12 điều hòa sự biểu hiện của CYCLIN D1, CDK-2 và sự PHOSPHORYL hóa PROTEIN RETINOBLASTOMA tại vị trí Ser780 và Ser795 của MEK-ERK trong ung thư tế bào gan (HCC)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học 12 ĐIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA CYCLIN D1, CDK-2 VÀ SỰ PHOSPHORYL HÓA PROTEIN RETINOBLASTOMA TẠI VỊ TRÍ Ser780 VÀ Ser795 CỦA MEK-ERK TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN (HCC) Đỗ Phúc Tiến, Trần Evelyne, Chow Pierce, Tan Puay Hoon, Soo Khee Chee, Văn Tần and Huỳnh Hùng TÓM TẮT Ung thư tế bào gan (HCC) là một trong những lọai ung thư thường gặp ở vùng Đông Nam Á. Mặc dù sự bất họat của protein Retinoblastoma p105 (pRB) thường đi kèm với sự tăng trưởng của tế bào, chức năng của nó trong ung thư tế bào gan vẫn chưa được thiết lập. Trong nghiên cứu này, sự tăng phosphoryl hóa của pRB tại vị trí Ser 780 và Ser 795 được phát hiện bởi phương pháp Western blot là 71% và 63% ở các trường hợp ung thư tế bào gan được khảo sát. Nghiên cứu hóa mô miễn dịch cho kết quả 13% không thể phát hiện sự biểu hiện của pRB, phần còn lại cho thấy có hiện tượng tăng phosphoryl hóa pRB trong nhân của tế bào ung thư gan. Các tế bào lọan sản, tế bào lành tính và tế bào mô đệm có mức độ biểu hiện pRB cao trong nhân, nhưng lại có mức độ biểu hiện thấp đối với dạng phosphoryl hóa của pRB. Sự biểu hiện quá mức (over-expression) và sự phosphoryl hóa của ERK1/2 cũng được phát hiện bởi phương pháp Western blot trong 91% và 69% các trường hợp ung thư tế bào gan được khảo sát. Một cách tương tự, sự biểu hiện quá mức của E2F-1, Cyclin D1, cdc-2, Cdk-2, Cdk-4 va Cyclin A tương ứng là 64%, 43%, 28%, 71% và 63% các trường hợp HCC được khảo sát. Trên in vitro, điều trị tế bào u gan HepG2 bằng chất ức chế đặc hiệu của MEK1/2 –U0126 dẫn đến làm ức chế sự biểu hiện của protein Cyclin D1, cdc -2 và Cdk-4, và gây ra hiện tượng giảm phosphoryl hóa của pRB tại vị trí Serine780 và 795. Sự biểu hiện quá mức của MEK1 đã được họat hóa trong tế bào HepG2 làm tăng biểu hiện của Cyclin D1 và phosphoryl hóa pRB tại vị trí Serine 780 và 795. Những kết quả này gợi ý rằng, cơ chế MEK- ERK đóng một vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa sự biểu hiện của Cyclin D1, Cdc2 và Cdk-2, và sự ức chế gen kiềm hãm sinh ung Retinoblastoma trong ung thư tế bào gan. SUMMARY REGULATION OF CYCLIN D1, CDK-2 EXPRESSION AND PHOSPHORYLATION RETINOBLASTOMA AT SER780 AND SER795 OF MEK-ERK IN HCC Do Phuc Tien, Tran Evelyne, Chow Pierce, Tan Puay Hoon, Soo Khee Chee, Van Tan and Huynh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 8 * Supplement of No 1 * 2004: 89 – 96 Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies in South East Asia. Although inactivation of retinoblastoma p105 (pRB) is often associated with cellular growth, its function in HCC has not been established. In this study we reported that hyperphosphorylation of pRB at Ser780 and Ser795 was detected by Western blot analysis in 71% (33 of 46) and 63% (29 of 46) of HCCs examined respectively. Immunohistochemical study revealed that pRB expression was undetectable in 13% (6 of 46) of HCCs examined and hyperphosphorylated pRB was localized in the nuclei of hepatocarcinoma cells. Dysplasia or *1Laboratory of Molecular Endocrinology, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre of Singapore, 2Department of General Surgery, 3Department of Pathology, Singapore General Hospital, Singapore 169610 and 4Department of Surgery, BinhDan Hospital, HoChiMinh City, VietNam. