21-6-2012