Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh hoạt tính kháng vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm của chủng xạ khuẩn streptomyces aureofaciens 25.2

114 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ĐẾN KHẢ NĂNG SINH HOẠT TÍNH KHÁNG Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces aureofaciens 25.2 Nguyễn Xuân Cảnh1, Trần Thị Thúy Hà2, Phạm Thị Hiếu1, Ngô Thùy Dương1 TÓM TẮT Nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu đánh giá các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm. Các thí nghiệm được thiết kế và thực hiện trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau để đánh giá khả năng sinh chất kháng khuẩn tối ưu của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 bắt đầu sinh chất kháng khuẩn ở ngày nuôi cấy thứ 3 và đạt cực đại sau 5 ngày với điều kiện nuôi lắc 150 vòng/phút. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 sinh chất kháng khuẩn tốt nhất là 30oC, pH môi trường ban đầu từ 5 - 7 với thể tích dịch nuôi cấy khoảng 15% trong bình tam giác 250 ml. Môi trường dinh dưỡng phù hợp được xác định có bổ sung nguồn cacbon là 13 g/l glucose và nguồn ni tơ là 0,6 g/l casein, lúc này chủng xạ khuẩn cho đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 26 mm và 23,3 mm. Từ khóa: Tôm, bệnh, điều kiện nuôi cấy, Streptomyces aureofaciens, Vibrio parahaemolyticus 1 Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2 Trung tâm Công nghệ sinh học thủy sản, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Xạ khuẩn được biết đến là nhóm vi sinh vật phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, chúng có khả năng sinh ra rất nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học trong đó có chất kháng sinh. Theo ước tính chi Streptomyces tạo ra đến 80% trong số các hợp chất có hoạt tính sinh học được phát hiện từ vi sinh vật (Watve et al., 2001). Đã có rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn trong đời sống và sản xuất, đặc biệt là việc dùng xạ khuẩn để ức chế các tác nhân gây bệnh khác nhau. Năm 2016, Nguyễn Xuân Cảnh và cộng tác viên đã phân lập và xác định được chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy trên tôm (Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., 2016), đây là một trong những tác nhân gây hại đặc biệt nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm trên thế giới cũng như ở Việt Nam (Christopher et al., 2011). Tính từ đầu năm 2011 đến nay, bệnh này đã xuất hiện trên tôm sú ở rất nhiều địa phương khác nhau như Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau, Bến Tre, Trà Vinh với nguy cơ gây chết 100% trong ao nuôi và là mối lo hàng đầu của người nuôi tôm. Do đó việc tìm kiếm các giải pháp vừa an toàn vừa hiệu quả để khống chế sự bùng phát dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra là hết sức cấp bách đối với ngành nuôi tôm của Việt Nam hiện nay và trong tương lai (Đỗ Thị Thanh Dung và ctv., 2017). Với mục đích sử dụng chủng xạ khuẩn đã sàng lọc để ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ức chế sinh trưởng của vi khuẩn gây bệnh trên tôm, nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 sinh hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Nghiên cứu này sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 đã được phân lập, nghiên cứu và định danh lưu trữ tại phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm nhận từ Viện Công nghệ môi trường thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., 2016). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và vi khuẩn được sử dụng theo nghiên cứu trước đây (Nguyễn Xuân Cảnh và ctv., 2016). Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 được nuôi cấy ở các điều kiện khác nhau, thu nhận dịch nuôi cấy và thử nghiệm tính đối kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng xạ khuẩn sinh chất kháng khuẩn cao nhất. Các thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy của chủng xạ khuẩn được nghiên cứu bao gồm: Ảnh hưởng của trạng thái nuôi cấy, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy và độ thông khí khi nuôi cấy... được thực hiện theo phương pháp đã mô tả trong nghiên cứu trước đây (Ababutain et al., 2013; Oskay, 2011). 