Ánh giá biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy trước và sau điều trị tấn công tại bệnh viện truyền máu huyết học TP. Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Thống Nhất 2019 214 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN WT1 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY TRƯỚC VÀ SAU ĐIỀU TRỊ TẤN CÔNG TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP. HỒ CHÍ MINH Phan Thị Thu Lý*, Cao Văn Động**, Nguyễn quốc Dũng**, Phan Cao Thanh Thảo**, Nguyễn Đình Tuyến***, Phan Thị Xinh**,****, Vũ Quang Huy****,*****,****** TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật Real time – PCR định lượng gen WT1 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Áp dụng để đánh giá biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy (BN BCCDT) trước và sau khi điều trị tấn công tại Bệnh viện Truyền máu huyết học thành phố Hồ Chí Minh. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu được thực hiện trên 20 BN BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 9/2018 đến tháng 5/2019. Sử dụng phương pháp tạo dòng trong T- Vector để xây dựng đường chuẩn các gen WT1 và ABL. Phản ứng Real-time PCR được ứng dụng để định lượng số bản sao gen WT1 ở bệnh nhân. Kết quả: Xây dựng thành công đường chuẩn gen WT1 và gen ABL1, ứng dụng và thiết lập được điều kiện tối ưu cho phản ứng Real-time PCR định lượng số bản sao gen WT1 với 1 cặp mồi và đoạn dò đặc hiệu. Có 19 trong số 20 bệnh nhân biểu hiện quá mức gen WT1 và 01 bệnh nhân không biểu hiện quá mức. Mười hai trong số 19 bệnh nhân biểu hiện quá mức gen WT1 có đáp ứng ở mức sinh học phân tử sau quá trình điều trị ứng với giảm ≥2-log tỉ số biểu hiện WT1/ABL1. Kết luận: Phản ứng Real-time quantitative PCR được tối ưu hóa có thể sử dụng để đánh giá sự thay đổi biểu hiện gen WT1 trước và sau quá trình điều trị tấn công ở BN BCCDT. Từ khóa: bạch cầu cấp dòng tủy, biểu hiện gen ABSTRACT WILMS TUMOR EXPRESSION EVALUATION IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENT AT PRE- TREATMENT AND POST-TREATMENT IN BLOOD TRANSFUSION AND HEMATOLOGY HOSPITAL HO CHI MINH CITY Phan Thi Thu Ly, Cao Van Dong, Nguyen Quoc Dung, Phan Cao Thanh Thao, Nguyen Dinh Tuyen, Phan Thi Xinh, Vu Quang Huy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3 - 2019: 214 - 219 Objectives: This study is conducted to implementing technical process of WT1 detection and applicating technical process on WT1 expression evaluation in acute myeloid leukemia patients at pre-treatment and post- treatment. Methods: Twenty patients in Blood Transfusion and Hematology Hospital Ho Chi Minh city, who had chronic myeloid leukemia, participated in the real-time quantitative PCR to estimating WT1 and ABL1 concentration change by designing primers and probes based on WT1 and ABL1 gene sequences and the calibration curve was established to determine WT1 and ABL1 concentration. *Khoa Xét nghiệm - Trường Cao Đẳng Y tế Quảng Nam **Bệnh viện truyền máu Huyết học Thành phố Hồ Chí Minh ***Bệnh viện Sản Nhi tỉnh Quảng Ngãi ****Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh *****Bệnh viện Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh ******Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng Y học Tác giả liên lạc: CN Phan Thị Thu Lý ĐT: 0908471459 Email: phanlyxn@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Thống Nhất 2019 215 Results: Standard curve for WT1 and ABL realtime quantitative PCR are meeting quality criteriaion and apllicated on optimal conditions for WT1 and ABL realtime quantitative PCR using specific probes and primers. Twelve of 19 patients, who have WT1 overexpression, meet the molecular biology responses at post-treatment corresponding to ≥ 2-log reduction. In which 1 of 20 patients did not overexpress WT1. Conclussions: The real-time quantitative PCR after optimization can be used to evaluate WT1 expression in acute myeloid leukemia patients at pre-treatment and post-treatment. Keywords: acute myeloid leukaemia, gen expression ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là một trong những bệnh ung thư phổ biến trên thế giới, đặc trưng bởi sự tăng sinh các tế bào dòng tủy chưa trưởng thành. Các bệnh nhân sẽ được điều trị tấn công sau khi phát hiện bệnh. Tuy nhiên, tỷ lệ tồn lưu tế bào ác tính cao sau điều trị dẫn đến nguy cơ tái phát cao. Vì vậy, việc tìm ra các dấu ấn cho phép dự đoán tái phát, đáp ứng điều trị và hướng dẫn can thiệp điều trị là rất cần thiết. Các dấu ấn được sử dụng để theo dõi điều trị (hay theo dõi bệnh tồn lưu tối thiểu _ MRD) trong BCCDT chủ yếu là các bất thường di truyền thường gặp như PML/RARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11 hay MLL/AF9. Song, đối với những BN không mang các bất thường di truyền thường gặp cần có một chỉ dấu sinh học khác để theo dõi hiệu quả điều trị. Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng mức độ biểu hiện gen WT1 thấp hay cao đi kèm với mức độ lui bệnh hay tái phát tương ứng(1,17). Do đó, WT1 là một yếu tố tiên lượng quan trọng và là mục tiêu theo dõi điều trị trong bệnh BCCDT. Gen WT1 là một gen ức chế khối u, có biểu hiện quá mức trong bệnh BCCDT, với tỷ lệ lên đến hơn 90% bệnh nhân(1). Gen WT1 nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 11, ở người bình thường xuất hiện với tỷ lệ rất thấp trong tủy xương và không tìm thấy ở máu ngoại vi(1,17). Đây là gen liên quan đến sinh bệnh học của bệnh bạch cầu khi ngăn chặn sự phát triển và biệt hóa của tế bào bằng cách ngăn chặn sự nhân đôi, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tiên lượng ở bệnh nhân ung thư máu liên quan nghịch với biểu hiện của WT1(3,11). Do đó, sự biểu hiện quá mức của WT1 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy có thể đại diện cho một dấu ấn độc lập theo dõi MRD. Với việc định lượng chính xác số bản sao của gen, Real-time PCR là một giải pháp có độ nhạy cao, chuyên biệt và đáng tin cậy. Do đó, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn, thiết lập quy trình kỹ thuật, thiết kế đoạn mồi và dò phù hợp trên gen WT1 và gen ABL để đánh giá biểu hiện của gen WT1 trên bệnh nhân BCCDT trước và sau khi điều trị tấn công tại bệnh viện Truyền máu Huyết học Thành Phố Hồ Chí Minh. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân được chẩn đoán BCCDT và điều trị tấn công theo phác đồ 7 ngày Cytarabine và 3 ngày Daunorubicin tại bệnh viện Truyền máu Huyết học thành phố Hồ Chí Minh. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả loạt ca. Phương pháp tiến hành Ly trích RNA, tổng hợp cDNA Mẫu tủy xương hoặc máu ngoại biên của 20 BN BCCDT được lấy trong chống đông EDTA tại thời điểm bệnh mới được chẩn đoán và sau điều trị tấn công. Thực hiện tách chiết RNA bằng Invitrap Spin Universal RNA Mini Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. cDNA (complement DNA) được tổng hợp từ 1 µg RNA với bộ hóa chất PrimeScript RT Master Mix của TaKaRa. cDNA sau đó được pha loãng về nồng độ 50 ng/ L, làm mẫu cho các phản ứng tiếp theo. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Thống Nhất 2019 216 Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp tạo dòng T-vector Từ trình tự chuẩn mang mã số NM_001198551.1 gen WT1 trong Genbank, chúng tôi thiết kế cặp mồi khuếch đại đoạn gen WT1 từ mẫu cDNA tại vị trí exon 7 đến exon 10 có kích thước 350 bp làm sản phẩm cho quy trình tạo dòng T-Vectơ. Tương tự, chúng tôi thiết kế 1 cặp mồi khuếch đại cho gen ABL mang mã số NM_007313.2. Phản ứng PCR được thực hiện với Phusion Hot Start II High- Fidelity DNA Polymerase, tiến hành nối vòng sử dụng T-vector từ bộ kit pGEM®-T Vector Systems (Promega – Mỹ) với thể tích phản ứng là 10 µL theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp được ủ 16 – 18 giờ ở 4oC trước khi biến nạp plasmid T-vector vào tế bào vi khuẩn E.coli khả nạp (DH5α) bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn sau biến nạp được nuôi trong môi trường LB với thời gian 90 phút ở 37oC, lắc nhẹ. Cấy dịch nuôi cấy trên đĩa LB agar có kháng sinh ampicilin và chọn lọc khóm trắng/xanh bằng Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)/X-gal. Ủ đĩa đã cấy ở 37oC qua đêm, chọn khóm trắng để giải trình tự chuỗi DNA bằng phương pháp Sanger khẳng định kết quả tạo dòng, đồng thời nhân sinh khối, thu sản phẩm tạo dòng. Ly trích DNA plasmid bằng Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Kit. Tiến hành đo mật độ quang để xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA. Số bản sao gen WT1 và ABL trong mỗi đơn vị thể tích (ký hiệu C0, đơn vị copies/L) được tính dựa trên công thức: Trong đó độ dài mạch bằng tổng độ dài plasmid (3015 bp) và đoạn gen WT1 (350 bp). Sau khi xác định được số bản sao DNA, dãy nồng độ tuyến tính được thiết lập bằng cách pha loãng để có các nồng độ mong muốn lần lượt là C2=102, C3=103, C4=104, C5=105 (copies/L). Thiết lập điều kiện Real-Time PCR Dựa vào trình tự chuỗi của gen ABL mang accession number NM_007313.2 và gen WT1 mang accession number NM_001198551.1 trong GenBank, thiết kế đoạn dò chuyên biệt gắn huỳnh quang (Bảng 1). Bảng 1: Các đoạn mồi và probe dùng trong nghiên cứu(1) Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Q.ABL-F GCC TCA GG GTC TGA GTG AAG Q.ABL-R ACA CCA TTC CCC ATT GTG AT Q.ABL-Probe FAM-GCG CTC TCG CTT TGA TTT CG- TAMRA Q.WT1-F CAG GCT GCA ATA AGA GAT ATT TTA AGC T Q.WT1-R GAA GTC ACA CTG GTA TGG TTT CTC A Q.WT1-probe FAM-CTT ACA GAT GCA CAG CAG GAA GCA CAC TG-TAMRA Phản ứng Real-Time PCR được thiết lập với 2X PrimeTime® Gene Expression Master Mix (Integrated DNA Technologies_Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhiệt độ bắt cặp của mồi, probe được thử nghiệm theo gradient nhiệt độ từ 58oC đến 65oC để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng. Chương trình cụ thể: biến tính ban đầu ở 95oC trong 5 phút, 50 chu kỳ tiếp theo với các bước biến tính 95oC trong 10 giây, tổng hợp 30 giây ở nhiệt độ thử nghiệm từ 58oC – 65oC. Đánh giá biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân BCCDT trước và sau điều trị Phản ứng Real-time quantitative PCR được thực hiện với các mẫu cDNA của bệnh nhân BCCDT được thu thập ở 2 thời điểm trước và sau khi điều trị tấn công cùng các mẫu nồng độ chuẩn. Biểu hiện gen WT1 được xác định thông qua tỉ số biểu hiện trình bày ở dạng 100 x WT1/ABL. Sự biểu hiện quá mức WT1 được xác định trong nghiên cứu này là ≥50 bản sao WT1/104ABL đối với mẫu máu ngoại biên và ≥250 bản sao WT1/10 4ABL đối với mẫu tủy(1). Dữ liệu được nhập và phân tích trên phần mềm Excel 2013. Sử dụng trung vị và phạm vi từ cực tiểu đến cực đại để mô tả tỉ số biểu hiện Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Thống Nhất 2019 217 gen WT1. Tần số và tỉ lệ được sử dụng để mô tả các trường hợp biểu hiện quá mức gen WT1. KẾT QUẢ Từ tháng 9/2018 đến tháng 5/2019, chúng tôi đã ly trích RNA từ 40 mẫu máu hoặc tủy của bệnh nhân (trước và sau điều trị tấn công) và tổng hợp cDNA thành công. Tất cả các mẫu đều cho kết quả định lượng bản sao gen ABL trên 104 copies/L (Bảng 2). Bảng 2: Bảng tổng hợp bản sao ABL phản ánh chất lượng mẫu nghiên cứu Thời điểm lấy mẫu Trung bình số bản sao ABL (copies/uL) Khoảng bản sao ABL1 (copies/uL) Chẩn đoán 240895 16200 - 908000 Sau tấn công 248185 17600 - 941000 Plasmid mang các gen được tạo dòng sau đó ly trích và giải trình tự để khẳng định tính chính xác của gen mục tiêu, kiểm tra độ tinh sạch. Kết quả cho thấy sản phẩm đạt độ tinh sạch cao (Bảng 3). Chúng tôi pha loãng thành công nồng độ bản sao các gen để có các nồng độ mong muốn lần lượt là C2=102, C3=103, C4=104, C5=105, C6=106 (copies/L). Bảng 3: Kết quả đo mật độ quang các mẫu DNA plasmid Mẫu Abs@260 Abs@280 Abs ratio Nồng độ (g/ml) DNA –WT1 0,170 0,091 1,868 85,00 DNA –ABL 0,227 0,117 1,940 113,5 Bảng 4: Phương trình đường chuẩn Khảo nghiệm Intercept Slope PCR efficiency (%) Standard Deviation R 2 WT1 40,682 -2,869 103 0,150 0,9978 ABL 37,997 -3,388 97 0,110 0,9995 Kết quả thử điều kiện phản ứng Real-time quantitative PCR với các đường chuẩn là các nồng độ tuyến tính đã pha cùng các điều kiện nhiệt độ bắt cặp, tổng hợp chuỗi của mồi và probe cho thấy nhiệt độ tối ưu cho bắt cặp, tổng hợp chuỗi của mồi và probe là 60oC trong 30 giây. Các đường chuẩn đạt độ tuyến tính cao với R2>0,99 ở tất cả các khảo nghiệm. Khảo nghiệm cho giá trị slope dao động từ -2,896 đến -3,388. Hệ số hiệu quả PCR được xác định nằm trong khoảng 97% đến 103% (Bảng 4). Đánh giá biểu hiện gen WT1 trên bệnh nhân BCCDT trước và sau điều trị Mẫu bệnh nhân BCCDT chọn vào nghiên cứu gồm 19 trường hợp được lấy mẫu tủy trước và sau điều trị; 1 trường hợp còn lại được lấy mẫu máu trước điều trị và sau điều trị. Trong tổng số 20 bệnh nhân, có 13 nam và 07 nữ, số bệnh nhân dưới 15 tuổi là 05. Trong khi độ tuổi trung bình là 23,4 ở khoảng tuổi từ 02 – 45 tuổi. Kết quả phân tích biểu hiện gen WT1 được mô tả trong (Bảng5). Bảng 5: Biểu hiện gen WT1 ở bệnh nhân BCCDT Biểu hiện gen WT1 Trung bình số bản sao WT1/10 4 ABL (copies/uL) Khoảng bản sao WT1/10 4 ABL (copies/uL) Biểu hiện quá mức Số ca (tỷ lệ %) Chẩn đoán 30416,3 55,6 - 146055 19 (95%) Sau tấn công 2970,3 1,6 – 52285,7 5 (%) BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại đoạn gen WT1 vùng từ exon 