Tài liệu Ảnh hưởng của axit boric lên khả năng sống của tế bào gốc dây chằng nha chu người in vitro: Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học
161
ẢNH HƯỞNG CỦA AXIT BORIC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG
CỦA TẾ BÀO GỐC DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI IN VITRO
Nguyễn Thị Thu Sương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ**, Phạm Anh Vũ Thụy***
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định mức độ ảnh hưởng của axit boric ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sống của tế bào
gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs), nhằm cung cấp bằng chứng cho việc lựa chọn nồng độ axit boric thích
hợp để ứng dụng trong lâm sàng.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Axit boric được chuẩn bị thành các dung dịch có nồng độ 0,5%;
0,75%; 1%; 1,5%; 3% và 6%. Ảnh hưởng của axit boric lên hPDLSCs được xác định bằng phương pháp MTT.
hPDLSCs được ủ với boric axit trong 24 giờ, sau đó, ủ trong dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide) trong 4 giờ để tạo tinh thể formazan. Dung dịch Ethanol/DMSO được thêm vào
để hòa tan tinh thể formazan và tạo dung dịch màu tím hấp thu tại bước sóng 570 nm. Mức độ ...
9 trang |
Chia sẻ: Đình Chiến | Ngày: 13/07/2023 | Lượt xem: 65 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Ảnh hưởng của axit boric lên khả năng sống của tế bào gốc dây chằng nha chu người in vitro, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học
161
ẢNH HƯỞNG CỦA AXIT BORIC LÊN KHẢ NĂNG SỐNG
CỦA TẾ BÀO GỐC DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI IN VITRO
Nguyễn Thị Thu Sương*, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ**, Phạm Anh Vũ Thụy***
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định mức độ ảnh hưởng của axit boric ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sống của tế bào
gốc dây chằng nha chu người (hPDLSCs), nhằm cung cấp bằng chứng cho việc lựa chọn nồng độ axit boric thích
hợp để ứng dụng trong lâm sàng.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Axit boric được chuẩn bị thành các dung dịch có nồng độ 0,5%;
0,75%; 1%; 1,5%; 3% và 6%. Ảnh hưởng của axit boric lên hPDLSCs được xác định bằng phương pháp MTT.
hPDLSCs được ủ với boric axit trong 24 giờ, sau đó, ủ trong dung dịch MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide) trong 4 giờ để tạo tinh thể formazan. Dung dịch Ethanol/DMSO được thêm vào
để hòa tan tinh thể formazan và tạo dung dịch màu tím hấp thu tại bước sóng 570 nm. Mức độ độc tính của axit
boric được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn ISO 10993 - 5: 2009, kết hợp quan sát hình thái tế bào và tỷ lệ tăng
trưởng tương đối (relative growth rate - RGR).
Kết quả: Quan sát hình thái tế bào sau khi ủ trong dung dịch axit boric 24 giờ ở các nồng độ thí nghiệm
được ghi nhận như sau: Ở nồng độ 0,5% và 0,75%, tế bào đồng nhất, bám dính và trải đều, có ít tế bào co lại. Ở
nồng độ 1% và 1,5%, tế bào co lại nhiều, mật độ ít, bám dính thưa thớt trên bề mặt đĩa nuôi. Ở nồng độ 3% và
6%, tế bào trải dài trên bề mặt đĩa nuôi, một số ít tế bào co lại. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nồng độ axit boric
tăng dần thì trung bình RGR giảm tương ứng. Mức độ độc tính tế bào được xác định ở nồng độ 0,5% và 0,75%
là cấp 1 (75% - 99%), ở nồng độ 1% và 1,5% là cấp 2 (50% - 74%), ở nồng độ 3% và 6% là cấp 4 (1% - 24%).
Kết luận: Như vậy, theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009, kết hợp quan sát hình thái tế bào và tỷ lệ tăng
trưởng tương đối nghiên cứu cho thấy axit boric ở nồng độ 0,5% và 0,75% không gây độc cho hPDLSCs.
Từ khóa: Axit boric, độc tính tế bào, tế bào gốc dây chằng nha chu người.