115 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam từ tháng 2/2016 đến tháng 2/2017. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của thời gian và trạng thái nuôi cấy tới hoạt tính của chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 được nuôi trong môi trường lỏng trong ở nhiệt độ 30oC trong cả hai trạng thái nuôi tĩnh và nuôi lắc 150 vòng/phút. Sử dụng dịch nuôi cấy để thử khả năng sinh chất kháng khuẩn với chủng vi sinh vật kiểm định Vibrio parahaemolyticus sau mỗi khoảng thời gian 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Qua kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn, nhận thấy rằng ở trạng thái nuôi lắc sau 5 ngày nuôi cấy, chủng Streptomyces aureofaciens 25.2 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với kích thước vòng kháng khuẩn là 17 mm, sau đó có sự biến thiên theo chiều hướng giảm dần và sau 7 ngày nuôi vẫn còn giữ được hoạt tính (Hình 1). Từ đó kết luận được rằng, trạng thái nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) là trạng thái tốt để chủng xạ khuẩn này sinh chất kháng khuẩn, và thời gian nuôi cấy tối ưu là 5 ngày để sinh tổng hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất. 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 được nuôi trong môi trường lỏng ở trạng thái lắc 150 vòng/phút với các mức nhiệt độ 25 oC, 30 oC, 35oC, 40 oC, 45 oC, 50oC trong 5 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng 25.2 có khả năng phát triển và sinh chất kháng khuẩn trong khoảng nhiệt độ từ 25 - 40oC, tại thời điểm 30oC chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp chất kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn đạt 17 mm, sau đó hoạt tính giảm dần ở nhiệt độ cao hơn và mất hẳn ở 50oC (Hình 2). Hình 1. Ảnh hưởng của thời gian và trạng thái nuôi cấy đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2 Hình 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2 Thời gian nuôi cấy (ngày) Kí ch th ướ c v òn g kh án g kh uẩ n (m m ) nuôi cấy tĩnhnuôi cấy lắc (150 vòng/phút) 116 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 3.3. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 được nuôi trong môi trường lỏng, lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C với các điều kiện pH ban đầu khác nhau từ 3 - 11. Sau 5 ngày nuôi cấy xác định hoạt tính kháng khuẩn với chủng Vibrio parahaemolyticus 25.2 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả thu được cho thấy, trong dải pH từ 4 đến 10 thì chủng 25.2 đều có thể sinh trưởng và biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn tương đối mạnh. Chủng 25.2 sinh tổng hợp chất kháng khuẩn đạt cực đại ở pH = 5 với đường kính vòng kháng khuẩn là 18 mm; tiếp theo sau là 17 mm ở pH = 7; nhưng khi pH môi trường lớn hơn 8 thì hoạt tính kháng khuẩn giảm dần (Hình 3). Tuy nhiên, kết quả cho thấy tại giá trị pH = 6 hoạt tính kháng khuẩn lại thấp hơn khi nuôi cấy ở pH = 5 và 7, điều này có thể giải thích do sai số trong thí nghiệm hoặc tại giá trị pH này tác động trực tiếp đến khả năng sinh hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn, điều này sẽ làm rõ trong các nghiên cứu tiếp theo. Tuy nhiên, với kết quả này có thể thấy chủng xạ khuẩn 25.2 sinh tổng hợp chất kháng khuẩn tốt hơn cả là trong điều kiện pH môi trường hơi axit và trung tính. 3.4. Ảnh hưởng của độ thông khí tới hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nuôi lắc trong bình tam giác 250 ml ở nhiệt độ 300C với tốc độ 150 vòng/phút và các thể tích dịch nuôi lần lượt là 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40% thể tích bình. Sau 5 ngày kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính của chủng xạ khuẩn biểu hiện khá mạnh khi nuôi với thể tích dịch nuôi từ 10 - 20%, hoạt tính tối ưu nhất đạt được ở 15% thể tích dịch nuôi với đường kính vòng kháng khuẩn là 19 mm; sau đó hoạt tính giảm dần khi tăng thể tích dịch nuôi (Hình 4). Như vậy trong các điều kiện khác tối ưu, trong điều kiện phòng thí nghiệm để hoạt tính kháng khuẩn cao nhất thì cần nuôi với lượng môi trường lên men chiếm 15% thể tích bình. Hình 3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2 Hình 4. Ảnh