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 89 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 benign hepatocytes or stromal cells were strongly positive nuclear staining for pRB but exhibited weak nuclear staining for phosphorylated pRB. Over-expression and phosphorylation of ERK1/2 were also detected by Western blot analysis in 91% (42 of 46) and 69% (32 of 46) of HCCs examined, respectively. Similarly, over- expression of E2F-1, cyclin D1, Cdk-2, Cdk-4, and cyclin A was found in 64% (30 of 46), 43% (26 of 46), 28% (11 of 46), 71% (33 of 46) and 63% (29 of 46) HCCs studied respectively. In vitro treatment of HepG2 with MEK1/2 specific inhibitor U0126 resulted in cell cycle arrest, inhibited expression of cyclin D1, Cdc-2 and Cdk- 2 and caused hypophosphorylation of pRB at Ser780 and Ser795. Over-expression of activated MEK1 in HepG2 increased expression of cyclin D1 and phosphorylation of pRB at Ser780 and Ser795. The results suggest that MEK-ERK pathway plays an important role in regulation of cyclin D1, Cdc-2 and Cdk-2 expression and inactivation of retinoblastoma tumour suppressor gene in hepatocellular carcinoma. DẪN NHẬP Ung thư tế bào gan (HCC) chiếm khoảng 40% các trường hợp ung thư ở Đông Nam Á, Nhật Bản và Châu Phi. Tỷ lệ mới mắc hàng năm vào khoảng từ 0. 25 đến 1. 2 triệu trường hợp1, 2. Bệnh thường đi kèm với sự tiếp xúc virus Viêm gan siêu vi B, C và Aflatoxin B11, 2. Tần xuất biểu hiện ở nam gấp 2-5 lần so với ở nữ. Việc điều trị HCC vẫn cho kết quả hạn chế. Phần lớn bệnh nhân bị ung thư tế bào gan nhập viện ở giai đọan muộn, với tiên lượng rất xấu3. Tỷ lệ sống sau 5 năm vào khỏang 25-39% sau phẫu thuật 4. Khả năng sống kéo dài rất khó ở bệnh nhân HCC do ung thư tái phát, di căn hoặc sự xuất hiện của khối u mới5, 6. Hiện tại vẫn chưa có phương pháp điều trị hỗ trợ nào có thể kéo dài khả năng sống của bệnh nhân một cách rõ rệt7. Mặc dù cơ chế phân tử quá trình sinh ung của HCC vẫn chưa rõ, một vài dấu hiệu cho thấy HCC có thể là kết quả của quá trình bất họat những gen kiềm hãm sinh ung (tumour suppressor gene), sự họat hoá những gen sinh ung và các yếu tố tăng trưởng. Người ta đã xác định hơn 20 gen đã bị họat hóa, bất họat hay bị đột biến trong HCC. 8 Thay đổi của p53, pRB9, 10và những rối lọan chức năng của p16, p21 và p27 dẫn đến tăng phosphoryl hóa pRB đã được báo cáo trên HCC 11. Gần đây chúng tôi khám phá rằng có sự tăng biểu hiện IGF-II trên phần lớn mẫu HCC được khảo sát 12. Phần lớn các gen được đề cập liên quan đến việc điều hòa con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào và chu trình tế bào. Gen Retinoblastoma (pRB) là một gen kiềm hãm sinh ung (tumour suppressor gene) mã hóa cho một protein có chức năng quan trọng trong chu trình tế bào13. Protein pRB là một phosphoprotein trong nhân tế bào, có 928 aa và trọng lượng phân tử là 105kDalton, với chức năng bình thường là kiềm hãm sự tăng sinh tế bào nhờ làm giảm khả năng sao chép DNA và ngăn ngừa phân chia tế bào 13-15. Sự gia tăng biểu hiện của protein pRB làm ngưng tăng trưởng của các tế bào ung thư trên in vitro và in vivo14-16. Sự tái biểu hiện (re-expression) protein pRB ở tế bào ung thư làm ngưng chu trình sao chép tế bào ở pha G0- G117. Tác dụng kiềm hãm tăng trưởng của pRB một phần là nhờ khả năng kết hợp với E2F và histone deacetylase làm giảm họat tính của gen E2F trong chu trình tế bào18, 19. Tăng phosphoryl hóa của pRB bởi những phức hợp Cyclin/cdks làm chu trình tế bào tiếp tục diễn tiến. Một vài phức hợp ảnh hưởng đến sự phosphoryl hóa của pRB trên in vivo, đó là cyclin D1/cdk-4, Cyclin E/cdk-2 và Cyclin A /cdk-2. Cyclin D1 /cdk-4 thường phosphoryl hóa ở vị trí Serine 78020 và Serine 79521, 22. Trên in vivo, pRB được phosphoryl hóa ở vị trí Serine 780 không gắn kết với E2F. Những đột biến của pRB làm mất khả năng phosphoryl hóa thường có tác dụng ức chế tăng trưởng mạnh hơn 23- 25. Một số lớn các gen liên quan đến việc điều hòa chu trình tế bào được điều hòa bởi họat tính của E2F bao gồm Cyclin E, P107 Cyclin A, cdc226. Sự gia tăng hằng dịnh của MEK1 đã được họat hóa (activated MEK1) thường gặp ở các dòng tế bào ung thư27, 28. Sự họat hóa hằng định MEK1 góp phần đến sự sống còn29, dịch chuyển30và sự chuyển dạng tế bào31, 32. Sự họat hóa của ERK điều hòa họat tính Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 90 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học của một số các chất, bao gồm yếu tố sao mã p62 (Elk- 1), c-myc, ATF2, phức hợp AP-1, c-jun và c-fos. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày các protein được họat hóa ở vị trí Serine780, Serine795. Sự tăng biểu hiện của protein ERK, E2F-1, Cyclin D1, cdk-2, Cyclin A cũng được khảo sát. Việc điều trị dòng tế bào u gan Hep G2 với chất ức chế MEK1/2- U0126 làm ức chế họat tính MEK-ERK, dẫn đến giảm họat tính phosphoryl hóa pRB và ức chế sự biểu hiện Cyclin D1và cdk-2. Sự tăng biểu hiện của MEK1 đã được họat hóa ở HepG2 cell làm tăng biểu hiện cyclin D1 và làm phosphoryl hóa pRB ở vị trí Ser 780 và 795. Điều này cho thấy con đường họat hóa MEK- ERK đóng một vai trò quan trọng trong sự biểu hiện của protein Cyclin D1, cdk-2, và phosphoryl hóa pRB trong tế bào ung thư gan VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa Chất U0126 và LY294002 được mua từ New England Biolabs. Những thuốc này được hòa tan trong DMSO với nồng độ cuối cùng không vượt quá 0. 1%. Chúng được bảo quản trong điều kiện ít ánh sáng ở -20°C. Các kháng thể dùng trong Hóa mô miễn dịch và Western blot được mua từ công ty Santa Cruz Biotechnology và Cell Signalling Technology. Bệnh nhân và bệnh phẩm Các mẫu bệnh phẩm bao gồm mô bướu và mô lành kế cận khối u của 46 bệnh nhân điều trị tại Bệnh Viện Đa Khoa Singapore. Bệnh phẩm thu được trong lúc mổ, đông lạnh trong liquid nitrogen và dự trữ ở - 80°C cho đến khi sử dụng. Một phần bệnh phẩm tương tự được cố định trong formalin 10% và đóng khối trong paraffin. Tất cả các trường hợp ung thư tế bào gan kể trên đều được xác nhận bởi chẩn đóan giải phẫu bệnh. Dữ kiện lâm sàng của các bệnh nhân được thu thập từ Bệnh Viện Đa Khoa Singapore và Trung tâm Ung Thư Quốc Gia Singapore. Hóa mô miễn dịch Những lát cắt của mô (dày khoảng 5 micromet)trên các tiêu bản (slides) được khử paraffine trong xylene và được tái hấp thu nước trong dung dịch Ethanol12. Sau đó các slides được đun trong dung dịch Sodium citrate 10Mm PH 6. 