ABSTRACT
IN VITRO VIABILITY OF HUMAN PERIODONTAL LIGAMENT STEM CELLS INFLUENCED BY
BORIC ACID
Nguyen Thi Thu Suong, Nguyen Thi Ngoc My, Pham Anh Vu Thuy
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 161 – 169
Objective: This study was conducted to determine the dose-dependent effect of boric acid on the viability of
human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs), thereby providing the basis to select appropriate boric acid
concentrations for clinical application.
Materials and methods: Boric acid was prepared in different concentrations of 0.5%, 0.75%, 1%, 1.5%,
3% and 6%. The effect of those solutions on hPDLSCs was determined by the MTT method. The hPDLSCs were
incubated with boric acid solutions for 24 hours, then continuously with MTT solution (3- (4.5-dimethylthiazol-
2-yl) -2.5-diphenyl tetrazolium bromide) for 4 hours to promote the formation of Formosan crystals. The
*Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. HCM, ** Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ sinh học động
vật, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM,
*** Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP. HCM.
Tác giả liên lạc: PGS. TS. Phạm Anh Vũ Thụy ĐT: 0916 810 874 Email: pavthuy@ump.edu.vn
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
162
Ethanol/DMSO solution was then added to dissolve the Formosan crystals and generate a purple solution that
was absorbed at a 570 nm wavelength. The cellular toxicity grades were determined according to ISO 10993 - 5:
2009, simultaneously cell morphology and the relative growth rate (RGR) were also observed.
Results: Cellular morphology after incubation with boric acid solution at different concentrations for 24
hours was performed as follows: At concentrations of 0.5% and 0.75%, almost hPDLSCs were homogeneous,
adherent and uniformly spread while only a handful of cells shrinkage was observed. At concentrations of 1% and
1.5%, the amount of shrinkage hPDLSCs was much more, the less cellular density and sparse adhesion was also
recorded on the plates surface. At concentrations of 3% and 6%, these cells stretch over the cultured surface, with
a few contracted cells. After measuring the optical density at 570 nm and processing the data, the RGR values
were classified according to the cytotoxicity grades in accordance with ISO 10993 - 5: 2009; Level 0 and 1 toxicity
were confirmed as zero toxic to the cells. The results supported that when the concentration of boric acid increases,
the average growth rate decreases correspondingly. Cellular toxicity was determined at level 1 for 0.5% and
0.75% concentrations (75% - 99%), level 2 for 1% and 1.5% concentrations (50% - 74%); level 4 for 3% and 6%
concentrations (1% - 24%).
Conclusion: With the results of cellular toxicity according to ISO 10993 - 5: 2009 in combination with
observed cells morphology and calculated RGR, boric acid at 0.5% and 0.75% concentrations were confirmed to be
non-cytotoxic to hPDLSCs.
Keywords: Boric acid, cytotoxicity, human periodontal ligament stem cells.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm nha chu là bệnh nhiễm khuẩn mạn
tính ảnh hưởng đến mô nâng đỡ răng gồm dây
chằng nha chu và xương ổ răng, có khả năng dẫn
đến mất răng. Lấy cao răng và xử lý mặt chân
răng được coi là phương pháp bắt buộc trong
điều trị viêm nha chu. Tuy nhiên, phương pháp
này không thể loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn trong
những trường hợp phức tạp(12). Các phương
pháp điều trị hỗ trợ hiện nay đang được sử dụng
khá phổ biến như kháng sinh toàn thân hay tại
chỗ, các dung dịch kháng khuẩn bơm rửa túi nha
chu hay súc miệng. Trong đó sử dụng dung dịch
kháng khuẩn bơm rửa kết hợp với lấy cao răng
và xử lý bề mặt chân răng là biện pháp thường
quy trong điều trị viêm nha chu. Vì vậy, việc
nghiên cứu một dung dịch có khả năng kháng
khuẩn, không có tác dụng phụ cũng như không
gây độc tính cho mô nha chu là điều đáng được
quan tâm.