hưởng của thể tích dịch nuôi đến hoạt tính của chủng Streptomyces aureofaciens 25.2 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Để khảo sát ảnh hưởng, bổ sung riêng biệt nguồn các ngồn cacbon khác nhau gồm tinh bột, glucose, maltose, lactose, saccharose với các nồng độ từ 8 - 13 g/l vào môi trường và nuôi cấy chủng xạ khuẩn theo các điều kiện tối ưu đã xác định và kiểm tra hoạt tính đối kháng. Kết quả cho thấy hoạt tính 117 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 9(94)/2018 kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn không chịu ảnh hưởng bởi nguồn đường maltose và ảnh hưởng ít bởi nguồn saccharose cũng như tinh bột. Trong khi đó hoạt tính này chịu tác động nhiều khi nuôi xạ khuẩn trên môi trường có nguồn cacbon là glucose, với nồng độ thích hợp nhất là 13 g/l (Bảng 1). 3.6. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ tới hoạt tính kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 được nuôi trên môi trường cơ sở có bổ sung các nguồn ni tơ khác nhau gồm casein, urea, NH4Cl, NH4NO3 (NH4)2SO4 với các nồng độ 0,1 - 0,6 g/l, sau đó xác định hoạt tính đối kháng. Kết quả nhận cho thấy hoạt tính kháng của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 không chịu ảnh hưởng của NH4Cl, NH4NO3 và (NH4)2SO4, mặc dù tăng nồng độ các chất nhưng hoạt tính không thay đổi. Hoạt tính này chịu ảnh hưởng khả nhiều bởi hai nguồn ni tơ là casein và ure, khi tăng nồng độ hai nguồn ni tơ này thì hoạt tính cũng tăng lên, với nguồn ni tơ là ure thì hoạt tính tối đa là 21,5 mm (0,4 g/l) sau đó sẽ giảm dần khi tăng nồng độ. Trong khi đó đường kính vòng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 đạt cực đại là 23,3 mm khi sử dụng 0,6 g/l casein. Bảng 1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng 25.2 Bảng 2. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng 25.2 Nồng độ (g/l) Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn (mm) Glucose Lactose Maltose Saccharose Tinh bột 8 22,0 ± 0,3 19,1 ± 0,3 18,0 ± 0,1 18,3 ± 0,2 21,0 ± 0,2 9 22,6 ± 0,3 20,0 ± 0,3 18,0 ± 0,1 18,7 ± 0,2 22,5 ± 0,2 10 23,3 ± 0,3 20,3 ± 0,3 18,0 ± 0,1 19,0 ± 0,2 22,9 ± 0,2 11 24,2 ± 0,3 20,7 ± 0,3 18,0 ± 0,1 19,5 ± 0,2 23,3 ± 0,2 12 24,9 ± 0,3 21,0 ± 0,3 18,0 ± 0,1 19,7 ± 0,2 23,5 ± 0,2 13 26,0 ± 0,3 21,2 ± 0,3 18,0 ± 0,1 20,0 ± 0,2 23,8 ± 0,2 IV. KẾT LUẬN Hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của chủng xạ khuẩn Streptomyces aureofaciens 25.2 biểu hiện ở ngày nuôi cấy thứ 3 và đạt cực đại sau 5 ngày nuôi trong điều kiện nuôi lắc 150 vòng/ phút, tại nhiệt độ 30oC và pH5-7 thì chủng Vibrio parahaemolyticus 25.2 biểu hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất. Để lượng chất kháng khuẩn sinh ra tốt nhất thì thể tích dịch nuôi cần duy trì trong khoảng 15% thể tích bình nuôi. Nguồn cacbon và ni tơ phù hợp cho chủng Vibrio parahaemolyticus 25.2 sinh chất kháng khuẩn là glucose với nồng độ bổ sung vào môi trường cơ sở là 13 g/l và casein với nồng độ 0,6 g/l. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Thị Thanh Dung, Võ Đình Quang, Phan Thị Phượng Dung, 2017. Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus spp. kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng chết sớm trên tôm tại Sóc Trăng. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ. 20(3): 5-15. Nguyễn Xuân Cảnh, Hồ Tú Cường, Nguyễn Thị Định, Phạm Thị Hiếu, 2016. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 14(11): 1809-1816. Ababutain IM, Aziz ZKA, AL-Meshhen NA, 2013. Optimization of environmental and nutritional conditions to improve growth and antibiotic Nồng độ (g/l) Đường kính vòng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn (mm) Casein Urea NH4Cl NH4NO3 (NH4)2SO4 0,1 18,5 ± 0,2 18,6 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 0,1 18,0 ± 0,1 0,2 19,7 ± 0,2 19,7 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 0,3 20,5 ± 0,2 21,0 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 0,4 22,1 ± 0,2 21,5 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 0,5 22,6 ± 0,2 19,7 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 0,6 23,3 ± 0,2 18,2 ± 0,2 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1 18,0 ± 0,1