7 đến exon 10 với Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase là enzyme xúc tác cho phản ứng. Đây là một polymerase có độ trung thực cao và có khả năng tạo ra sản phẩm PCR có đầu 3’A overhangs thuận lợi cho ứng dụng tạo dòng trong T-vector. Kết quả phân tích giải trình tự trên mẫu khuẩn lạc cho thấy chúng tôi đã tạo dòng gen WT1 thành công, làm tiền đề rất quan trọng trong việc xây dựng và thiết lập phản ứng Real-time PCR đường chuẩn định lượng gen WT1. Ghi nhận từ các thử nghiệm phản ứng Real-time PCR, các thông số của các đường chuẩn thu được cho thấy phản ứng có độ nhạy và độ tin cậy cao với ngưỡng cut off của WT1 là 40,6 chu kỳ và ABL là 38 chu kỳ trong điều kiện nhiệt độ bắt cặp mồi và khuếch đại là 60oC. Do đó, chúng tôi chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng Real-time PCR đường chuẩn định lượng gen WT1 như sau: biến tính ban đầu ở 95oC trong 5 phút, 42 chu kỳ tiếp theo với các bước Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Thống Nhất 2019 218 biến tính 95oC trong 10 giây, tổng hợp 30 phút ở nhiệt độ 60oC. Gen WT1 là một gen ức chế khối u có liên quan đến Wilms Tumor và các hội chứng liên quan khác như WAGR và Denys-Drash(2). Trong tủy xương bình thường, các tế bào tiền tạo máu biểu hiện gen WT1 rất thấp và giới hạn. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có thể thấy sự tăng biểu hiện của WT1 trong BCCDT, bạch cầu cấp dòng lympho, hội chứng loạn sinh tủy và giai đoạn tiến triển của bạch cầu mạn dòng tủy(5). Đặc biệt, phần lớn bệnh nhân BCCDT biểu hiện giá trị rất cao của WT1 khi chẩn đoán, việc đánh giá biểu hiện WT1 là một phương pháp hữu hiệu để theo dõi MRD sau khi hóa trị hoặc ghép tủy xương hoặc trong quá trình điều trị(1). Gen WT1 được biểu hiện ở hơn 90% bệnh nhân BCCDT trong cả mẫu máu ngoại biên và mẫu tủy(1). Sự biểu hiện quá mức WT1 được sử dụng như một dấu ấn định lượng MRD, đặc biệt đối với những bệnh nhân không phát hiện bất thường NST hoặc phân tử (khoảng 50%)(1,19). Trong nghiên cứu này, kết quả phân tích cho thấy tại thời điểm chẩn đoán (Bảng 6), có 19 trong số 20 bệnh nhân BCCDT biểu hiện quá mức gen WT1, chiếm 95%. Có 01 bệnh nhân có tỉ số biểu hiện thấp, bằng 0,6 và được xem như không biểu hiện quá mức. Kết quả của chúng tôi tương tự như các nghiên cứu khác. Trong một nghiên cứu của Kwon M và các cộng sự năm 2012 cho thấy, hơn 90% bệnh nhân BCCDT có biểu hiện quá mức gen WT1. Kết quả định lượng gen WT1 trước và sau khi ghép của bệnh nhân cùng với kết quả chimerism đã được so sánh với kết quả của tế bào dòng chảy của nhóm tác giả đã chỉ ra rằng biểu hiện WT1 ở bệnh nhân BCCDT có liên quan đến bệnh tồn lưu ác tính(16). Bảng 6: Biểu hiện gen WT1 theo phân nhóm các tổ hợp gen thường gặp Bất thường gen/ tổ hợp gen Số mẫu (n) Số bản sao WT1/10 4 ABL (copies/uL) trước điều trị Trung bình (khoảng) Số bản sao WT1/10 4 ABL (copies/uL) sau điều trị Trung bình (khoảng) Đáp ứng sinh học phân tử (n) AML1/ETO 4 32463,9 (14731,2 - 53484) 13130,9 (25,9 – 52285,7) 3 CBFB/MYH11 5 33145,6 (19690,6 - 69396,6) 104,7 (30 – 265,9) 4 PML/RARA 1 146055 232,4 1 MLL/AF9 1 10070,2 696,4 0 FLT3-ITD 4 33452,5 (10926 - 69396,6) 62,6 (1,6 – 99,3) 4 NPM1 1 17956,7 204,2 0 KHÁC 5 14849,4 (55,7 - 43956) 1013 (42 – 4154,5) 1 Tổng 20* 12* *Trong đó có 01 BN mang đồng thời đột