Axit boric là axit của nguyên tố boron từ lâu
đã được biết như một chất kháng khuẩn nhẹ và
được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
của y học. Những hợp chất có chứa boron gần
đây đã được nghiên cứu về khả năng kháng lại
một số vi khuẩn liên quan đến bệnh nha chu
như Prevotella intermedia (Pi), Porphyromonas
gingivalis (Pg), Eubacterium nodatum (En) và
Treponema denticola (Td)(9). Nghiên cứu ứng dụng
tính kháng khuẩn của axit boric để điều trị viêm
nha chu đang được quan tâm ngày càng nhiều,
nhưng khá ít nghiên cứu in vitro về ảnh hưởng
của nó đối với tế bào của mô nha chu.
Tế bào gốc dây chằng nha chu người
(hPDLSCs) được nuôi cấy từ mô dây chằng nha
chu người, biểu hiện những dấu ấn (marker) của
tế bào gốc trung mô như CD44, CD73, CD90 và
sở hữu những đặc tính đa tiềm năng có thể biệt
hóa thành các loại tế bào khác nhau như nguyên
bào xương, tế bào tạo mô mỡ và tế bào sụn(11).
hPDLSCs không chỉ có có vai trò quan trọng
trong việc duy trì mà còn có khả năng thúc đẩy
tái tạo mô nha chu và thường là lựa chọn ưu tiên
hàng đầu trong công nghệ tái tạo và sửa chữa
mô nha chu trong điều trị bệnh nha chu(1,3).
ISO là liên đoàn tiêu chuẩn quốc tế nhằm
nâng cao sự phát triển của tiêu chuẩn hóa,
hoạt động như quá trình quản lý hài hòa để
đảm bào sự an toàn, chất lượng và quy trình
chế tạo thiết bị y tế. ISO 10993, phần 5 đưa ra
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học
163
chỉ định về quy trình đánh giá độc tính in vitro
thông qua thử nghiệm MTT. MTT là một loại
tetrazole có màu vàng. MTT viết tắt 3-(4, 5-
Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide sẽ chuyển thành tinh thể
formazan màu tím trong tế bào sống dưới tác
dụng của enzym sucinate dehydrogenase, một
loại enzym reductase trong ti thể. Do đó nếu
số lượng tế bào sống càng lớn sẽ tạo ra lượng
formazan càng lớn và làm chỉ số mật độ quang
tăng(5). Thuận lợi của thử nghiệm MTT được
ghi nhận là thời gian ủ MTT ngắn (4 giờ), hình
ảnh tạo tinh thể forrmazan màu tím dễ quan
sát và so sánh, kết quả đo mật độ quang
nhanh chóng, đơn giản, dễ dàng thực hiện và
kết quả đáng tin cậy(4). Mục đích của nghiên
cứu này là đánh giá độc tính in vitro của axit
boric trên khả năng sống của hPDLSCs trong
nghiên cứu này.
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng
Vật liệu và dòng tế bào nghiên cứu
Axit boric nguyên chất được mua từ công ty
Merck – Đức. Dung dịch axit boric 6% được
chuẩn bị bằng cách hòa tan 6 gr axit boric trong
100 ml môi trường nuôi cấy và lọc qua màng lọc
0,22 µm vô trùng. Dung dịch này được pha
loãng tiếp tục bằng môi trường nhằm đạt được
các nồng độ khảo sát. Môi trường nuôi cấy tiêu
chuẩn là môi trường Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium/Ham 12 Medium -DMEM/F12
(Sigma, Mỹ) có bổ sung 10% Fetal bovine serum
- FBS (Sigma, Mỹ) và kháng sinh (100 UI/ml
Penicilin, 100 µg/ml Streptomycin – Sigma, Mỹ).
Dung dịch MTT 5 mg/ml được chuẩn bị bằng
cách hòa tan 50 mg MTT trong 10ml Phosphate
Buffer Saline – PBS (Gibco, Mỹ) 1X và lọc qua
màng lọc 0,22 µm vô trùng. Dung dịch MTT
dùng trong thử nghiệm MTT được chuẩn bị
bằng cách pha loãng trong môi trường nuôi cấy
với tỉ lệ 1:9. Dung dịch DMSO 20% được chuẩn
bị bằng cách pha loãng 2 ml DMSO trong 10 ml
môi trường nuôi cấy, được sử dụng làm nhóm
chứng dương gây độc cho tế bào(2). Các hóa chất
khác: Enzyme tách tế bào Trypsin (Sigma, Mỹ),
thuốc nhuộm tế bào Trypan blue (Sigma, Mỹ),
Ethanol (Sigma, Mỹ).