0 trong 20 phút nhằm khôi phục lại hoạt tính của các kháng nguyên. Slides được ngâm trong dung dịch methanol có chứa hydrogen peroxide 3% với mục đích làm giảm hoạt tính của các men peroxidase nội sinh. Để làm giảm những dấu hiệu không đặc hiệu, slides sẽ được ngâm trong skim milk 5% trong 15 phút. Slides sau đó được ủ với kháng thể kháng protein pRB đã phosphoryl hóa tại vị trí Ser 780 và Ser 795 ở nhiệt độ 4°C. Bước tiếp theo là dùng phức hợp Streptavidin- Biotin, được thực hiện theo những chỉ dẫn sẵn có của sản phẩm, thuộc công ty Lab Vision, Fremont, CA. Kết quả sau đó được đánh giá bởi chuyên gia giải phẫu bệnh học. Phương pháp Western blot Các mẫu bệnh phẫm, bao gồm mô bướu và mô lành kề cận bướu, được làm đồng nhất (homogenize) trong dung dịch ly giải. Các bước tiếp theo tuân theo các công thức sẵn có12. Nuôi cấy tế bào Tế bào u gan ở người HepG2 có được từ American Type Culture Collection. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường có 10% fetal bovine serum (FBS). Chúng được điều trị với 10 μM U0126 hoặc 10 μM LY294002 trong vòng 24 giờ. Các tế bào đối chứng được điều trị với dimethylsulfoxide (DMSO). Các tế bào sau đó được thu họach và phân tích Western blot. Các dòng tế bào có MEK1 họat hóa: Tế bào u gan HepG2 được tải nạp (transfect) với 5μg pUSE-MEK1 hoặc plasmic pUSE control và 28μl Lipofectamine reagent theo các bước có sẵn. Sau 48 giờ, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường có 800μ /ml G418. Bốn tuần sau khi transfect, các dòng tế bào khác nhau được phân lập và phân tích Western blot. Phân tích thống kê Trong việc đánh giá kết quả Western blot, đậm Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 91 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 độ của các băng protein được tính tóan và chuẩn hóa với băng protein α-tubulin. Sự khác nhau về mức độ biểu hiện protein được phân tích bằng ANOVA test. KẾT QUẢ Những dữ kiện về giải phẫu bệnh được tóm tắt như sau: 33% (15/46)số bệnh nhân được khảo sát có kèm xơ gan, trong số này 26% (12/46) được chẩn đóan lọan sản tế bào gan. 70% bệnh nhân có khối u đa ổ. 56% (26/46) số bệnh nhân có sự hình thành khối u vệ tinh. Tỷ lệ sống sót sau 1 năm của các bệnh nhân vào khỏang 74% (34/46). Trong nghiên cứu này, chúng tôi không khảo sát tỷ lệ sống bình quân cũng như tỷ lệ sống sau 5 năm của các bệnh nhân. pRB đóng một vai trò quan trọng trong sự điều hòa chu trình tế bào13, sự kiềm hãm phát triển tế bào13-15và sự tăng trưởng khối u15, 33. Mức độ của pRB không tăng rõ rệt giữa các mẫu mô bướu với mô lành kế cận. Tuy nhiên có sự tăng phosphoryl hóa trong các mô ung thư, biểu hiện bằng sự dịch chuyển lên trên của băng protein ở vị trí 120 Kdalton, khi so sánh với băng protein của mô lành kế cận. Đối với dạng phosphoryl hóa ở vị trí Serine 780 và 795, những mẫu khối u có sự gia tăng biểu hiện tương ứng là 71% (33/46) và 63% (29/46) so với mô lành. Dạng phosphoryl hóa của pRB ở vị trí serine 807/811 biểu hiện rất thấp trong HCC và hầu như không thể phát hiện ở mô lành kế cận. Yếu tố họat hóa sao mã E2F-1 đóng một vai trò quan trọng đối với việc điều hòa biểu hiện gen trong quá trình tăng trưởng của tế bào. Dạng giảm phosphoryl hóa của protein pRB kết hợp với E2F-1, từ đó ngăn ngừa sự họat hóa của các gen cần thiết cho pha G2 của chu trình tế bào, làm cho chu trình tế bào ngừng ở pha G134, 35. Hình 1 cho thấy protein E2F-1 tăng rõ rệt trong 64% (30/46) các trường hợp HCC được khảo sát. Và có sự tăng tỷ lệ thuận giữa tăng phosphoryl hóa của pRB và sự gia tăng biểu hiện của E2F-1. Kết quả này chứng tỏ có hiện tượng tăng phosphoryl hóa pRB ở vị trí Serine 780 và 795 trong HCC nhưng không có ở mô lành kế cận. Những khối u HCC thì không đồng nhất về mặt phân lọai tế bào, vì vậy cần đánh gía về mặt tế bào học sự tăng phosphoryl hóa của protein pRB. Tất cả 46 mẩu bệnh phẫm đều được làm hóa mô miễn dịch với kháng thể kháng protein pRB dạng được phosphoryl hóa ở các vị trí Serine 780 và 795. Hình 2 cho thấy có 90-100% các tế bào ung thư tăng biểu hiện protein pRB trong nhân tế bào. Trong khi đó ở mô lành kế cận hoặc mô gan xơ không biểu hiện hoặc biểu hiện rất mờ nhạt dấu hiệu của protein pRB. Các tế bào biểu mô ống mật và tế bào mô đệm không biểu hiện. Khi dùng các tiêu bản kể trên nhuộm với kháng thể kháng protein pRB ở dạng được phosphoryl lẫn không được phosphoryl hóa, thì có sự biểu hiện đồng nhất trong nhân của các tế bào lành tính và mô gan xơ ở tất cả 46 mẫu bệnh phẩm. Slides A&B: nhuộm với kháng thể kháng pRB phosphoryl hóa tại vị trí Ser 780. Slides C&D: nhuộm với kháng thể kháng pRB phosphoryl hóa tại vị trí Ser 795. Hình 3 cho thấy có hiện tượng gia tăng biểu hiện Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 92 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học của protein Cyclin D1, Cyclin A, Cdk-2 và Cdk-4 trong 43% (26/46), 63% (29/46), 28% (11/46) và 71% (33/46) trong các khối u so với mô lành kế cận. Hình 2 Hình 4 cho thấy có rằng sự biểu hiện của protein ERK tăng trong 91% các trường hợp HCC được khảo sát. Về mặt định lượng, mức độ biểu hiện của ERK tăng 1. 6 lần ở mô ung thư so với mô bình thường. Khi thực hiện phương pháp Western blot với kháng thể kháng protein ERK ở dạng họat hóa, 69% (32/46) trường hợp HCC có sự tăng biểu hiện ERK. Để chứng tỏ protein MEK-ERK cần thiết cho sự tạo thành Cyclin D1, E2F-1, Cdk-2, sự phosphoryl hóa pRB và chu trình tế bào;chúng tôi điều trị dòng tế bào u gan của người Hep G2 với chất ức chế MEK1/2-U0126. Tếbào HepG2 được điều trị với 10 microgram U0126 hoặc 10 microgram chất ức chế PI-3 kinase LY294002 trong 24giờ. Tế bào đối chứng được điều trị với DMSO. Bằng phương pháp Western blot cho thấy chất U0126 có tác dụng làm giảm rõ rệt sự biểu hiện Cyclin D1 và cdk-2 nhưng không làm giảm E2F-1 và cyclin E, đồng thời làm giảm sự phosphoryl hóa của pRB ở vị trí Ser 785 và 790 khi so sánh với nhóm chứng. Những kết qủa này cho thấy sự họat hóa con đường dẫn truyền MEK-ERK là cần thiết cho sự phosphoryl hóa pRB tại vị trí Ser 780, 795 và sự biểu hiện của Cyclin D1, Cdk-2. Hình 4 BÀN LUẬN Sự rối lọan chức năng của những protein liên quan đến chu trình tế bào là một trong những yếu tố Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 