biến FLT3 và tổ hợp gen CBFB-MYH11 Phân nhóm kết quả định lượng gen WT1 (Bảng 6) cho thấy có 12 trong tổng số 20 bệnh nhân có đáp ứng ở mức sinh học phân tử tương đương với giảm trên 2-log biểu hiện gen WT1(1), chiếm 60%. Kết quả này phù hợp với các kết quả theo dõi điều trị dựa trên bất thường các tổ hợp gen trên mỗi bệnh nhân. Cụ thể, trường hợp bệnh nhân BCCDT thể tiền tủy bào, mang tổ hợp gen PML/RARA có tiên lượng tốt và cho kết quả MRD bằng tổ hợp gen âm tính tại thời điểm sau điều trị tấn công. Trong khi đó, kết quả định lượng gen WT1 tại thời điểm chẩn đoán cho thấy bệnh nhân biểu hiện quá mức với 146055 bản sao và tại thời điểm sau tấn công chúng tôi ghi nhận là 232 bản sao. Như vậy, bệnh nhân này đã giảm biểu hiện gen WT1 trên 2-log, được xem như đạt đáp ứng ở mức sinh học phân tử. Trên 01 bệnh nhân khác mang tổ hợp gen MLL/AF9, kết quả theo dõi điều trị bằng RT-PCR tổ hợp gen MLL/AF9 cho thấy bệnh nhân không đạt lui bệnh sau giai đoạn điều trị tấn công. Định lượng số bản sao của bênh nhân này ghi nhận, tại thời điểm chẩn đoán bệnh nhân biểu hiện quá mức WT1 với 10070 bản sao và sau điều trị tấn công số bản sao WT1 là 696 bản sao. Bệnh nhân này chưa giảm đạt được đến mức 2-log số bản sao Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV. Thống Nhất 2019 219 WT1 lúc chẩn đoán (100,7 bản sao), do đó không đạt lui bệnh ở mức phân tử. Điều này phù hợp với kết quả theo dõi MRD bằng tổ hợp gen MLL/AF9. Trong mỗi phân nhóm theo bất thường các tổ hợp gen, các bệnh nhân khác nhau có biểu hiện gen WT1 khác nhau và đáp ứng điều trị cũng khác nhau. Điều này có thể giải thích do các bệnh nhân khác nhau, ở mỗi giai đoạn mức độ tiến triển bệnh khác nhau do đó mức độ biểu hiện mRNA của gen WT1 cũng khác nhau(8). KẾT LUẬN Nghiên cứu xác định 95% bệnh nhân BCCDT có biểu hiện quá mức gen WT1 tại thời điểm chẩn đoán. Phản ứng real-time PCR đường chuẩn được tối ưu hóa có thể đánh giá sự thay đổi biểu hiện gen WT1 trước và sau quá trình điều trị giúp theo dõi BTLTT ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ayatollahi H, Sadeghian M. H, Naderi M, et al (2017). "Quantitative assessment of Wilms tumor 1 expression by real- time quantitative polymerase chain reaction in patients with acute myeloblastic leukemia". J Res Med Sci, 22:54. 2. Barragán E, Cervera J, Bolufer P, et al (2004). Prognostic implications of Wilms’ tumor gene (WT1) expression in patients with de novo acute myeloid leukemia. Haematologica, 89:926-33. 3. Bergmann L, Miething C, Maurer U, et al (1997). High levels of Wilms’ tumor gene (WT1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome. Blood; 90:1217-25. 4. Brieger J, Weidmann E, Maurer U, et al (1995). The Wilms’ tumor gene is frequently expressed in acute myeloblastic leukemias and may provide a marker for residual blast cells detectable by PCR. Ann Oncol; 6:811-6. 5. Candoni A, Tiribelli M, Toffoletti E, et al (2009). Quantitative assessment of WT1 gene expression after allogeneic stem cell transplantation is a useful tool for monitoring minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Eur J Haematol; 82:61-8. 6. Cilloni D, Renneville A, Hermitte F, et al (2009). "Real-time quantitative polymerase chain reaction detection of minimal residual disease by standardized WT1 assay to enhance risk stratification in acute myeloid leukemia: a European LeukemiaNet study". J Clin Oncol, 27(31):5195-5201. 