Nguồn hPDLSCs được cung cấp từ phòng
thí nghiệm Kỹ nghệ mô và Vật liệu Y Sinh
(TEBM Lab) thuộc Đại Học Khoa Học Tự Nhiên,
Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, đã được
chứng minh biểu hiện những dấu ấn phân tử
(marker) của tế bào gốc trung mô như CD44,
CD73 và CD90 và cũng sở hữu đặc tính đa tiềm
năng có thế biệt hóa thành những loại tế bào
khác nhau như nguyên bào xương và tế bào tạo
mỡ in vitro(11).
Quy trình nghiên cứu
Quy trình chuẩn bị tế bào
Nguồn hPDLSCs ở thế hệ tế bào P3 được
nuôi tăng sinh và cấy chuyền để thu nhận tế bào
P4 với số lượng cần thiết cho các thí nghiệm. Các
tế bào tăng sinh và hợp dòng (đạt độ bao phủ bề
mặt nuôi cấy > 80%) được thu nhận để đánh giá
độc tính của axit boric.
Các bước thu nhận tế bào bao gồm: loại bỏ
môi trường nuôi cấy và rửa tế bào bằng dung
dịch PBS, tách tế bào bám khỏi bề mặt đĩa nuôi
bằng enzym Trypsin-EDTA 0,25% và ủ ở 37oC,
5% CO2 trong 3 phút. Môi trường nuôi cấy được
bổ sung vào để bất hoạt Trypsin, ly tâm ở tốc độ
3000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận cặn tế
bào. Tế bào sau khi được thu nhận sẽ được xác
định mật độ bằng cách nhuộm tế bào với trypan
blue (tỉ lệ 1:1) và nạp vào buồng đếm hồng cầu
được đếm dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 100
lần. Huyền phù dịch tế bào với mật độ 105 tế
bào/ml vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng và nuôi tế
bào ở 37ºC, 5% CO2 qua đêm.
Quy trình ủ tế bào bằng axit boric
Môi trường trong đĩa 96 giếng được loại bỏ.
Các dung dịch axit boric thí nghiệm 0,5%; 0,75%;
1%; 1,5%; 3%; 6%; môi trường nuôi cấy tiêu
chuẩn (chứng âm) và DMSO 20% (chứng dương)
được bổ sung vào các giếng tế bào và tiếp tục
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
164
nuôi cấy ở 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ.
Quy trình thử nghiệm MTT
Sau 24 giờ, hút hết dịch trong các giếng và
thay vào đó dung dịch MTT. Sau 4 giờ, hút hết
dung dịch MTT, thay vào đó dung dịch
DMSO/Ethanol (tỷ lệ 1:1), huyền phù đều trong
mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan tạo
thành dung dịch đồng nhất và đo độ hấp thu
quang học (Optical density – OD) ở bước sóng
570nm.
Đánh giá kết quả
Đánh giá hình thái tế bào: Hình thái tế bào
sau khi cấy và sau khi ủ trong dung dịch axit
boric 24 giờ được ghi nhận bằng hình ảnh chụp
dưới kính hiển vi đảo pha CKX53 (Olympus,
Nhật) cùng phần mềm ghi nhận hình ảnh
(CellSens) và so sánh với nhóm chứng.
Đánh giá ảnh hưởng của axit boric sau thử
nghiệm MTT dựa theo hướng dẫn ISO 10993,
chúng tôi chia mức độ độc tế bào thành năm giai
đoạn bằng cách phân tích tỉ lệ tăng trưởng tương
đối (RGR) được xác định theo công thức(5,8):
RGR (%) = x 100%
OD570e: giá trị trung bình của mật độ quang
của dung dịch axit boric được đo ở bước sóng
570 nm.
OD570b: giá trị trung bình của mật độ quang
của môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn được đo ở
bước sóng 570 nm.