93 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 chính làm phát triển HCC36-38. Sản phẩm của gen pRB đóng vai trò điều hòa âm tính đối với sự tăng sinh, biệt hóa tế bào và sự sinh ung thư14-16. Hình 5 Sự ức chế tăng trưởng tế bào của protein pRB phụ thuộc vào sự kết hợp với yếu tố E2F. Dạng không phosphoryl của pRB cần thiết cho sự tương tác với E2F. Trong G0 và giai đọan sớm của G1 của chu trình tế bào, dạng không phosphoryl của pRB kiềm hãm họat tính gây sao mã của các yếu tố E2Fs. Khi chu trình tế bào tiếp tục tiến triển, pRB trở nên tăng phosphoryl hóa, do đó làm tách rời phức hợp pRB- E2Fs; và vì vậy cho phép biểu hiện của những gen cần thiết cho sự tiến triển của chu trình tế bào. Những nghiên cứu trước đây11 cho thấy pRB dạng gia tăng phosphoryl hóa rất thường gặp ở những trường hợp khối u HCC có kích thước lớn hơn 5 cm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cho thấy có Hình 5sự tăng đáng kể các protein Cyclin D1, E2F-1, Cyclin A, Cdk- 2 và Cdk-4 ở những mẫu mô HCC so với mô lành kế cận. Những quan sát này phù hợp với các kết quả báo cáo trước đây38. Sự phosphoryl hóa pRB ở vị trí Ser 780 và 795 thấy trong 71% và 63% các trường hợp HCC ở cả giai đọan sớm và giai đọan muộn của ung thư gan. Sự tích lũy Cyclin D1, Cdk-2, Cdk-4, Cyclin E cho phép hình thành những phức hợp Cyclin E/cdk-2 và Cyclin D1/cdk-4. Sự phosphoryl hóa pRB ở vị trí Ser bởi Cyclin D1/cdk-4 làm ức chế sự tương tác với yếu tố sao mã, cho phép biểu hiện các gen cần thiết cho pha S của chu trình tế bào. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy biểu hiện của pRB không có trong 13% các trường hợp HCC được khảo sát, tương tự với các công trình nghiên cứu trước cho kết quả từ 20-28%11, 39. Cơ chế phân tử của sự mất khả năng biểu hiện protein pRB vẫn chưa rõ, có thể do mất hoặc đột biến ở vị trí pRB. Mặc dù cả hai sự mất biểu hiện và sự biểu hiện quá mức của pRB được quan sát với tần xuất cao trong HCC kém biệt hóa so với HCC biệt hóa vừa và biệt hóa cao, trong nghiên cứu của chúng tôi không Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 94 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học có trường hợp HCC nào biểu hiện quá mức protein pRB. Sự khác nhau này vẫn chưa rõ. Sự biểu hiện quá mức và sự phosphoryl hóa ERK cũng được phát hiện trong 91% và 69% trường hợp. Phân tích in vivo đối với pRB cũng cho kết quả tương tự. Việc điều trị tế bào ung thư gan bằng chất ức chế MEK1/2 dẫn đến ức chế sự phosphoryl hóa pRB và làm giảm biểu hiện protein Cdk-2 và Cyclin D1. Hơn nữa sự biểu hiện quá mức MEK1 đã hoạt hóa làm tăng biểu hiện của Cyclin D1, Cdk-2. Santoni-Rugiu và cộng sự36 đã báo cáo hiện tượng tăng biểu hiện của Cyclin D1 và tăng phosphoryl hóa pRB trên ung thư tế bào gan gây ra trên chuột transgenic c-myc/TGF-α. Sự biểu hiện quá mức của Cyclin D1 trên HCC cũng đã được báo cáo40-42. Cyclin D1 làm tăng diễn tiến chu trình tế bào43 và kích họat quá trình sinh ung ở ung thư tế bào gan37. Và mức độ tăng protein Cyclin D1 đi kèm với những thể tiến triển nhanh của HCC38, 42, 44, 45. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự biểu hiện của Cyclin D1 được điều hòa bởi con đường dẫn truyền MEK-ERK, do đó những đột biến làm họat hóa MEK-ERK sẽ làm tăng biểu hiện của protein Cyclin D1 trong HCC. Điều này cũng phù hợp với những nghiên cứu trước đây đã chứng tỏ rằng họat tính gây sao mã của gen Cyclin D1 xảy ra nhờ con đường dẫn truyền tín hiệu Ras qua yếu tố ERK1/246-49 Mặc dù cơ chế bệnh sinh của HCC vẫn chưa được biết, nghiên cứu của chúng tôi đề nghị vai trò của ERK trong sự điều hòa họat tính của pRB/E2F trong HCC. Giả thuyết này cũng phù hợp với kết quả khi tải nạp (transfect) dòng tế bào HepG2 với MEK1 dẫn đến tăng phosphoryl hóa pRB và làm tăng biểu hiện Cyclin D1. Hơn nữa, khi điều trị với chất ức chế MEK1/2 –U0126 làm giảm sự phosphoryl hóa của pRB tại vị trí Ser 780 và Serine 795, đồng thời làm giảm sự biểu hiện của Cyclin D1 và Cdk-2. Do đó chúng tôi nghĩ rằng sự họat hóa yếu tố MEK-ERK, nhưng không họat hóa các yếu tố PKC, Raf, Abl, MEKK, ERK, JNK MKK3, MKK-4/SEK, MKK-6, Cdk-2 hay Cdk-450, là cần thiết cho sự biểu hiện của Cyclin D1 và Cdk-2 cũng như làm tăng phosphoryl hóa pRB tại vị trí Serine780 và 795. Tuy nhiên vẫn cần phải xác định vai trò của pRB có phải là một yếu tố then chốt rong cơ chế sinh bệnh của ung thư tế bào gan hay không. Sự hiện diện của pRB tăng họat tính phosphoryl ở những trường hợp HCC biệt hóa cao, đề nghị rằng khi có sự bất họat con đường dẫn truyền này sẽ làm tăng quá trình sinh ung. Sự biểu hiện cao của pRB dạng tăng phosphoryl hóa ở các tế bào ung thư chứng tỏ các tế bào này đã trải qua giai đọan G1 và S của chu trình tế bào51-54. Trong khi đó sự biểu hiện cao của pRB dạng ít phosphoryl hóa ở các tế bào mô lành kế cận khối u, chứng tỏ các tế bào này đã ra khỏi chu trình tế bào và vào giai đọan yên lặng hoặc ở mức độ biệt hóa cuối cùng. Sự biểu hiện dạng nốt của pRB quan sát ở các khối u có thể gợi ý vai trò của việc dẫn truyền tín hiệu nội tiết hoặc cận tiết. Sự bất họat lan rộng của pRB ở các trường hợp HCC biệt hóa cao có thể do tăng tiết các yếu tố IGF-II12, TGF-α55, HGF và c-met56, ErbB-257 và giảm tiết IGFBP-3 12. Tóm lại nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự gia tăng biểu hiện của các yếu tố E2F-1, Cyclin D1, Cyclin A, Cdk-2 và Cdk-4 và dạng phosphoryl của pRB trong khối u ung thư tế bào gan. Việc điều trị tế bào ung thư gan với chất ức chế MEK1/2 làm sự ức chế biểu hiện của Cyclin D1 và Cdk-2 và làm giảm phosphoryl hóa pRB. Những kết quả trên cho thấy có thể có mối liên hệ giữa sự họat hóa MEK-ERK, sự tăng biểu hiện Cyclin D1 và tăng phosphoryl hóa pRB trong ung thư tế bào gan. Do đó, việc ức chế con đường dẫn truyền tín hiệu Ras/Raf-ERK có thể là một cách để kiềm hãm sự phát triển ung thư tế bào gan. CÁC TỪ VIẾT TẮT: HCC: Hepatocellular carcinoma, pRB: Retinoblastoma p105, ERK: Extracellular signal-regulated kinase, MAPK: Mitogen-activated protein kinase, MEK:MAPK/Erk kinase, TGF-α:Transforming growth factor-α, IGF-II: Insulin-like growth Factor II, IGFBP-3: Insulin-like growth factor binding protein 3 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Schafer, D. F. et al. Lancet, 353: 1253-1257, 1999. 2. Ince, N. et al. N. Engl. J Med, 340: 798-799, 1999. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 95 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 3. Okuda, K et al Cancer, 56: 918-928, 1985. 