7. Cilloni D, Saglio G (2003). Usefulness of quantitative assessment of Wilms tumor suppressor gene expression in chronic myeloid leukemia patients undergoing imatinib therapy. Semin Hematol; 40(2):37-41. 8. Di Stasi A, Jimenez AM, Minagawa K, et al (2015). Review of the results of WT1 peptide vaccination strategies for myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia from nine different studies. Front Immunol; 6:36. 9. Dohner H, Estey EH, Amadori S, et al (2010). "Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet". Blood, 115(3):453-474. 10. Grimwade D, Hills RK, Moorman AV, et al (2010). "Refinement of cytogenetic classification in acute myeloid leukemia: determination of prognostic significance of rare recurring chromosomal abnormalities among 5876 younger adult patients treated in the United Kingdom Medical Research Council trials". Blood, 116 (3):354-365. 11. Hirose M. (1999), the role of Wilms’ tumor genes. J Med Invest; 46:130-40. 12. Hokland P, Ommen HB, Mule MP, et al (2015). "Advancing the Minimal Residual Disease Concept in Acute Myeloid Leukemia". Semin Hematol, 52 (3):184-192. 13. Jacobsohn DA, Loken MR, Fei M, et al (2018). "Outcomes of MeasurABL1e Residual Disease in Pediatric Acute Myeloid Leukemia before and after Hematopoietic Stem Cell Transplant: Validation of Difference from Normal Flow Cytometry with Chimerism Studies and Wilms Tumor 1 Gene Expression”. Blood Marrow Transplantt, 24(10):2040-2046. 14. Jiang Y, Liu L, Wang J, et al (2017). "The Wilms' tumor gene-1 is a prognostic factor in myelodysplastic syndrome: A meta analysis, 9(22):16205-16212. 15. Koizumi Y, Furuya D, Endo T, et al (2018). "Quantification of Wilms' tumor 1 mRNA by digital polymerase chain reaction". Int J Hematol, 107(2):230-234. 16. Kwon M, Martínez-Laperche C, Infante M, et al (2012). Evaluation of minimal residual disease by real-time quantitative PCR of Wilms’ tumor 1 expression in patients with acute myelogenous leukemia after allogeneic stem cell transplantation: Correlation with flow cytometry and chimerism. Biol Blood Marrow Transplant; 18:1235-42. 17. Ostergaard M, Olesen LH, Hasle H, et al (2004). "WT1 gene expression: an excellent tool for monitoring minimal residual disease in 70% of acutemyeloid leukaemia patients - results from a single-centre study". British Journal of Haematology, 125(5):590-600. 18. Petiti J, Rosso V, Lo Iacono M, et al (2018). "Prognostic significance of The Wilms' Tumor-1 (WT1) rs16754 polymorphism in acute myeloid leukemia". Leuk Res, 67:6-11. 19. Polák J, Hájková H, Maalaufová-Soukupová J, et al (2012). Estimation of molecular upper remission limit for monitoring minimal residual disease in peripheral blood of acute myeloid leukemia patients by WT1 expression. Exp Ther Med; 3:129-33. 20. Rossi G, Minervini MM, Carella AM, et al (2016). Wilms' Tumor Gene (WT1) Expression and Minimal Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. In: van den Heuvel- Eibrink MM. (Ed) Wilms Tumor. Codon Publications Copyright: The Authors, Brisbane (AU). Ngày nhận bài báo: 15/05/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/05/2019 Ngày bài báo được đăng: 02/07/2019