RGR được tóm tắt trong Bảng 1 với mức độ 0
và 1 được xác định là không gây độc cho tế bào(8).
Số liệu được xử lý thống kê bằng kiểm định
One Sample T-Test trên phần mềm SPSS phiên
bản 20. Khác biệt có ý nghĩa thống kê được xác
nhận với các trường hợp giá trị p < 0,05.
Bảng 1. Mức độ gây độc tế bào theo tiêu chuẩn
ISO10993-5:2009(8)
RGR (%) Gây độc tế bào
100 0
75-99 1
50-74 2
25-49 3
1-24 4
0 5
KẾT QUẢ
Hình thái hPDLSCs là dạng tế bào bám dính
trải rộng, nhân lớn hình oval và có nhiều đuôi
bào tương, hình dạng đồng đều bám dính trên
bề mặt nuôi cấy (Hình 1. Mũi tên). Tế bào tăng
sinh và hợp dòng có dạng trải dài và cuộn theo
hình cung tròn. Những đặc điểm hình thái này
được duy trì ổn định qua các thế hệ cấy chuyền
tiếp theo.
Sau khi ủ hPDLSCs trong dung dịch axit
boric ở các nồng độ 0,5%; 0,75%; 1%; 1,5%; 3% và
6% cũng như nuôi tế bào ở môi trường nuôi cấy
tiêu chuẩn (chứng âm) và DMSO 20% (chứng
dương) sau 24 giờ, chúng tôi thu được kết quả
đã trình bày ở hình 2 đến hình 5 và bảng 2.
A B
Hình 1. Hình thái hPDLSCs khi quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược vật kính 4x (A) và vật
kính 10x (B).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học
165
Ở nhóm chứng âm (n = 3), hPDLSCs có dạng
đồng nhất, bám dính và trải đều bề mặt nuôi cấy
(Hình 2A).
Ở nhóm chứng dương (n = 3), hình dạng tế
bào thay đổi, đa số tế bào co tròn và biến dạng,
bong tách khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy (Hình 2B).
Quan sát hình 3, có thể thấy được khi tăng
nồng độ axit boric lên thì hình thái tế bào cũng
thay đổi theo. Cụ thể ở nồng độ 0,5% và 0,75%
đa số tế bào có hình dạng tương tự ở nhóm
chứng âm, tế bào đồng nhất, bám dính và phủ
đều bề mặt nuôi cấy, tuy nhiên có 1 ít tế bào
phản ứng thay đổi hình dạng co lại một phần. Ở
nồng độ 0,75%, hình ảnh tế bào tương tự ở nồng
độ 0,5% nhưng có nhiều tế bào co lại hơn. Ở
nồng độ 1% và 1,5%, tế bào co lại nhiều, không
còn trải đều, bám dính thưa thớt trên bề mặt đĩa
nuôi. Ở nồng độ 3% và 6%, các tế bào không co
lại mà trải dài hơn, không có hình dạng nhất
định, bám dính lỏng lẻo trên bề mặt đĩa.
Sau khi được ủ với dung dịch MTT, tinh thể
formazan có màu tím được hình thành do phản
ứng của enzyme sucinate dehydrogenase hiện
diện trong quá trình hô hấp của ti thể trong tế
bào sống với chất MTT. Số lượng tế bào sống
càng lớn thì lượng tinh thể formazan được tạo
thành càng nhiều.
Ở nhóm chứng âm (Hình 4A) ta thấy hình
ảnh tinh thể formazan màu tím với mật độ cao,
che phủ hầu hết bề mặt đĩa nuôi, các tinh thể này
có dạng đồng nhất và tương ứng với mức độ
hợp dòng của tế bào.
Ở nhóm chứng dương (Hình 4B) một số ít
tinh thể formazan được tạo ra tuy nhiên chúng
không có hình dạng như ở nhóm chứng âm,
không có sự bám dính trên bề mặt đĩa nuôi
tương ứng với sự chết của tế bào khi quan sát
hình thái ở trên.