29. Ballif, B. A. et al. Cell Growth Differ., 12: 397-408, 2001. 4. Colombo, M. et al. J Hepatol., 15: 225-236, 1992. 30. Krueger, J. S. et al. Oncogene, 20: 4209-4218, 2001. 5. Huguet, C. S. F et al. Surgery of the Liver and Billary Tract., pp. 1365-1369. London: Churchill Livingstone, 2000. 31. Mansour, S. J. et al. Science, 265: 966-970, 1994. 32. Montesano, R. et al. Cell Growth Differ., 10: 317-332, 1999. 6. Lai, E. et al. Surgery of the Liver and the biliary tract, pp. 1349-1363. London: Churchill Livingstone, 1994. 33. Vaux, D. L. et al. Nature, 335: 440-442, 1988. 34. Dyson, N. et al. Genes Dev., 12: 2245-2262, 1998. 7. Chan, E. S et al. Cochrane. Database. Syst. Rev., CD001199, 2000. 35. Nevins, J. R. et al. Cell Growth Differ., 9: 585-593, 1998. 8. Zeng, J. Z et al. Oncogene, 21: 4932-4943, 2002. 36. Santoni-Rugiu, E. et al. Cancer Res., 58: 123-134, 1998. 9. Murakami, Y et al. Cancer Res., 51: 5520-5525, 1991. 10. Lee, A. V. et al. Biomed. Pharmacother., 49: 415-421, 1995. 37. Deane, N. G. et al. Cancer Res., 61: 5389-5395, 2001. 38. Masaki, T. et al. Hepatology, 37: 534-543, 2003. 11. Hui, A. M. et al. Int. J. Cancer, 84: 604-608, 1999. 39. Azechi, H. et al. Oncol., 60: 346-354, 2001. 12. Huynh, H. et al. Cell Growth Differ., 13: 115-122, 2002. 40. Peng, S. Y. et al. J. Hepatol., 29: 281-289, 1998. 41. Roncalli, M. et al. Hepatology, 36: 427-432, 2002. 13. Herwig, S. et al. 246: 581-601, 1997. 42. Ito, Y. et al. Hepatology, 30: 90-99, 1999. 14. Xu, H. J et al. Proc Natl Acad Sci U. S. A, 91: 9837- 9841, 1994. 43. Albrecht, J. H. et al. Cell Growth Differ., 10: 397-404, 1999. 15. Yen, A. et al. Exp. Cell Res, 241: 324-331, 1998. 44. Nishida, N. et al. Cancer Res, 54: 3107-3110, 1994. 16. Xu, H. J et al. Cancer Res, 56: 2245-2249, 1996. 45. Nishida, N. et al. Histol. Histopathol., 12: 1019-1025, 1997. 17. Xu, H. J. et al. Oncogene, 15: 2589-2596, 1997. 18. Taya, Y. Trends Biochem. Sci., 22: 14-17, 1997. 46. Tetsu, O. et al. Nature, 398: 422-426, 1999. 19. Keck, P. J. et al. Science, 246: 1309-1312, 1989. 47. Morin, P. J. et al. Bioessays, 21: 1021-1030, 1999. 20. Kitagawa, M. et al. EMBO J, 15: 7060-7069, 1996. 48. Ito, Y. et al. Hepatology, 27: 951-958, 1998. 21. Grafstrom, R. H. et al. Carcinogenesis, 20: 193-198, 1999. 49. Lavoie, J. N. et al. J Biol Chem., 271: 20608-20616, 1996. 22. Pan, W. et al. Carcinogenesis, 19: 765-769, 1998. 50. Favata, M. F. et al. J. Biol. Chem., 273: 18623-18632, 1998. 23. Xiao, Z. X et al. Nature, 375: 694-698, 1995. 24. Lukas, J. et al. Genes Dev., 11: 1479-1492, 1997. 51. Chen, P. L. et al. Cell, 58: 1193-1198, 1989. 25. Knudsen, E. S. et al. Mol. Cell Biol., 17: 5771-5783, 1997. 52. DeCaprio, J. A. et al. Cell, 58: 1085-1095, 1989. 53. Buchkovich, K. et al. Cell, 58: 1097-1105, 1989. 26. Adams, P. D. et al. Biophys. Acta, 1471: M123-M133, 2001. 54. Mihara, K. et al. Science, 246: 1300-1303, 1989. 55. Chung, Y. H. et al. Cancer, 89: 977-982, 2000. 27. Hoshino, R. et al. Oncogene, 18: 813-822, 1999. 56. Ueki, T. et al. Hepatology, 25: 862-866, 1997. 28. Amundadottir, L. T. et al. Oncogene, 16: 737-746, 1998. 57. Endo, K. et al. Liver, 20: 209-215, 2000. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 96