Khi tăng nồng độ axit boric thì sự hình thành
tinh thể forrmazan giảm dần, kết quả được thể
hiện đồng thời qua hình ảnh đại thể của tế bào
(Hình 5) và kết quả đo RGR (Bảng 2).
Cụ thể ở nồng độ axit boric 0,5% kết quả
RGR = 92,03 ± 6,58% thể hiện mức độ hình thành
tinh thể formazan nhiều nhất trong tất cả các
nhóm thí nghiệm và gần bằng nhóm chứng âm.
Ở nồng độ axit boric 0,75%, kết quả RGR thu
được là 89,9 ± 5,5% cho thấy số lượng tinh thể
formazan được tạo ra thấp hơn so với nồng độ
axit boric 0,5% tuy nhiên sự khác biệt này không
lớn (< 1%). Đối với 2 nhóm thí nghiệm 1% và
1,5% tương ứng có chỉ số RGR lần lượt giảm dần
là 77,27 ± 5,02% và 64,61 ± 6,36%, cho thấy số
lượng tinh thể formazan được hình thành ít hơn
so với nhóm chứng âm và 2 nhóm nồng độ 0,5%
và 0,75%, các tinh thể formazan thưa thớt, không
phủ kín bề mặt đĩa nuôi. Trong khi đó, ở nồng
độ 3% và 6%, không còn quan sát được các tinh
thể formazan được tạo thành, do các tế bào đã
bong tách hết khỏi bề mặt đĩa, hình ảnh được ghi
A B
Hình 2. hPDLSCs ở nhóm chứng âm: môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn (A) và nhóm chứng
dương: dung dịch DMSO 20% (B).
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
166
nhận tương tự như ở nhóm chứng dương. Đồng
thời, kết quả RGR cũng rất thấp và gần bằng
nhóm chứng dương (3% là 14,79 ± 1,5% và 6% là
13,23 ± 1,58%).
Kết quả được ghi nhận theo Bảng 2, ở nồng
độ axit boric 0,5% và 0,75% mức độ độc tính ở
mức độ 1, nồng độ axit boric 1% và 1,5% độc tính
ở mức độ 2, nồng độ axit boric 3% và 6%, gây
độc ở mức độ 4, bằng với mức độ độc tính ở
nhóm chứng dương. Với mức độ độc tính được
xác nhận ở mức 0 và 1 là không gây độc đối với
tế bào, vì vậy, có thể kết luận axit boric ở nồng
độ 0,5% và 0,75% không gây độc cho hPDLSCs.
Bảng 2. Trung bình phần trăm hPDLSCs sống ở các nồng độ của dung dịch axit boric.
Nồng độ AB (%) 0,5 (n=3) 0,75 (n=3) 1 (n=3) 1,5 (n=3) 3 (n=3) 6 (n=3)
TB ± Độ lệch chuẩn 92,03±6,58 89,9±5,5 77,27±5,02 64,61±6,36 14,79±1,5 13,23±1,58
Giá trị p 0,046
0,042 0,515 0,105 <0,001
<0,001
Mức độ độc tính
(8)
1 1 2 2 4 4
p: so sánh trung bình phần trăm tế bào sống của mỗi nồng độ axit boric với 75%. Kiểm định One Sample T-Test.
A B
C D
E F
Hình 3. hPDLSCs sau 24 giờ ủ trong các nồng độ axit boric 0,5% (A), 0,75% (B), 1% (C), 1,5% (D),
3% (E) và 6% (F)
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học
167
A B
C D
E F
Hình 5. Sự hình thành tinh thể formazan đối với các nồng độ axit boric 0,5% (A),
0,75% (B), 1% (C), 1,5% (D), 3% (E) và 6% (F).
Hình 4. Sự hình thành tinh thể formazan đối với chứng âm: môi trường nuôi cấy tiêu
chuẩn (A) và chứng dương: dung dịch DMSO 20% (B).
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018
168
0,
5%
0,
75
% 1%
1,
5% 3% 6% CM
D
M
SO
20
%
0
50
100
150
BÀN LUẬN
Thông qua thử nghiệm MTT theo tiêu chuẩn
ISO10993 - 5: 2009 đánh giá ảnh hưởng của axit
boric lên khả năng sống của hPDLSCs, có thể ghi
nhận được khi nồng độ axit boric tăng dần thì
khả năng sống của tế bào giảm dần. Hình ảnh tế
bào khi ủ ở các nồng độ axit boric trong 24 giờ
đều cho thấy tế bào có phản ứng thay đổi khác
so với ban đầu. Điều này có thể do bản chất axit
boric là một axit, nên khi hòa tan trong môi
trường nuôi cấy tế bào sẽ làm thay đổi độ pH
trung tính trong môi trường này dẫn đến phản
ứng của tế bào khi tiếp xúc với dung dịch. Tuy
nhiên ở nồng độ 3% và 6%, tế bào không co lại
mà trải dài trên bề mặt đĩa nuôi, có khả năng là
do việc trực tiếp tiếp xúc với nồng độ quá cao, tế
bào không kịp phản ứng co lại. Khi được ủ với
dung dịch MTT trong 4 giờ, lượng tinh thể
formazan tạo ra tương ứng với hình ảnh tế bào ủ
trong các nồng độ axit boric, số lượng tinh thể
formazan giảm dần khi nồng độ axit boric tăng
dần. Kết quả RGR cũng phù hợp với những hình
ảnh dược thấy sau thí nghiệm. Nghiên cứu cho
thấy axit boric ở nồng độ 0,5% và 0,75% không
gây độc cho hPDLSCs, tuy nhiên hình dạng tế
bào có thay đổi một phần.
Apdik và cs (2015) đánh giá độc tính của axit
boric trên tế bào gốc mô mỡ người bằng phương
pháp MTS (3- (4,5-di-methyl-tiazol-2-yl) -5- (3-
carboxy-methoxy-phenyl) -2 (4-sulfo-phenyl) -
2H- tetrazolium) sau 24 giờ, đã chứng minh axit
boric không gây độc trên tế bào này, tuy nhiên
nồng độ khảo sát ở đây rất thấp 0,005mg/ml -
2mg/ml (0,0005 % - 0,2%)(2). Nghiên cứu của
chúng tôi cũng có khuynh hướng tương đồng,
khi kết quả cho thấy ở nồng độ thấp nhất trong
các nồng độ nghiên cứu của axit boric là 0,5% và
0,75% không gây độc cho hPDLSCs. Trong một
nghiên cứu khác của Saglam và cs (2013) đánh
giá độc tính của axit boric so với chlorhexidine
qua thử nghiệm Water soluble tetrazolium salt
(WST) sau 24 giờ, đã chứng minh được axit boric
ở các nồng độ thấp hơn 0,75% không gây độc
cho nguyên bào sợi nướu và nguyên bào sợi dây
chằng nha chu(10).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát
độc tính của axit boric từ nồng độ 0,5% trở lên
với mục đích tìm được nồng độ tối ưu có thể vừa
có tác dụng kiềm khuẩn, diệt khuẩn trên lâm
sàng mà vừa không gây độc cho tế bào, những
nồng độ quá thấp sẽ không thể cho tác dụng như
mong muốn. Karaarslan và cs (2005) đã chứng
Các nhóm thí nghiệm
Phần
trăm tế
bào
sống
Biểu đồ 1. Phần trăm hPDLSCs sống ở các nhóm thí nghiệm sau 24 giờ.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học
169
minh được ở nồng độ tương đương hoặc hơn
0,5% axit boric có tác dụng ức chế sự phát triển
trên loài Aspergillus và Candida albicans, ở nồng
độ thấp hơn dường như không có tác dụng đó(7).
Một nghiên cứu khác của Saglam và cs (2013)
cũng đã kết luận ở nồng độ 0,75% axit boric có
tác dụng làm giảm độ sâu túi nha chu và giảm
chảy máu nướu ở những bệnh nhân viêm nha
chu mạn(10). Kết quả này cũng được Kanoriya và
cs (2017) chứng minh tương tự khi sử dụng gel
axit boric 0,75%, kết quả sau 3 - 6 tháng, độ sâu
túi nha chu và tình trạng chảy máu nướu giảm
hơn ở những bệnh nhân viêm nha chu mạn(6). Có
thể thấy, axit boric ở nồng độ 0,75% có hiệu quả
đáng kể trong điều trị viêm nha chu mạn trên
lâm sàng. Trong tương lai, cần có thêm nghiên
cứu lâm sàng so sánh hiệu quả hỗ trợ điều trị túi
nha chu giữa hai nồng độ axit boric 0,5% và
0,75% để khẳng định nồng độ cụ thể vừa có hiệu
quả trong điều trị vừa không gây độc cho tế bào
mô nha chu.
KẾT LUẬN
Đánh giá ảnh hưởng của axit boric lên khả
năng sống của tế bào theo tiêu chuẩn ISO 10993 -
5: 2009 thông qua quan sát hình ảnh và phương
pháp MTT, nghiên cứu này cho thấy axit boric ở
nồng độ 0,5% và 0,75% đều không gây độc cho
hPDLSCs, tuy nhiên tế bào có phản ứng thay đổi
hình dạng một phần.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Amireddy R, Rangarao S, Lavu V, Madapusi BT (2011).
“Efficacy of a root conditioning agent on fibrin network
formation in periodontal regeneration: A SEM evaluation”.
Journal of Indian Society of Periodontology; 15(3): 228–234.
2. Apdik H, Dogan A, Demirci S, Aydın S, Sahin F (2015),
“Dose- dependent effect of boric axit on myogenic
differentiation of human Adipose-derived stem cells
(hADSCs)”. Biological Trace Element Research; 165(2):123-30.
3. Dangaria SJ, Ito Y, Luan X, Diekwisch TG (2011). “Successful
periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor
preseeding on natural tooth root surfaces”. Stem cells and
development; 20(10): 1659-1668.
4. Freimoser FM, Jakob CA, Aebi M, Tuor U (1999). “The MTT
[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium
bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric
determination of fungal cell densities”. Applied and
environmental microbiology; 65(8): 3727-3729.
5. ISO E (2009). 10993-5. Biological Evaluation of Medical
Devices. Part 5: Tests for In Vitro Cytotoxicity. International
Organization for Standardization: Geneva, Switzerland.
6. Kanoriya D, Singhal S, Garg V, Pradeep AR, Garg S, Kumar
A (2017). “Clinical efficacy of subgingivally-delivered 0.75%
boric axit gel as an adjunct to mechanotherapy in chronic
periodontitis: A randomized, controlled clinical trial”,
Journal of investigative and clinical dentistry; 9(1): e12271.
7. Karaarslan A, Ozcan KM, Ozcan M (2005). “The efficacy of
boric axit in otomycosis: an in vitro study”. The
Mediterranean Journal of Otology; 1:83-6.
8. Li R, Guo W, Yang B, Guo L, Sheng L, Chen G, Li Y, Zou Q,
et al (2011). “Human treated dentin matrix as a natural
scaffold for complete human dentin tissue regeneration”.
Biomaterials; 32(20): 4525-4538.
9. Luan Q, Desta T, Chehab L, Sanders VJ, Plattner J, Graves
DT (2008). “Inhibition of experimental periodontitis by a
topical boron-based antimicrobial”. Journal of dental research;
87(2): 148-152.
10. Saglam M, Arslan U, Buket Bozkurt S, Hakki SS (2013).
“Boric axit irrigation as an adjunct to mechanical periodontal
therapy in patients with chronic periodontitis: a randomized
clinical trial”. Journal of periodontology; 84(9): 1297-1308.
11. Tran HLB, Doan VN, Le HTN, Ngo LTQ (2014). “Various
methods for isolation of multipotent human periodontal
ligament cells for regenerative medicine”. In Vitro Cellular
and Developmental Biology-Animal; 50(7): 597-602.
12. Waerhaug J (1978). “Healing of the dento-epithelial junction
following subgingival plaque control: ii: as observed on
extracted teeth”. Journal of Periodontology; 49(3): 119-134.
Ngày nhận bài báo: 10/06/2018
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018
Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018
Các file đính kèm theo tài liệu này:
anh_huong_cua_axit_boric_len_kha_nang_song_cua_te_bao_goc_da.pdf